一種利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備抗氧化肽的方法，具體涉及一種利用超高壓處理米渣蛋白制 備高抗氧化活性肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻谷是世界上最重要的糧食之一，中國是有名的產(chǎn)糧大國，糧食產(chǎn)量中85%以上 是稻谷，僅湖南省糧食的商業(yè)庫存每年在430~660萬噸之間。一部分糧食需要用于淀粉 糖工業(yè)生產(chǎn)，但會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物米渣，而米渣中蛋白質(zhì)含量高達40~70%。大米蛋白的 品質(zhì)是公認的谷類蛋白中的上佳者，大米蛋白的營養(yǎng)價值高于小麥蛋白質(zhì)，大米蛋白中的 第一限制性氨基酸一一賴氨酸的含量高于其它谷類，且氨基酸含量較為合理，與其它谷類 蛋白相比，生物價和蛋白質(zhì)效用比率更高。另外，大米蛋白的低過敏性使之非常適合作為嬰 兒或是特殊人群的食品。因此，研究稻米深加工副產(chǎn)物一一米渣蛋白的再加工技術(shù)具有重 要意義。
[0003] CN101748182B公開了一種米蛋白抗氧化肽的制備方法，其技術(shù)方案是將米渣過 篩后用水浸泡，然后使用膠體磨將其磨碎再進行酶解，最終制備米蛋白抗氧化活性肽，但 是，使用膠體磨會產(chǎn)生很多泡沫，影響實驗準(zhǔn)確性，并且堿性蛋白酶水解程度效果不佳。CN 103468777 B公開了一種發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其包括糙米渾濁液制備、中性蛋白 酶水解、滅酶、離心分離、真空濃縮、冷凍干燥等步驟，但是，其在糙米渾濁液制備的過程中， 僅僅使用高速組織搗碎機進行搗碎，這樣的操作只是把發(fā)芽糙米打碎，并沒有破壞其結(jié)構(gòu)， 所以酶解的時候效率較差。
[0004] 超尚壓技術(shù)是目如國際上最熱門的食品加工技術(shù)之一，超尚壓處理在食品蛋白加 工中可通過改變蛋白的結(jié)構(gòu)，改變蛋白質(zhì)的溶解性、凝膠性、乳化性、起泡性等諸多加工特 性；還可以通過改變蛋白質(zhì)的酶解特性以產(chǎn)生多種活性肽；并且超高壓處理傳壓速度比較 快、均勻，不存在梯度壓力，另外，超高壓技術(shù)相對耗能比較少。CN103540637A公開了 一種高 壓處理和酶解制備高純度大米蛋白肽的方法，其技術(shù)方案是米渣預(yù)處理、高壓均質(zhì)、超聲、 酶解、脫色、分離、干燥，但是，其使用的最高壓力為80MPa，研究表明，這樣的壓力并不能完 全破環(huán)蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)，不能讓蛋白質(zhì)更好的酶解。CN103283934A公開了一種高純度大米 蛋白的制備方法，其米渣蛋白提取方案是酶法提取，然后再進行高壓處理，但是，酶法提取 會產(chǎn)生較多的雜質(zhì)，這樣制得的產(chǎn)品，雜質(zhì)含量較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種能提高 米渣蛋白的酶解效率和抗氧化活性，所得高抗氧化活性肽清除自由基效果好，且處理過程 不破壞營養(yǎng)成分，產(chǎn)品純度高，操作簡單的利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽 的方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：一種利用超高壓處理米渣蛋白制 備高抗氧化活性肽的方法，包括以下步驟： (1) 米渣預(yù)處理：將米渣磨碎，過60~100目篩，得米渣粉； (2) 提取米渣蛋白：將步驟（1)所得米渣粉與水以質(zhì)量比1:6~10混合，調(diào)節(jié)混合液 pH值至11~13,恒溫攪拌反應(yīng)3~5h，然后離心，收集上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值至5. 0~ 5. 8,靜置沉淀，離心，棄去上清液，采用去離子水洗滌沉淀至中性，沉淀即為米渣蛋白； (3) 超高壓處理：將步驟（2)所得米渣蛋白在300~500MPa (優(yōu)選350~450MPa，進一 步優(yōu)選400 MPa)壓力下，處理5~15min (優(yōu)選8~12min)，冷凍干燥，得超高壓米渣蛋白 粉； (4) 酶解：將步驟（3)所得超高壓米渣蛋白粉配制成3~5wt%的水溶液，加入4000~ 8000U中性蛋白酶/g超高壓米渣蛋白粉，酶解2~3h，滅酶，離心收集上清液； (5) 真空濃縮：將步驟（4)所得上清液真空濃縮至固形物質(zhì)量分數(shù)為50~70wt%的濃 縮液； (6) 冷凍干燥：將步驟（5)所得濃縮液進行冷凍干燥，即得高抗氧化活性肽。
[0007] 步驟（2)中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合液pH值至11~13,用鹽酸調(diào)節(jié)混合液pH值至 5. 0~5. 8,堿液和酸液的濃度均為I. 0mol/L〇
[0008] 步驟（2)中，由于米渣蛋白中80%為堿溶性蛋白質(zhì)，所以需要先讓蛋白質(zhì)溶于堿 液，再加酸調(diào)節(jié)PH值使蛋白質(zhì)沉淀，pH值不宜過高，否則會破環(huán)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，酸性條件下蛋 白質(zhì)凝聚從而沉淀，在等電點的時候沉淀達到最大值，所以依據(jù)米渣蛋白的等電點確定最 佳酸沉pH值。
[0009] 進一步，步驟（2)中，所述攪拌反應(yīng)的溫度為30~50°C，攪拌反應(yīng)的轉(zhuǎn)速為500~ 900r/min。
[0010] 進一步，步驟（2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為3000~5000r/min，離心的時間為10~ 20min〇
[0011] 進一步，步驟（2)中，所述靜置沉淀的時間為1~3h。
[0012] 步驟（3)中，所述超高壓處理的溫度為室溫，本發(fā)明超高壓設(shè)備的升壓和降壓過程 均可在Imin內(nèi)完成。超高壓處理對蛋白質(zhì)的改性作用主要體現(xiàn)在以下兩個方面：（1)對蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響：超高壓處理主要是破壞蛋白質(zhì)的三級、四級結(jié)構(gòu)的非共價鍵，而對共價鍵 作用較小，不同超高壓力處理對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響不同，一般在100~200MPa下，蛋白質(zhì)變 化是可逆的，但當(dāng)壓力超過300MPa時，蛋白質(zhì)會發(fā)生氫鍵斷裂，產(chǎn)生不可逆變性而改變蛋 白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，另外，因為超高壓只能破壞蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu)，而肽是小分子，超高壓 對它的作用很小，所以，本發(fā)明是先對米渣蛋白進行超高壓再酶解，而不是對酶解后的肽進 行超高壓，如果是先酶解再超高壓，就都達不到提高抗氧化力的效果；（2)對蛋白質(zhì)酶解的 影響：超高壓處理能影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，從而也影響到酶對蛋白質(zhì)的催化特性，超高 壓處理對蛋白的影響主要是在于蛋白三級、四級結(jié)構(gòu)的非共價鍵，蛋白經(jīng)超高壓處理后結(jié) 構(gòu)伸展而變得松散，從而暴露出更多位點，易于酶解反應(yīng)進行，提高酶解效率。所以，本發(fā)明 方法采用先將米渣蛋白進行超高壓處理，再進行酶解反應(yīng)。
[0013] 步驟（4)中，由于底物濃度過高會抑制酶的活性，所以酶解時，選擇超高壓米渣蛋 白粉的水溶液濃度為3~5wt%。
[0014] 進一步，步驟（4)中，所述中性蛋白酶的酶活為40000~60000U/g。因不同蛋白酶 的底物特異性及作用位點的差異，不同蛋白酶作用于大米蛋白的水解程度不同，而且不同 蛋白酶水解得到的酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)也將有所不同，中性蛋白酶具有作用條件溫和，作 用于大米蛋白水解度高，酶解產(chǎn)物抗氧化活性高的優(yōu)點。因此，最終確定中性蛋白酶為酶解 米渣蛋白的合適酶源。
[0015] 進一步，步驟（4)中，所述酶解的pH值為7,溫度為40~50°C。
[0016] 進一步，步驟（4)中，所述滅酶的溫度為75~95°C，時間為8~15min。
[0017] 進一步，步驟（4)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為4000~6000r/min，離心的時間為10~ 20min〇
[0018] 進一步，步驟（5)中，所述真空濃縮的真空度為0· 08~0· lOMPa，溫度為45~ 50 cC 〇
[0019] 進一步，步驟（3)、（6)中，所述冷凍干燥是指在真空度10~30MPa，溫 度-20~-40 °C下，冷凍干燥24~48h至水分含量為5~10%。
[0020] 本發(fā)明方法利用超高壓技術(shù)處理所得米渣蛋白，與未經(jīng)超高壓處理的進行對比， 其DPPH自由基清除率由20~45%提升到50~60%，ABTS自由基清除率由50~60%提升 到80~95%，羥基自由基清除率由3~7%提升到4~12%，說明超高壓所得的米渣蛋白酶解 液的抗氧化活性遠大于未經(jīng)高壓處理的；而超聲處理所得米渣蛋白，其DPPH自由基、ABTS 自由基和羥基自由基清除率分別為30~50%，60~75%，3~8%，說明超高壓所得的米渣蛋 白酶解液的抗氧化活性相對于經(jīng)過超聲處理的具有明顯的提高；另外，本發(fā)明方法不會破 壞米渣的營養(yǎng)成分，所得高抗氧化活性肽產(chǎn)品呈乳白色，不含糖分等雜質(zhì)。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0022] 本發(fā)明實施例所使用的中性蛋白酶，酶活50000U/g，生產(chǎn)廠家為鴻鷹祥生物工程 股份有限公司；其它所使用的化學(xué)試劑，如無特殊說明，均通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得。
[0023] 實施例1 (1) 米渣預(yù)處理：將500g米渣磨碎，過80目篩，得米渣粉； (2) 提取米渣蛋白：將步驟（1)所得米渣粉與4L水混合，用1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)混合液pH值至12,在溫度40°C，轉(zhuǎn)速700r/min下，恒溫攪拌反應(yīng)4h，然后4000r/min 離心15min，收集上清液，用1.0 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至5. 4,靜置沉淀2h， 4000r/min離心15min，棄去上清液，采用去離子水洗滌沉淀至中性，沉淀即為米渣蛋白； (3) 超高壓處理：將步驟（2)所得米渣蛋白用雙層聚氯乙烯袋包裝，密封，在400MPa壓 力下，處理l〇min，在真空度20MPa，溫度-30°C下，冷凍干燥36h至粉末狀，得超高壓米渣蛋 白粉，干燥后產(chǎn)品水分含量為8% ; (4) 酶解：將步驟（3)所得超高壓米渣蛋白粉配制成4wt%的水溶液，加入6000U中性蛋 白酶/g超高壓米渣蛋白粉，在pH值為7,溫度45°C下，酶解2. 5h，85°C滅酶10min，5000r/ min離心15min，收集上清液； (5) 真空濃縮：將步驟（4)所得上清液在真空度0. 09MPa，溫度47°C下，進行真空濃縮， 至固形物質(zhì)量分數(shù)為60wt%的濃縮液； (6) 冷凍干燥：將步驟（5)所得濃縮液在真空度20MPa，溫度-30°C下，冷凍干燥36h至 粉末狀，即得高抗氧化活性肽，干燥后產(chǎn)品水分含量為8%。
[0024] 所得高抗氧化活性肽呈乳白色，表明不含糖分等雜質(zhì)。
[0025] 實施例2 (1) 米渣預(yù)處理：將500g米渣磨碎，過60目篩，得米渣粉； (2) 提取米渣蛋白：將步驟（1)所得米渣粉與3L水混合，用1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)混合液pH值至11，在溫度30°C，轉(zhuǎn)速500r/min下，恒溫攪拌反應(yīng)3h，然后3000r/min 離心10min，收集上清液，用1.0 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至5. 0,靜置沉淀lh， 3000r/min離心10min，棄去上清液，采用去離子水洗滌沉淀至中性，沉淀即為米渣蛋白； (3) 超高壓處理：將步驟（2)所得米渣蛋白用雙層聚氯乙烯袋包裝，密封，在300MPa壓