多重靶向修飾的載基因復(fù)合物及制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了多重靶向修飾的載基因復(fù)合物及制備方法及應(yīng)用，其方法為：制備膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)；將TAT?NLS多肽水溶液與核酸水溶液混勻；得混合液；將基因載體(I)配成懸浮液；(4)懸浮液和混合液混勻，靜置，得到多重靶向修飾的載基因復(fù)合物；本發(fā)明的多重靶向修飾的載基因復(fù)合物。通過膜靶向肽中的REDV肽與內(nèi)皮細胞表面的整合素受體特異性識別，提高細胞對其攝取。進入細胞后的復(fù)合物位于溶酶體/內(nèi)涵體結(jié)構(gòu)中，通過聚乙烯亞胺與TAT共同作用，提高該復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸能力，促進目的基因進入細胞質(zhì)中。通過核定位信號NLS與核膜的相互作用，促進目的基因的核內(nèi)在化。目的基因在內(nèi)皮細胞中的轉(zhuǎn)染效率強。
【專利說明】
多重靶向修飾的載基因復(fù)合物及制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及多重靶向修飾的載基因復(fù)合物及制備方法及應(yīng)用，屬于具有生物靶向識別功能的基因載體技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，心血管疾病日益盛行。由于臨床治療效果不佳以及巨額的治療費用，心血管疾病是全球造成死亡的主要原因之一?；虔煼ㄊ呛苡星熬暗闹委熛忍旌秃筇煨孕难芗膊〉姆椒?。隨著心力衰竭及相關(guān)心血管疾病的病理生理學(xué)分子途徑的識別，基因治療的預(yù)臨床試驗在小型和大型動物模型上紛紛展開，并逐步走向臨床，然而，最初的臨床效果并沒有達到預(yù)期的目標。病毒載體因其固有的致命性免疫原性，雖然轉(zhuǎn)染效果較好，但仍備受爭議。非病毒基因載體很好地避免了病毒載體的這一問題，但是轉(zhuǎn)染效率差、基因表達水平低以及無法在目標組織或細胞累積是其面臨的主要問題。
[0003]為了促進載基因復(fù)合物在內(nèi)皮細胞的傳遞，增強目的基因的表達，本課題組采用內(nèi)皮細胞靶向性肽REDV(Arg-Glu-Asp-Val)修飾的方法，特異性增強載基因復(fù)合物與內(nèi)皮細胞的相互作用，進而促進細胞攝取實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染。然而，載基因復(fù)合物實現(xiàn)基因的表達需要經(jīng)歷復(fù)雜的細胞內(nèi)運輸途徑，其中最關(guān)鍵的兩步就是內(nèi)涵體/溶酶體逃逸和核內(nèi)在化。載基因復(fù)合物通過內(nèi)吞途徑進入細胞后形成小泡進而發(fā)育成內(nèi)涵體、溶酶體。溶酶體內(nèi)PH值急劇下降，富含的各種酸性水解酶達到最佳活性，降解質(zhì)粒DNA而使載基因復(fù)合物喪失轉(zhuǎn)染能力，因此實現(xiàn)載基因復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸很重要。穿膜肽是一類具有特定功能的、可以與細胞的膜結(jié)構(gòu)作用并促進穿透的短鏈分子。因此，穿膜肽可用于載基因復(fù)合物的細胞攝取及內(nèi)涵體逃逸。TAT是最常用的細胞穿膜肽，其內(nèi)部富含帶正電荷的精氨酸片段。正是由于TAT聚陽離子的特點，可通過共價鍵將TAT多肽與寡核苷酸連接，也可以通過正負電荷的相互作用形成TAT/DNA復(fù)合物而用于基因轉(zhuǎn)染。但是，TAT在不同細胞和組織的細胞攝取不具有特異性，且單獨TAT/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率很低，因此，能否通過TAT與靶向納米粒協(xié)同作用，進一步賦予靶向載基因復(fù)合物穿膜性能來促進核酸在內(nèi)皮細胞中的特異性轉(zhuǎn)染。
[0004]另外，基因的表達是在細胞核內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成mRNA來實現(xiàn)。研究表明，當在細胞質(zhì)中注射基因時，其表達只有不到10%。而直接向細胞核內(nèi)注射可實現(xiàn)高達50%的基因表達。因此核內(nèi)在化是增強基因表達，提高治療效果的又一關(guān)鍵。細胞核表面的核膜只允許小顆粒自由穿行，而對于粒徑大于1nm的顆粒(如蛋白和DNA)需要經(jīng)核膜上的核定位信號(NLS)來傳送，因此可利用NLS來提高核酸向核內(nèi)運送的能力。
[0005]目前對于這種多重靶向修飾的載基因復(fù)合物在促進內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染方面的研究還較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物靶向識別性能好，轉(zhuǎn)染效率高，生物毒性低的多重靶向修飾的載基因復(fù)合物。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供一種多重靶向修飾的載基因復(fù)合物的制備方法。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供一種多重靶向修飾的載基因復(fù)合物在制備修復(fù)血管內(nèi)皮細胞藥物的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0010]多重靶向修飾的載基因復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟:
[0011](I)在氮氣保護下，將重均分子量為26000-30000的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-CO-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物、重均分子量為2000-7500的兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇，在混合溶劑中溶解，在室溫、避光條件下反應(yīng)2_4h，加入膜靶向肽，反應(yīng)4-8h，產(chǎn)物在蒸餾水中透析48-72h，冷凍干燥，得到膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I);
[0012]所述聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的所接枝的支化聚乙烯亞胺的重均分子量相同，且為10000。
[0013]所述混合溶劑由體積比為1: (2-4)的pH為8.0-9.0的0.lmol/L磷酸緩沖溶液和二甲基亞砜組成；
[0014]所述聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物、所述的兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩爾比為1:(1-20):(0.5-20)；
[0015]所述膜革巴向肽為Cys-X-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，所述X 為0-5 個 Gly、或 0-5 個 Ala、或0-5個Gly和Ala的任意組合；
[0016](2)室溫下，按簡寫為TAT-NLS多肽與核酸的質(zhì)量比為(0.5-1.2):1的比例，將TAT-NLS多肽水溶液與核酸水溶液混合均勻，靜置20-40分鐘;得到混合液；
[0017](3)將所述基因載體(I)配成濃度為0.1-0.8mg/mL的基因載體(I)納米粒懸浮液；
[0018](4)將所述基因載體(I)納米粒懸浮液和步驟(2)獲得的混合液混合均勻，靜置20-40分鐘，得到多重靶向修飾的載基因復(fù)合物;所述基因載體(I)的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-C0-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的氮與混合液中核酸的磷的摩爾比為10-30:1。
[0019]上述方法制備的多重靶向修飾的載基因復(fù)合物。
[0020]上述的多重靶向修飾的載基因復(fù)合物在制備修復(fù)血管內(nèi)皮細胞基因藥物的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的多重靶向修飾的載基因復(fù)合物集多重靶向識別與基因于一身。通過膜靶向肽中的REDV肽與內(nèi)皮細胞表面的整合素受體特異性識別，提高細胞對多重靶向修飾的載基因復(fù)合物的攝取。進入細胞后的多重靶向修飾的載基因復(fù)合物位于溶酶體/內(nèi)涵體結(jié)構(gòu)中，通過聚乙烯亞胺與細胞穿膜肽TAT的共同作用，提高多重靶向修飾的載基因復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸能力，促進目的基因進入細胞質(zhì)中。通過核定位信號NLS與核膜的相互作用，促進目的基因的核內(nèi)在化。目的基因在內(nèi)皮細胞中的轉(zhuǎn)染效率也就隨之增強。
【附圖說明】
[0022]圖1為膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體熒光圖:圖中I為0.45mg/mL的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙稀亞胺共聚物的焚光發(fā)射光譜圖；2為0.65mg/mL膜革El向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)的熒光發(fā)射光譜圖；3為0.1Omg/mL的CREDVW多肽的發(fā)射光譜圖。
[0023]圖2為多重靶向修飾的載基因復(fù)合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP) (B)和對照(pGFP/REDV-NP) (A)，在不同氮磷摩爾比(N/P)結(jié)合時的流體力學(xué)直徑分布圖。
[0024]圖3為多重靶向修飾的載基因復(fù)合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP) (B)和對照(pGFP/REDV-NP)(A)，在不同氮磷摩爾比(N/P)結(jié)合時的Zeta電位分布圖。
[0025]圖4為多重靶向修飾的載基因復(fù)合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP) (B)和對照(pGFP/REDV-NP) (A)在不同N/P比時的瓊脂糖凝膠電泳成像圖。
[0026]圖5為膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(REDV-NP納米粒)(A)、pGFP/REDV-NP(B)、多重靶向修飾的載基因復(fù)合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP) (C)和pGFP/PEI10000(D)復(fù)合物(N/P = 20)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞毒性考察效果圖。(PEI10000指代重均分子量為10000的支化聚乙烯亞胺)。
[0027]圖6為人臍靜脈內(nèi)皮細胞被不同的載基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染24h后的熒光圖(A、B、C、D)及
[0028]其對應(yīng)的明場圖(厶’、8’、(:’、0’):
[0029]A和A’為單獨pGFP在臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果(空白對照)；
[0030]B和B’為pGFP/REDV-NP在臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果(陰性對照)；
[0031]C和C ’為TAT-NLS/pGFP/REDV-NP在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果；
[0032]D和D’為PGFP/PEI25000在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果(陽性對照)。
[0033](PEI25000是指重均分子量為25000的支化聚乙烯亞胺)。標尺= 100μπι。
[0034]圖7為人臍靜脈內(nèi)皮細胞對不同載基因復(fù)合物的攝取:
[0035]圖7(1)為不同熒光強度的細胞統(tǒng)計，其中:
[0036]A 為對 pGFP/Cy5-REDV_NP 的攝取；
[0037]B 為對 TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP 的攝?。?br>[0038]C為未處理的細胞。
[0039]圖7(2)不同熒光強度的細胞統(tǒng)計。左邊為平均熒光強度，右邊為細胞攝取率。
[0040]A 為對 pGFP/Cy5-REDV-NP 的攝??；
[0041 ] B 為對 TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP 的攝取；
[0042]C為未處理的細胞。
[0043]圖8 為轉(zhuǎn)染 4h (I)和24h (2)后，Cy5_01 igo/REDV-NP 和 TAT-NLS/Cy5_01 igo/REDV-NP中Cy5_01igo的細胞內(nèi)分布。標尺= 20μηι。
【具體實施方式】
[0044]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。本發(fā)明的實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對本發(fā)明作任何限制。
[0045]Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg 的多肽簡稱為 TAT委托上海吉爾生化有限公司制備。
[0046]Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val的多肽簡稱為NLS，委托上海吉爾生化有限公司制備。
[0047]兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇(0PSS-PEG-NHS)購于北京鍵凱科技有限公司。
[0048]聚乙稀亞胺購于Sigma試劑公司。
[0049]聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物為實驗室自制，制備方法參閱 Juan Lv , Jing Yang , Xuefang Hao , Xiangkui Ren , Yakai Feng ,WenchengZhang.B1degradable PEI modified complex micelles as gene carriers withtunable gene transfect1n efficiency for ECs.Journal of Materials ChemistryB, 2016,4,997-1008 論文。
[0050]REDV-NP指代膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)。
[0051]pGFP指代含綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒，購自科域新程(天津)科技開發(fā)有限公司。
[0052]Cy5熒光染料購自天津希恩思生化科技有限公司。
[0053]Cy5 標記的核苷酸序列(GAATGAATTCTGACTGTACTGACTCGACTG)，簡稱為 Cy5-01igo，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0054]Lyso Tracker可將活細胞的內(nèi)涵體/溶酶體標記為紅色，購自Invitrogen。
[0055]Hoechst 33342可將活細胞的細胞核標記為藍色，購自Lifetechnology。
[0056]Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp 的多肽簡稱為 CREDVW。
[0057]實施例1:膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)的制備方法，包括如下步驟:
[0058]在氮氣保護下，將重均分子量為30000的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物，所述聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)_聚乙烯亞胺共聚物中的所接枝的支化聚乙烯亞胺的重均分子量相同，且為10000、重均分子量為2000的兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇(0PSS-PEG-NHS)，在混合溶劑中溶解，在室溫、避光條件下反應(yīng)3h，加入膜靶向肽，反應(yīng)6h，產(chǎn)物在蒸餾水中透析48h，每隔2h換一次蒸餾水，冷凍干燥，得到膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I);
[0059]混合溶劑由體積比為1:3的pH為8.0的0.lmol/L磷酸緩沖溶液和二甲基亞砜組成；
[0060]所述聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物、所述的兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩爾比為1:20:20;
[0061 ]所述膜革巴向肽為Cys-Arg-Glu-Asp-Val-TrpJI^lCREDVW;
[0062]通過聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的聚乙烯亞胺上的氨基與鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇末端的琥珀酰亞胺發(fā)生酯化反應(yīng)，將兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇引入聚合物分子鏈上，再通過CREDVW中半胱氨酸的巰基與吡啶二硫基反應(yīng)，從而將CREDVW肽連接到大分子上，得到膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)。
[0063]在激發(fā)波長為290nm時，CREDVW肽與膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)在360nm處有明顯的熒光發(fā)射峰，而聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物則沒有，據(jù)此可以判斷CREDVW多肽已經(jīng)連接到聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物上了。見圖1。
[0064]實驗證明，分別采用重均分子量為26000、27000、28000、29000的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物，替代本實施例的重均分子量為30000的支化聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物，其它同本實施例，制備出:膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)。
[0065]實驗證明，分別采用重均分子量為3500、5000、7500的兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇分別替代本實施例的重均分子量為2000的兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇，其它同本實施例，制備出:膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)。
[0066]實驗證明，本實施例中，在室溫、避光條件下反應(yīng)2h或4h替代本實施例的反應(yīng)3h;加入膜靶向肽后反應(yīng)4h或8h，產(chǎn)物在蒸餾水中透析60h或72h，依次替代本實施例的反應(yīng)時間和透析時間，其它同本實施例，制備出:膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)。
[0067]實驗證明，混合溶劑還可以由體積比為1:4的pH為9.0的0.lmol/L磷酸緩沖溶液和二甲基亞砜組成；或由體積比為1: 2的pH為9.0的0.lmol/L磷酸緩沖溶液和二甲基亞砜組成。
[0068]實驗證明，所述聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物、所述兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩爾比還可以是:1:1:0.5或1:10:10;
[0069]實驗證明:膜靶向肽還可以是:
[0070]Cys-Gly-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，
[0071 ] Cys-Ala-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，
[0072]Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，
[0073]Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，
[0074]或Cys-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Arg-Glu-Asp-Val-Trp。
[0075]實施例2: REDV-NP、pGFP/REDV-NP 復(fù)合物及 TAT-NLS/pGFP/REDV-NP 復(fù)合物的制備:
[0076](I)室溫下，將簡寫為TAT-NLS多肽溶于適量水中，(水的量以能溶解TAT-NLS多肽即可)；
[0077]將核酸(本實施例采用的核酸是含綠色熒光蛋白的質(zhì)粒)溶于適量水中，(水的量以能溶解綠色熒光蛋白的質(zhì)粒即可)；
[0078]按簡寫為TAT-NLS多肽與核酸的質(zhì)量比為1:1的比例，將TAT-NLS多肽水溶液與核酸水溶液混合均勻，靜置30分鐘;得到混合液；
[0079](2)采用透析法制備膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)(REDV-NP)納米粒懸浮液:
[0080]稱取5mg膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I)，用ImL的N，N-二甲基甲酰胺溶解，在磁力攪拌下逐滴滴加到5mL的PBS緩沖液中(pH= 7.4)，液體在蒸餾水中透析2天后得到濃度為0.5mg/mL的基因載體(I)納米粒懸浮液(REDV-NP納米粒懸浮液);
[0081](3)將所述基因載體(I)納米粒懸浮液和步驟(I)獲得的混合液混合均勻，靜置30分鐘，得到多重靶向修飾的載基因復(fù)合物;所述基因載體(I)的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-C0-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的氮與混合液中核酸的磷的摩爾比為O、2、5、1、20、30、40。
[0082]用同樣的方法配制不含TAT-NLS的pGFP/REDV-NP復(fù)合物。
[0083 ]圖 2，圖 3分別為pGFP/REDV-NP (A)和TAT-NLS/pGFP/REDV-NP (B)在不同 N/P下的流體力學(xué)直徑和Zeta電位分布圖。隨著N/P比的增大，兩種載基因復(fù)合物的粒徑表現(xiàn)出降低的趨勢。當N/P彡20時，復(fù)合物的粒徑約為150nm且逐漸趨于穩(wěn)定。在N/P = 5-40范圍內(nèi)，兩種復(fù)合物的Zeta電位均為正值，這為其進入細胞提供了必要條件。
[0084]實驗證明:
[0085]用TAT-NLS多肽與核酸的質(zhì)量比為0.5:1或1.2:1替代本實施例的1:1，其它同本實施例，可以制備多重靶向修飾的載基因復(fù)合物。
[0086]將TAT-NLS多肽水溶液與核酸水溶液混合均勻，靜置的時間為20分鐘或40分鐘，其它同本實施例，可以制備多重靶向修飾的載基因復(fù)合物。
[0087]將基因載體(I)配成濃度為0.1或0.8mg/mL的基因載體(I)納米粒懸浮液替代本實施例的0.5mg/mL的基因載體(I)納米粒懸浮液;其它同本實施例，可以制備多重革El向修飾的載基因復(fù)合物。
[0088]實驗證明，用基因載體(I)納米粒懸浮液和步驟(2)獲得的混合液混合均勻，靜置20或40分鐘替代本實施例的靜置30分鐘，其它同本實施例，可以制備多重靶向修飾的載基因復(fù)合物。
[0089]實施例3: TAT-NLS/pGFP/REDV-NP及pGFP/REDV-NP的瓊脂糖凝膠電泳分析:
[0090 ]將制備好的不同 N/P 比的 TAT-NL S/pGFP/RED V-NP、pGFP/REDV-NP 和純的 pGFP 基因分別加到0.8%的瓊脂糖凝膠孔中，100V下在I XTAE緩沖液中電泳30min。紫外線照射下觀察pGFP的位置并拍照分析納米粒與pGFP的結(jié)合能力。從圖4中可以看出，RED V-NP在N/P比^20時可完全壓縮負載pGFP ο加入TAT-NLS后，TAT-NLS/pGFP/REDV-NP在N/P比彡10時即可完全阻滯質(zhì)粒的迀移，這表明TAT-NLS有助于REDV-NP納米粒更好地結(jié)合并壓縮pGFP。
[0091 ] 實施例4: TAT-NLS/pGFP/REDV-NP及pGFP/REDV-NP對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(購自美國AllCells澳賽爾斯生物技術(shù)(上海))的細胞毒性考察:
[0092]通過四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)對REDV-NP、pGFP/REDV-NP及TAT-NLS/pGFP/REDV-NP的細胞相容性進行測試。首先，接種在96-孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，無血清饑餓12h后，加入不同濃度的樣品(N/P = 20，納米粒中PEI的濃度為3.3，8.3，16.6，24.9，33.2yg/mL)，48h后測定細胞的相對活力。從圖5中可以看出，經(jīng)載基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞仍保持良好的活性，REDV-NP對細胞活性的影響與負載DNA后形成的pGFP/REDV-NP復(fù)合物類似，這表明制備的復(fù)合物細胞毒性都很小，可能是由于加入了大量的PEG鏈段，其屏蔽效應(yīng)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞起到了有效的保護作用。TAT-NLS的引入對細胞活力幾乎無影響。
[0093]實施例5: TAT-NLS/pGFP/REDV-NP及pGFP/REDV-NP對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外轉(zhuǎn)染實驗:
[0094]在6-孔細胞培養(yǎng)板中，人臍靜脈內(nèi)皮細胞融合達50% -70 %后饑餓過夜，加入新配制的TAT-NLS/pGFP/REDV-NP及pGFP/REDV-NP (基因載體(I)的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-co_己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的氮與混合液中核酸的磷的摩爾比=20，2yg DNA/we 11)。培養(yǎng)24h后通過倒置熒光顯微鏡考察不同復(fù)合物在細胞中的轉(zhuǎn)染效果。
[0095]圖6(A和A’)單獨pGFP基因在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果(空白對照)；
[0096]圖6(B和B’)pGFP/REDV-NP在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果(陰性對照)；
[0097]圖6(C和C’)TAT-NLS/pGFP/REDV-NP在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果；
[0098]圖6(D和D，)pGFP/PEI 25000在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果(陽性對照)。(PEI25000指重均分子量為25000的支化聚乙烯亞胺)標尺= 100μπι。
[0099]通過體外轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞，考察不同的載基因復(fù)合物傳遞目的基因到靶細胞的效率。從圖6(A)中我們可以看到，沒有基因載體只加入質(zhì)粒的空白對照組中觀察不到含GFP的細胞。其他三組中均有GFP的表達，表明這三種載基因納米粒體系都可以成功地將pGFP運送到人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，并實現(xiàn)pGFP的表達。加入TAT-NLS后，TAT-NLS/pGFP/REDV-NP的轉(zhuǎn)染效果最好(圖6(C))。這表明，體系中加入TAT-NLS后確實能提高載基因納米粒在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的傳遞和表達。
[0100]實施例6:Cy5標記的載基因復(fù)合物(TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP)的細胞攝取[0101 ] TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP 的制備:
[0102](I)同實施例1
[0103](2)同實施例2步驟(I)
[0104](3)同實施例2步驟(2)
[0105]將濃度為0.5mg/mL的聚陽離子基因載體(I)納米粒懸浮液(REDV-NP納米粒懸浮液)與1.0mg/mL Cy5熒光染料溶于二甲基亞砜溶液，按體積比為50: I的比例混合，反應(yīng)8h，在蒸餾水中透析除去二甲基亞砜，和步驟(2)獲得的混合液混合均勻，靜置30分鐘，得到多重靶向修飾的載基因復(fù)合物(TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP);所述基因載體(I)的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的氮與混合液中核酸的磷的摩爾比為20。
[0106]用同樣的方法配制不含TAT-NLS的pGFP/Cy5-REDV-NP。
[0107]為了研究TAT-NLS/pGFP/REDV-NP對人臍靜脈內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染的促進作用，我們對pGFP/REDV-NP和TAT-NLS/pGFP/REDV-NP的細胞攝取進行了測定。首先用Cy5紅色熒光染料標記納米粒，然后將Cy5標記的TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP和pGFP/Cy5-REDV-NP對人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行轉(zhuǎn)染。孵育4h后用流式細胞分析儀測定細胞對Cy5標記的TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP 和 pGFP/Cy5-REDV-NP 的攝取。
[0108]圖7 人臍靜脈內(nèi)皮細胞對 pGFP/Cy5-REDV-NP (A)和 TAT-NLS/pGFP/Cy 5-REDV-NP (B)的攝取:
[0109](I)不同熒光強度的細胞統(tǒng)計。(2)不同熒光強度的細胞統(tǒng)計。平均熒光強度(左邊)和細胞攝取率(右邊)。以未處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(C)為空白對照。
[0110]兩種載基因復(fù)合物的細胞攝取率都達到99.9%以上，表明細胞中都有載基因納米粒的進入但其平均熒光強度各不相同，分別為pGFP/Cy5-REDV-NP(170.20 ± 2.8)和TAT-NLS/pGFP/Cy 5-REDV-NP (255.10±8.3)。從圖 7(2)中可以看出，加入 TAT-NLS 后，TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP的細胞攝取有明顯的增加。這表明TAT-NLS的加入，有利于載基因復(fù)合物在細胞內(nèi)富集，對增強人臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染是非常有幫助的。
[0111]實施例7: Cy5標記的載基因復(fù)合物的細胞內(nèi)分布
[0112]以Cy5標記的Cy5-01igo為模型基因，對Cy5-01igo/REDV-NP和TAT-NLS/Cy5-01 igo/REDV-NP在人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)的分布進行了研究。
[0113]TAT-NLS/Cy5-01 igo/REDV-NP 的制備:
[0114](I)同實施例1
[0115](2)室溫下，將簡寫為TAT-NLS多肽溶于適量水中，(水的量以能溶解TAT-NLS多肽即可)
[0116]將核酸(Cy5-01igo)溶于適量水中，(水的量以能溶解Cy5-01igo即可)；
[0117]按簡寫為TAT-NLS多肽與Cy5_01igo的質(zhì)量比為1:1的比例，將TAT-NLS多肽水溶液與Cy5-01igo水溶液混合均勻，靜置30分鐘;得到混合液；
[0118](3)同實施例2的步驟(2);
[0119](4)將所述基因載體(I)納米粒懸浮液和步驟(2)獲得的混合液混合均勻，靜置30分鐘，得到多重靶向修飾的載基因復(fù)合物(TAT-NLS/Cy5-01 igo/REDV-NP);所述基因載體
(I)的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的氮與混合液中核酸的磷的摩爾比為20。
[0120]用同樣的方法配制不含TAT-NLS的Cy5-01 igo/REDV-NP復(fù)合物。
[0121]人臍靜脈內(nèi)皮細胞首先接種在共聚焦平皿內(nèi)(4X 15Cell/皿)，然后用TAT-NLS/Cy5-01 igo/REDV-NP和Cy5-01 igo/REDV-NP對細胞進行轉(zhuǎn)染。孵育4h后對細胞進行清洗并換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在預(yù)設(shè)時間點4h和24h，加入Lyso Tracker(把活細胞的內(nèi)涵體/溶酶體標記為紅色)，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)15min，再加入Hoechst 33342(把活細胞的細胞核標記為藍色)Jmin后用大量的PBS清洗，除去染料的浮色。隨后通過激光共聚焦掃描電鏡進行觀察、拍照。
[0122]圖8通過激光共聚焦掃描電鏡表征Cy5標記的Cy5-01igo/REDV-NP和TAT-NLS/Cy5-01 i go/REDV-NP轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞4h (I)和24h (2)后的細胞內(nèi)分布。從圖8 (I)可以明顯地觀察到，加入TAT-NLS的TAT-NLS/Cy5-01 igo/REDV-NP在4h時就有部分從內(nèi)涵體/溶酶體中逃出到細胞質(zhì)中，而Cy5-01 igo/REDV-NP仍大部分處在內(nèi)涵體/溶酶體結(jié)構(gòu)中，表明TAT-NLS確實能促進TAT-NLS/Cy5-01 i go/REDV-NP的內(nèi)涵體逃逸。這可能是由于TAT-NLS也可以負載，復(fù)合物中PEI和TAT產(chǎn)生增強的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，促進了基因向細胞質(zhì)的釋放。從載基因復(fù)合物在24h時的細胞分布圖(圖8 (2))可以更加明顯地觀察到加入TAT-NLS組，即TAT-NLS/Cy5-01igo/REDV-NP組，有明顯增多的Cy5-01igo進入到細胞核中。而不含TAT-NLS組，即Cy5-01 igo/REDV-NP復(fù)，只有少量的Cy5_01 igo進入到細胞核中。這表明TAT-NLS有助于TAT-NLS/Cy5-01 igo/REDV-NP中基因的核內(nèi)在化，提高了載基因納米粒的轉(zhuǎn)染效率。
[0123]本發(fā)明多重靶向修飾的載基因復(fù)合物僅以pGFP和Cy5_01igo為例，但并不對基因進行限定，凡可以作為藥物的基因都可以用本發(fā)明的方法制成多重靶向修飾的載基因復(fù)合物。
【主權(quán)項】
1.多重靶向修飾的載基因復(fù)合物的制備方法，其特征是包括如下步驟: (1)在氮氣保護下，將重均分子量為26000-30000的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-CO-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物、重均分子量為2000-7500的兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇，在混合溶劑中溶解，在室溫、避光條件下反應(yīng)2_4h，加入膜靶向肽，反應(yīng)4-8h，產(chǎn)物在蒸餾水中透析48-72h，冷凍干燥，得到膜靶向肽修飾的聚陽離子基因載體(I); 所述聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的所接枝的支化聚乙稀亞胺的重均分子量相同，且為10000。 所述混合溶劑由體積比為I: (2-4)的pH為8.0-9.0的0.lmol/L磷酸緩沖溶液和二甲基亞砜組成； 所述聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物、所述的兩端分別為鄰二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩爾比為1:(1-20):(0.5-20); 所述膜革E向肽為0}^~?(-4找-6111-48。~\%1-1'印，所述乂為0-5個617、或0-5個413、或0-5個Gly和Ala的任意組合； (2)室溫下，按簡寫為TAT-NLS多肽與核酸的質(zhì)量比為(0.5-1.2):1的比例，將TAT-NLS多肽水溶液與核酸水溶液混合均勻，靜置20-40分鐘;得到混合液； (3)將所述基因載體(I)配成濃度為0.1-0.8mg/mL的基因載體(I)納米粒懸浮液； (4)將所述基因載體(I)納米粒懸浮液和步驟(2)獲得的混合液混合均勻，靜置20-40分鐘，得到多重靶向修飾的載基因復(fù)合物;所述基因載體(I)的聚乙烯亞胺-聚(乙交酯-Co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺共聚物中的氮與混合液中核酸的磷的摩爾比為10-30: I。2.權(quán)利要求1的方法制備的多重靶向修飾的載基因復(fù)合物。3.權(quán)利要求2所述的多重靶向修飾的載基因復(fù)合物在制備修復(fù)血管內(nèi)皮細胞基因藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K47/48GK106086079SQ201610550401
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】馮亞凱, 楊靜, 李茜, 郭錦棠
【申請人】天津大學(xué)