專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及四角蛤蜊，具體涉及四角蛤蜊蛋白質(zhì)水解得到的具有抗氧化活性的多 肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
四角蛤蜊，又叫方形馬珂蛤、白蛤或四角蛤，俗稱(chēng)白蜆子、泥蜆子、布鴿頭，屬于軟 體動(dòng)物門(mén)，瓣鰓綱，真瓣鰓目，蛤蜊科。貝殼略呈四角形，兩殼相等，側(cè)膨脹，殼面光滑呈白 色。斧足發(fā)達(dá)，無(wú)足絲，生活于淺海泥沙中，是一種常見(jiàn)的海生貝類(lèi)軟體動(dòng)物，廣泛分布于 我國(guó)南北沿海海域。江蘇沿海多灘涂，四角蛤蜊為優(yōu)勢(shì)貝類(lèi)，已實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模人工養(yǎng)殖，產(chǎn) 量高達(dá)80000噸/年。四角蛤蜊是一種重要的食用經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，其軟體肉嫩鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富， 內(nèi)含蛋白質(zhì)，脂肪，碳水化合物，鈣、鐵、磷及多種維生素。四角蛤蜊不僅可以食用，還具有藥 用、保健價(jià)值。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為蛤蜊味咸、性寒、無(wú)毒，歸胃、肝、膀胱經(jīng)，有多種的主治功 能。關(guān)于四角蛤蜊的研究主要集中于食品加工、增養(yǎng)殖、種屬界定等方面。國(guó)內(nèi)外針對(duì)四角 蛤蜊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用多見(jiàn)以軟體為原料加工罐頭、調(diào)味品、飼料添加劑等，而以藥效功能為目標(biāo) 的四角蛤蜊的醫(yī)藥、保健品研究開(kāi)發(fā)較少。四角蛤蜊活性物質(zhì)研究多集中在小分子化學(xué)成 分(如?；撬岷虴PA)，對(duì)其生物活性大分子物質(zhì)，諸如蛋白質(zhì)和多糖的研究報(bào)道較少。生物體內(nèi)正常有氧代謝過(guò)程中會(huì)形成許多活性氧物質(zhì)，包括超氧陰離子自由基、 羥基自由基、脂氧自由基、過(guò)氧化氫等；另外，生物體也可經(jīng)過(guò)傳染、離子輻射、空氣污染等 外源性侵入而產(chǎn)生活性氧。體內(nèi)活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。但 過(guò)多的活性氧自由基就會(huì)有破壞行為，具有未成對(duì)電子的自由基可以引發(fā)細(xì)胞膜上的不飽 和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)并與膜上的酵素結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性被破壞，改變結(jié)構(gòu)以 及通透性；另外，自由基同樣可以和細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)正 常功能無(wú)法進(jìn)行，并且自由基還會(huì)攻擊DNA分子，造成基因突變。大量研究已經(jīng)證明，老化 以及老化相關(guān)的疾病如癌癥、心血管、自身免疫性疾病以及關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生機(jī)理與體內(nèi)自 由基產(chǎn)生過(guò)多或清除自由基能力下降有著密切的關(guān)系。因此充分利用四角蛤蜊資源，將作 為主要成分的四角蛤蜊蛋白質(zhì)，利用酶解工藝對(duì)其進(jìn)行加工，然后制成具有抗氧化功能活 性且易于人體吸收的蛋白多肽具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗氧化 功能好，人體易吸收的四角蛤蜊蛋白多肽，本發(fā)明另一個(gè)目的是提供該四角蛤蜊蛋白多肽 的制備方法和其應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為一種具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽，它是通過(guò)以下方法制備得到的首先 取四角蛤蜊軟體洗凈攪碎勻漿，加入相當(dāng)勻漿液重量0. 05% 0.5%的胰蛋白酶，在pH7. 5
3至8. 5，溫度45 55°C條件下酶解反應(yīng)30至90分鐘，然后在90 100°C水浴滅活酶10分 鐘，離心，取上清液進(jìn)行超濾，截留分子量為10 50kDa的超濾液，減壓濃縮，噴霧干燥得四 角蛤蜊蛋白多肽。本發(fā)明提供的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，具體包括以下步 驟首先取四角蛤蜊軟體洗凈，攪碎勻漿，得勻漿液，加入相當(dāng)勻漿液重量0.05% 0. 5%的胰蛋白酶，在pH7. 5至8. 5，溫度45 55°C條件下酶解反應(yīng)30至90分鐘，然后在 90 100°C水浴滅酶10分鐘，離心，取上清液進(jìn)行超濾，截留分子量為10 50kDa的超濾 液，超濾液減壓濃縮即得四角蛤蜊蛋白多肽。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，所 述的胰蛋白酶的加入量為四角蛤蜊勻漿液重量的0. 25% 0. 5%。作為其它優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方 法，其中酶解反應(yīng)的PH值為8.5。作為其它優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方 法，其中酶解反應(yīng)的溫度為45度，酶解反應(yīng)的時(shí)間為70 90分鐘。作為優(yōu)選方案，所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，其中酶 解液離心所得上清液進(jìn)行超濾，截留得到分子量為10 30kDa的超濾液，即得四角蛤蜊蛋 白多肽。為充分研究四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，本發(fā)明經(jīng)過(guò)以下實(shí)驗(yàn)篩選一、蛋白水解酶的篩選實(shí)驗(yàn)1.1實(shí)驗(yàn)材料四角蛤蜊采集于南通茅家港(江蘇省海洋與水產(chǎn)研究所提供)。1.2主要試劑供篩選的酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有 限公司；中性蛋白酶南京奧多福尼生物科技有限公司；Pierce BCA蛋白定量試劑盒美國(guó) Thermo公司；二苯代苦味酰胼(DPPH) =Alfa公司；1.3主要儀器與設(shè)備BP 211D電子天平德國(guó)Sartorious公司；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó) BUCHI公司；Spectra Max 190酶標(biāo)儀美國(guó)AD公司；中空纖維膜(截留分子量10，20， 50kDa)天津愛(ài)生膜過(guò)濾技術(shù)有限公司JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)江蘇省金壇市榮光儀器 制造公司；Avanti J-25高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Backman公司；DW-I增力無(wú)極恒速攪拌器 南京科爾儀器設(shè)備有限公司。2.方法2. 1四角蛤蜊酶解液制備四角蛤蜊軟體洗凈攪碎勻漿，加入3倍重量的水配成混懸液，再分別加入酶活力 單位為500IU的4種水解酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶)，加酶量為勻 漿液重量的0. 2%，在各自標(biāo)注最佳條件(胰蛋白酶50°C，pH = 8. 0 ；木瓜蛋白酶55°C，pH =5. 5 ；中性蛋白酶50°C，pH = 7. 0 ；胃蛋白酶37°C，pH = 2. 0)下進(jìn)行2小時(shí)酶解反應(yīng)。 酶解結(jié)束后在90°C水浴滅活酶10分鐘，4000rpm離心15分鐘，取上清液進(jìn)行超濾(截留分
4子量50kDa)，超濾液低溫減壓濃縮至原勻漿液體積，得四種不同的四角蛤蜊酶解液。2. 2還原能力的測(cè)定采用普魯士藍(lán)反應(yīng)法測(cè)定不同四角蛤蜊酶解液的還原能力。比色管中分別加入受 試樣品、溶劑對(duì)照2. 5ml，另加入磷酸鹽緩沖液(0. 2mol/L,pH = 7)及10mg/ml鐵氰化鉀各 2. 5mL,混勻后于50°C水浴20分鐘，然后加入100mg/ml三氯乙酸2. 5ml，混勻后3000rpm離 心10分鐘。準(zhǔn)確移取上清液2. 5ml，加入蒸餾水2. Oml以及l(fā)mg/ml三氯化鐵0. 5ml，混勻 后于700nm處測(cè)定吸光度值，吸光度值(OD值)越大表明還原力越強(qiáng)。2. 3羥自由基清除能力測(cè)定采用不同酶解液對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基清除率的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。 取0. 2ml的FeSO4-EDTA混合液(10. Ommol/L)于試管中，加人0. 5ml的2-脫氧核糖溶 液(10. Ommol/L)和0. 6ml四角蛤蜊酶解液，用磷酸緩沖液(pH = 7. 4,0. lmol/L)定容至 1. 8mL，再加人0. 2mLH202(10. 0mol/L)，混勻后置于37°C恒溫水浴中反應(yīng)lh。然后加入2. 8% (w/w)三氯乙酸(TCA)溶液1. OmL,在4000rpm下離心20分鐘，取上清液2. Oml于另一支試 管中，加入1. 0% (w/w)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1. 0ml，混勻后置沸水浴反應(yīng)15分鐘，冷卻 后稀釋5倍，在532nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值。酶解液對(duì)羥自由基的清除效果用清除率(SA/%) 表示，按下式計(jì)算清除率SA(%) = [(Ac-As)/(Ac-AO)] X 100%式中Ac為不加清除劑的吸光度，As為加入四角蛤蜊酶解液后的吸光度，A0為試 劑空白的吸光度。2. 4DPPH自由基清除能力測(cè)定取四角蛤蜊酶解液Iml分別加入到干凈的IOml具塞試管中，再加入0. 6mmol/L DPPH甲醇溶液0. 5ml，然后以甲醇補(bǔ)充體積至5ml，30分鐘室溫避光反應(yīng)后于517nm處測(cè)定 吸光值A(chǔ)，空白組以等體積甲醇溶液代替DPPH溶液，對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液， 并以等體積蒸餾水和甲醇混合液空白調(diào)零。按下式計(jì)算清除率SA(%) = [I-(Ai-Aj)/A0] X 100%式中:A0為對(duì)照組吸光度，Ai為樣品組吸光度，Aj為空白組吸光度。2. 5超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定。量取50mmol/L，pH 8. 20Tris-HCl緩沖液 4. 7ml，加入0. Iml四角蛤蜊酶解液，置于25°C水浴保溫20分鐘，然后加入25°C預(yù)溫的 3mmol/L的鄰苯三酚溶液(用lOmmol/LHCl配制)0. 2ml，迅速搖勻后倒入比色皿中，在 319nm下每隔1分鐘測(cè)定吸光值一次，共反應(yīng)9分鐘，用lOmmol/L HCl溶液為空白調(diào)零，對(duì) 照組以等體積去離子水代替樣品。作吸光度隨時(shí)間變化曲線的回歸方程，其斜率為鄰苯三 酚的自氧化速率V，按下式計(jì)算樣品對(duì)0_2的清除率。清除率SA(% ) = [I-V1A0] X 100%式中…為樣品組的吸光度隨時(shí)間的變化率，V0為空白對(duì)照組組吸光度隨時(shí)間的
變化率。3.結(jié)果與討論3. 1酶的篩選具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示表14種蛋白酶酶解液的抗氧化能力(濃度5mg/mlJ±SE，η = 3)
權(quán)利要求
一種具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽，其特征在于，它是通過(guò)以下方法制備得到的首先取四角蛤蜊軟體洗凈攪碎勻漿，加入相當(dāng)勻漿液重量0.05％～0.5％的胰蛋白酶，在pH7.5～8.5，溫度45～55℃條件下酶解30～90分鐘，然后在90～100℃下酶滅活10分鐘，離心，取上清液進(jìn)行超濾，截留分子量為10～50kDa的超濾液，減壓濃縮，噴霧干燥即得。
2.權(quán)利要求1所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，其特征在于， 包括以下步驟取四角蛤蜊軟體洗凈，攪碎勻漿，得勻漿液，加入相當(dāng)勻漿液重量0. 05% 0. 5%的胰 蛋白酶，在PH7. 5至8. 5，溫度45 55°C條件下酶解反應(yīng)30至90分鐘，酶解結(jié)束后在90 100°C水浴滅酶10分鐘，離心，取上清液進(jìn)行超濾，截留分子量為10 50kDa的超濾液，減 壓濃縮，噴霧干燥后即得四角蛤蜊蛋白多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，其特征在 于，所述的胰蛋白酶的加入量為四角蛤蜊勻漿液重量的0. 25% 0. 5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，其特征在 于，酶解反應(yīng)的PH值為8.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，其特征在 于，酶解反應(yīng)的溫度為45度，酶解反應(yīng)的時(shí)間為70 90分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，其特征在 于，酶解液離心所得上清液進(jìn)行超濾，截留得到分子量為10 30kDa的超濾液。
7.權(quán)利要求1所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽在制備抗氧化抗衰老藥物 中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽在制備抗氧化抗衰老保健 品或食品添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽及其制備方法和應(yīng)用，四角蛤蜊蛋白多肽是通過(guò)以下方法制備得到的取四角蛤蜊軟體洗凈攪碎勻漿，加入為勻漿液重量0.05％～0.5％的胰蛋白酶，在pH7.5～8.5，溫度45～55℃條件下酶解30至90分鐘，然后在90～100℃水浴滅活酶10分鐘，離心，取上清液進(jìn)行超濾，截留分子量為10～50kDa的超濾液，減壓濃縮，噴霧干燥即得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的四角蛤蜊蛋白多肽具有很好的抗氧化活性，多肽分子量小，人體服用后更易于吸收；本發(fā)明提供的四角蛤蜊蛋白多肽的制備方法，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，工藝參數(shù)設(shè)計(jì)合理，可操作性強(qiáng)，能夠充分利用四角蛤蜊的豐富資源，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K38/01GK101979652SQ201010505519
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者吳皓, 王令充, 鄭文文 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)