專利名稱：一種靶向golph3基因干擾小分子rna及其抗膠質瘤遷移的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種靶向G0LPH3基因干擾小分子RNA、其制備方法及應用。
背景技術：
RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指由雙鏈RNA介導的細胞內與其序列同源的mRNA發(fā)生特異性降解，從而導致基因表達沉默的現象，這是一種轉錄后水平的基因沉默機制。本發(fā)明的目的之一在于提供一種靶向G0LPH3基因干擾小分子RNA。本發(fā)明的目的之二在于提供該干擾小分子RNA的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該干擾小分子RNA的應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案
一種用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA，其特征在于該基因為SEQ NO. 1所示的堿基序列。—種制備上述的用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA的方法，其特征在于該方法的具體步驟為根據MAGic載體設計的具體要求，設計對應于G0LPH3基因757-775位，即 GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為57bp，送華大基因研究中心進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為
SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3'
Anti-sense:5，-MT TCA AAA AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3，；
根據MAGic載體設計的具體要求，將設計的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic質粒進行連接，得到用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA。一種上述的用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA在制備抗膠質瘤遷移的分泌藥物中的應用。本發(fā)明設計對抗膠質瘤遷移有關聯(lián)的基因的RNAi，并應用膠質瘤細胞模型研究其對抗膠質瘤增殖并促其凋亡的促進作用，為RNAi在膠質瘤的治療應用提供了一種新方法。


圖1為shRNA的寡核苷酸序列引物和P-k質粒的連接圖。 圖2 (A)為正常U251細胞的遷移。 圖2 (B)轉染過G0LPH3-RNAi細胞的遷移。
具體實施例方式
一、膠質瘤細胞的培養(yǎng)膠質瘤細胞U251細胞系培養(yǎng)于37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)箱。對數生長期的細胞用胰酶消化脫壁，之后加入適量培養(yǎng)液并反復吹打以混勻細胞；將得到的細胞懸液移入15ml離心管中，1500rpm離心3min ；去上清；用5ml無菌1 XPBS將細胞懸起，吹打混勻；加約Iml細胞懸液于裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約2天左右傳代1次(主要查看細胞有無鋪滿培養(yǎng)瓶)。二、人腦膠質瘤細胞的分離取人腦膠質瘤手術標本，浸入4°C的KRBB溶液中. 清洗二次，然后將標本剪成小塊，轉移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，于恒溫搖床中 37 °C保溫，搖床轉速lOOr/min，每IOmin玻璃管反復吹打一次，放置30min。將該懸液離心500-1000rpm，5min，最后剩下為膠質瘤細胞.用細胞培養(yǎng)液懸起沉淀，在黑背景的顯微鏡下觀察可發(fā)現到呈圓形的膠質瘤細胞。三、G0LPH3_RNAi質粒的設計和轉染根據RNAi載體設計的具體要求，設計對應于 G0LPH3基因757-775位，即GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為 57bp，送華大基因研究中心進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為
SMADl-RNAi對應的序列為 SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3'
Anti-sense:5，-AAT TCA AM AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3，；
根據MAGic中載體設計的具體要求，將設計的G0LPH3 -RNAi的干擾片段和MAGic質粒連接，參見圖1，然后轉染進膠質瘤細胞。G0LPH3-RNAi質粒的轉染轉染前一天，在含有5ml無抗生素的DMEM生長培養(yǎng)基的60-mm培養(yǎng)皿里種上2 X IO6個膠質瘤細胞。鋪板后第二天準備轉染首先用500 μ 1 無血清的培養(yǎng)基(DMEM)溶解8. 0 μ g的SMADl-RNAi表達載體，用500 μ 1培養(yǎng)基(DMEM或 RPMI1640)溶解Lipof ectamine 2000 (20 μ 1)，輕輕地混勻，室溫孵育5分鐘。孵育后，為促使shRNA表達載體與LipOfectamineTM2000充分結合，將它們輕輕混勻，室溫孵育20分鐘， 以形成 DNA-Lipofectamine 2000 的復合物。將 DNA-Lipofectamine 2000 復合物加入到 60mm培養(yǎng)皿，之后將含有DNA-Lipof ectamine 2000復合物的細胞培養(yǎng)皿放入37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)6小時，換上正常細胞培養(yǎng)液。四、實驗分組與檢測指標正常對照組膠質瘤細胞，培養(yǎng)液為膠質瘤細胞培養(yǎng)液；RNAi組轉染過G0LPH3-RNAi的膠質瘤細胞，培養(yǎng)液為膠質瘤細胞培養(yǎng)液。膠質瘤細胞遷移的檢測
將貼壁細胞培養(yǎng)皿的定點拍照部位做好標記，用ΙΟΟΟμΙ tip在底部輕輕劃線(垂直 90度，用力均勻)，確保劃線處無細胞。劃線兩側間距為average gaps (AGs)。連續(xù)兩天倒置顯微鏡下100X下拍照，記錄各組細胞的AGs，即細胞的遷移情況。如圖2(A)和圖2(B)。圖2 (A)正常U251細胞的遷移。實驗結果表明，膠質瘤細胞U251的遷移的細胞數量和AVGs均呈時間依賴性。圖2 (B)轉染過G0LPH3-RNAi的U251細胞的遷移。實驗結果表明，膠質瘤細胞 U251的遷移隨時間的延長和對照相比細胞遷移的數量和細胞遷移的AVGs均有所下降。圖中標尺的長度為500um。五、結果轉染過G0LPH3_RNAi干擾質粒的膠質瘤的細胞遷移數量減少，細胞的
4AVGs減少。該實驗結果表明，通過RNAi技術下調膠質瘤中的G0LPH3表達抑制了膠質瘤的遷移。
權利要求
1.一種靶向G0LPH3基因干擾小分子RNA及其抗膠質瘤遷移的用途，其特征在于該基因為SEQ NO. 1所示的堿基序列。
2.一種制備根據權利要求1所述的用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA的方法，其特征在于該方法的具體步驟為根據MAGic載體設計的具體要求，設計對應于G0LPH3基因 757-775位，S卩GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為57bp，送華大基因研究中心進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列序列為SEQ NO. 1 Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3'Anti-sense:5，-AAT TCA AAA AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3，；依據pMAGic載體設計的要求，將設計的shRNA序列和MAGic質粒進行連接，得到用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA。
3.根據權利要求1所述的用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA及其在制取抗膠質瘤遷移藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向GOLPH3基因干擾小分子RNA、其制備方法及應用。該干擾小分子RNA為SEQNO.1所示的堿基序列。本發(fā)明設計對抑制膠質瘤遷移有作用的基因的干擾小分子RNA，應用膠質瘤細胞模型研究其對膠質瘤遷移的抑制作用，為膠質瘤的基因治療提供了一種新方法。
文檔編號A61P35/04GK102465125SQ201010531309
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權日2010年11月4日
發(fā)明者葉思靈, 夏清梅, 殷姍, 潘謳東, 陳國澤 申請人:上海生博醫(yī)學生物技術有限公司