一種蘇禽黃雞胚胎干細(xì)胞特定基因進(jìn)行靶向敲除方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞工程領(lǐng)域，尤其涉及一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)蘇禽黃雞胚胎干細(xì)胞特定基因進(jìn)行革G向敲除的方法。
技術(shù)背景:
[0002]目前基因組編輯技術(shù)主要有三種方法，鋅指核酸酶(zinc finger endonuclease，ZFN)、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcript1n Activator-Like EffectorNuclease, TALEN)以及成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及相關(guān)基因(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated，CRISPR/Cas)。這三種方法都通過(guò)在外源DAN靶位點(diǎn)上產(chǎn)生雙鏈切口，從而誘導(dǎo)出同源重組修復(fù)和非同源末端連接，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因組的編輯。
[0003]ZFN結(jié)構(gòu)上包括鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)結(jié)構(gòu)域和Fok I切割結(jié)構(gòu)域，其中Fok I切割結(jié)構(gòu)域源于一種IIS型限制性?xún)?nèi)切酶，當(dāng)Fok I酶二聚體化，發(fā)揮其切割活性切割DNA的革E位點(diǎn)，形成雙鏈斷裂(double-stranded breaks，DSB)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制，即同源重組修復(fù)(homology-directed repair, HDR)或非同源末端鏈接(non-homologous end-joining，NHEJ)，從而實(shí)現(xiàn)基因組的革巴向敲除(knock-out)或敲入(knock-1n)，然而ZFN目前還存在設(shè)計(jì)苦難、脫靶嚴(yán)重，技術(shù)壟斷等問(wèn)題；
[0004]而TALEN 結(jié)構(gòu)上包括 TALE (transcript1n activator-like effector)結(jié)構(gòu)域和Fok I核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域兩個(gè)部分，其作用機(jī)制與ZFN—致，目前也存在多項(xiàng)缺陷，例如成本高，可操作性難度大，細(xì)胞毒性等；
[0005]CRISPR/Cas系統(tǒng)中主要以典型的Type II CRISPR/Cas為主，結(jié)構(gòu)上分為三個(gè)部分tracrRNA位于5’端，CRISPR序列位于3’端，中間的為一系列的Cas基因家族，其中Cas9為核心蛋白，因此可以稱(chēng)此II型系統(tǒng)為CRISPR/Cas9系統(tǒng)。當(dāng)外源DNA序列進(jìn)入細(xì)菌或古細(xì)菌的含有CRISPR的細(xì)胞中，CRISPR復(fù)合體中的類(lèi)似于Casl核酸結(jié)合蛋白會(huì)介導(dǎo)該復(fù)合體與外源DNA序列進(jìn)行結(jié)合，然后該復(fù)合體中類(lèi)似于Cas2核酸內(nèi)切酶會(huì)對(duì)外源DNA序列進(jìn)行切割，形成眾多約17_84bp不均等的小片段，其中的一個(gè)片段會(huì)在相關(guān)蛋白的作用下被整合到CRISPR的前導(dǎo)序列和第一個(gè)重復(fù)序列之間，形成一個(gè)新的間隔序列，入侵者與間隔序列相同的序列稱(chēng)為protospacer。當(dāng)外源DNA再次入侵時(shí)，與其protospacer互補(bǔ)匹配的間隔序列，及其兩邊的部分重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄形成前體crRNA (pre-crRNA)。轉(zhuǎn)錄完成后，tracrRNA與pre-crRNA形成二聚體，再與Cas9蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物，與外源DNA結(jié)合，掃描、尋找靶序列，crRNA的間隔序列與靶序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，在外源DNA互補(bǔ)配對(duì)的特定位置上被核蛋白復(fù)合物剪切。
[0006]CRISPR/Cas的打靶效率比較高，最高可達(dá)80 %，且靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)靈活、方便，載體構(gòu)建簡(jiǎn)單；不同于ZFN或TALEN中以蛋白質(zhì)識(shí)別DNA的方式，CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)靶序列的識(shí)別是以RNA與DNA堿基配對(duì)的方式，這樣會(huì)降低了脫靶的幾率，降低了細(xì)胞毒性，但并不是代表不會(huì)產(chǎn)生；此外，較于ZFN與TALEN，CRISPR/Cas的設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單、廉價(jià)，一般普通的實(shí)驗(yàn)也可自行操作；最后，CRISPR/Cas最大的有點(diǎn)就是可同時(shí)打靶多個(gè)基因，且每多一個(gè)靶位點(diǎn)只需多一個(gè)gRNA質(zhì)粒。
[0007]有優(yōu)勢(shì)必然也會(huì)存在局限性，例如CRISPR/Cas技術(shù)目前還尚未成熟，需要設(shè)計(jì)出特異性較高的gRNA質(zhì)粒，嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)以及在未建系的干細(xì)胞上無(wú)成功先例等，但相信隨著CRISPR/Cas的發(fā)展，這些難題終將會(huì)被解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0008]本發(fā)明公開(kāi)了一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)蘇禽黃雞胚胎干細(xì)胞特定基因進(jìn)行靶向敲除的方法:首先查詢(xún)出基因的外顯子序列，克隆出基因，測(cè)序，獲得完整的外顯子序列，并在此序列上設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9敲除靶位點(diǎn)作為gRNA，構(gòu)建CRISPR/Cas9雙啟動(dòng)子敲除載體，其中禽源U6啟動(dòng)子啟動(dòng)gRNA表達(dá)，T7啟動(dòng)子啟動(dòng)Cas9基因表達(dá)，并在載體中插入GFP蛋白作為報(bào)告基因；構(gòu)建完成的Cas9載體進(jìn)行SSA活性檢測(cè)，將終止子和靶位點(diǎn)插入雙熒光Luciferase載體中，靶位點(diǎn)位于終止子后，共轉(zhuǎn)染CRISPR/gRNA載體，以及新構(gòu)建的Iuciferase報(bào)告基因和內(nèi)參renilla質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體，檢測(cè)Iuciferase信號(hào)，Iuciferase活性相對(duì)于對(duì)照組增長(zhǎng)的越多，則證明gRNA剪切活性越高；將具有高SSA活性的CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)染ESCs，流式細(xì)胞術(shù)篩選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞，提取基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，克隆出靶位點(diǎn)前后各250bp的片段，使用T7E1酶進(jìn)行活性檢測(cè)，具有活性的敲除載體與T載體連接，搖菌后測(cè)序，計(jì)算具體的活性數(shù)值。
[0009]本發(fā)明包括以下步驟:
[0010](I)目的基因的獲取
[0011]根據(jù)基因序列號(hào)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)目的基因在原雞中的CDS序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以蘇禽黃雞組織或細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄形成的單鏈cDNA為模板克隆并獲得蘇禽黃雞中目的基因完整的CDS序列，通過(guò)比對(duì)得到完整的目的基因外顯子序列；
[0012](3) gRNA設(shè)計(jì)及合成
[0013]尋找獲得的外顯子序列中的PAM序列，將PAM序列前20bp左右的堿基作為靶序列，所有的靶序列在全基因組比對(duì)，無(wú)同源性的靶位點(diǎn)作為gRNA并合成；
[0014](4)CRISPR/Cas9基因敲除載體構(gòu)建
[0015]VK001-08載體為基礎(chǔ)載體進(jìn)行載體改造，以禽源U6作為啟動(dòng)子啟動(dòng)gRNA的表達(dá)，T7啟動(dòng)最啟動(dòng)Cas9酶的表達(dá)，同時(shí)插入GFP熒光基因作為報(bào)告基因。
[0016](5) CRISPR/Cas9基因敲除載體SSA活性檢測(cè)
[0017]將終止子和靶位點(diǎn)插入Luciferase載體中，靶位點(diǎn)位于終止子后，共轉(zhuǎn)染CRISPR/gRNA載體，以及新構(gòu)建的Iuciferase報(bào)告基因和內(nèi)參renilla質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體，檢測(cè)Iuciferase信號(hào)，Iuciferase活性相對(duì)于對(duì)照組增長(zhǎng)的越多，則證明gRNA剪切活性越尚;
[0018](6)CRISPR/Cas9基因敲除載體內(nèi)源活性檢測(cè)
[0019]剪切活性較高CRISPR/Cas9基因敲除載體轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的第二代ESC，48小時(shí)后流式細(xì)胞術(shù)篩選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞，提取基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，克隆出靶位點(diǎn)前后各250bp共計(jì)