專(zhuān)利名稱(chēng)：一種腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向基因治療的納米復(fù)合材料的制備方法，更具體地，是一種腺病 毒-殼聚糖納米結(jié)構(gòu)復(fù)合材料的制備方法。
背景技術(shù)：
腺病毒(Ad)攜帶相關(guān)材料可用于轉(zhuǎn)基因抗癌治療，同時(shí)聯(lián)合化療、放療來(lái)增強(qiáng)抗 癌效果。Ad有很多優(yōu)勢(shì)，如高傳染性和基因治療的可控制插入性等，但由于沒(méi)有材料能夠把 足夠多的Ad輸送到病灶部位，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行充分的感染，因此，當(dāng)前以Ad為媒介的治療 主要局限于局部瘤內(nèi)的監(jiān)管。為了成功實(shí)現(xiàn)聯(lián)合治療，需要在目標(biāo)腫瘤部位得到局部高濃 度的Ad。為了進(jìn)行有效地基因治療，需要一個(gè)可以被系統(tǒng)性監(jiān)管的以Ad為媒介的腫瘤靶 向系統(tǒng)。然而，在進(jìn)行全身Ad傳送時(shí)會(huì)遇到多種困難，例如，Ad會(huì)被主體(人)的抗體抑 制，在體循環(huán)中存活周期短，而且會(huì)被肝臟吸收，在靶向疾病部位的濃度較低等。血液中的 Ad會(huì)很快被中和抗體識(shí)別，中和抗體可以鈍化病毒表面纖維蛋白的識(shí)別能力，從而降低其 傳染性，從而導(dǎo)致需要增加抗腫瘤治療所需的有效病毒的劑量。由于Ad會(huì)被肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮 系統(tǒng)的肝細(xì)胞或庫(kù)普費(fèi)爾氏細(xì)胞吸收從而導(dǎo)致很高的肝臟毒性。此外，傳統(tǒng)的Ad是通過(guò)增 加-彌散-滯留(EPR)機(jī)制被動(dòng)地傳輸?shù)侥[瘤細(xì)胞的，這要求Ad的局部濃度非常高。鑒于 以上因素，要實(shí)現(xiàn)Ad被傳送至離疾病較近部位以實(shí)現(xiàn)選擇性病毒傳染，達(dá)到有效治療的目 的尚有待研究。研究表明，可以采用對(duì)Ad進(jìn)行化學(xué)修飾的方法來(lái)減少肝毒性、降低抗體對(duì)Ad的 抵制，包括Ad表面的PEG修飾，N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺修飾以及封入脂質(zhì)體膠囊等。 然而，Ad表面的PEG修飾雖可以阻止體循環(huán)中抗體對(duì)他的抵制，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，但表面 PEG的存在也會(huì)降低Ad的對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染能力。此外，通過(guò)EI3R機(jī)制被動(dòng)聚積的Ad濃度 仍然不夠起到抗癌效果，因此需要提供一種具有高效靶向功能的改進(jìn)型腺病毒，提高病灶 部位的Ad濃度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種毒性低、感染力強(qiáng)且具有靶向功能的腺病毒-殼聚糖納 米復(fù)合材料的制備方法。本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的針對(duì)殼聚糖及其與聚乙二醇和葉酸的化合物 與腺病毒表面的離子交聯(lián)后，可以提供化學(xué)交聯(lián)位點(diǎn)以及靶向功能的特點(diǎn)，通過(guò)將腺病毒 和殼聚糖及其與聚乙二醇和葉酸的化合物進(jìn)行靜電紡絲后，用磷酸三甲苯脂接收池接收， 提供一種毒性低、感染力強(qiáng)且具有靶向功能的腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料，且工藝簡(jiǎn)單、 產(chǎn)率高，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明的制備腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料的方法，包括如下步驟(1)聚乙二醇-葉酸縮合物的合成將葉酸、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞
3胺按照1 1 1 1 5 5的摩爾比溶于二甲基亞砜，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下活化6 48小時(shí)， 過(guò)濾后得到活化的葉酸溶液，然后按照葉酸與聚乙二醇的摩爾比為20 1 1 2的比例 加入重均分子量為2000 10000的聚乙二醇，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)1 M小時(shí)，加入丙酮沉 淀后離心除去多余葉酸，上清液用去離子水透析后凍干即得到聚乙二醇-葉酸縮合物；(2)殼聚糖-聚乙二醇縮合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉 酸的合成將低分子量的殼聚糖溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量百分濃度為0. 10%的殼聚 糖溶液，攪拌過(guò)夜；然后在常溫下分別按摩爾比為1 1 1 5 5 1加入聚乙二醇、 二氯乙烷以及N-羥基丁二酰亞胺，按摩爾比為1 1 1 5 5 1加入葉酸、二氯乙 烷以及N-羥基丁二酰亞胺，按摩爾比為1 1 1 5 5 1加入聚乙二醇-葉酸縮合 物、二氯乙烷以及N-羥基丁二酰亞胺，攪拌過(guò)夜，反應(yīng)液分別用去離子水透析，凍干后得到 殼聚糖-聚乙二醇縮合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉酸縮合物，其中， 殼聚糖與聚乙二醇的摩爾比為1 5 5 1，殼聚糖與葉酸的摩爾比為1 5 5 1;(3)腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合物的制備將低分子量殼聚糖、殼聚糖-聚乙二醇縮 合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉酸縮合物分別在常溫下溶解于磷酸 鹽緩沖液中，制成質(zhì)量百分濃度為的溶液；將所述溶液分別與60 μ 1濃度為IXIO12Vp/ ml的腺病毒混懸液混合，得到腺病毒/殼聚糖混合液、腺病毒/殼聚糖-聚乙二醇混合液、 腺病毒/殼聚糖-葉酸混合液、腺病毒/殼聚糖-聚乙二醇-葉酸混合液，將上述混合液按 照體積比為1 1 1 1 2 3 2 3的比例再次全部混合后進(jìn)行靜電紡絲，其中， 所述靜電紡絲的參數(shù)如下電壓為10 20KV、溶液流速為2 10mL/h、針尖到磷酸三甲苯 脂接收池的接收距離為5 15cm，接收后緩慢攪動(dòng)10 30min，再進(jìn)行離心濃縮除去未反 應(yīng)的物質(zhì)，得到腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料，于4°C下儲(chǔ)存。磷酸鹽緩沖液(PBS)是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的一種溶液，其PH = 7. 4，與人體血液等滲， 主要成分為磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉以及氯化鉀。按照本發(fā)明制備腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料，通過(guò)將殼聚糖及其與聚乙二醇和 葉酸的縮合物混合腺病毒進(jìn)行靜電紡絲，再與三聚磷酸鹽原位離子交聯(lián)制得腺病毒-殼聚 糖納米復(fù)合材料，其中，腺病毒被有效包裹，但其生物活性和傳染性卻沒(méi)有降低，且具有靶 向功能，實(shí)現(xiàn)了在體循環(huán)中延長(zhǎng)活性周期，且提高了靶向部位的局部濃度，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、 易于操作，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。
具體實(shí)施例方式以下描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但并非用以限定本發(fā)明。實(shí)施例1 按照如下方法制備腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料(1)聚乙二醇-葉酸縮合物的合成將葉酸、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞 胺按照1 2 2的摩爾比溶于二甲基亞砜，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下活化12小時(shí)，經(jīng)孔徑為0.2μπι 的膜過(guò)濾后得到活化的葉酸溶液，然后按照葉酸與聚乙二醇的摩爾比為15 1的比例加入 重均分子量為3400的聚乙二醇，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)4小時(shí)，加入丙酮沉淀后離心除去多余 葉酸，上清液用去離子水透析后凍干即得到聚乙二醇-葉酸縮合物；(2)殼聚糖-聚乙二醇縮合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉酸的合成將低分子量的殼聚糖溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量百分濃度為1.0%的殼聚糖溶液，攪 拌過(guò)夜；然后在常溫下分別按摩爾比2 2 1加入聚乙二醇、二氯乙烷以及N-羥基丁二酰 亞胺，按摩爾比2 2 1加入葉酸、二氯乙烷以及N-羥基丁二酰亞胺，按摩爾比2 :2:1 加入聚乙二醇-葉酸縮合物、二氯乙烷以及N-羥基丁二酰亞胺，攪拌過(guò)夜，反應(yīng)液分別用去 離子水透析，凍干后得到殼聚糖-聚乙二醇縮合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙 二醇-葉酸縮合物，其中，殼聚糖與聚乙二醇的摩爾比為1 1，殼聚糖與葉酸的摩爾比為 1:1;(3)腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合物的制備將低分子量殼聚糖、殼聚糖-聚乙二醇 縮合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉酸縮合物分別在常溫下溶解于磷 酸鹽緩沖液(PBS)中，制成質(zhì)量百分濃度為的溶液；將所述溶液分別與60μ 1濃度為 1 X 1012VP/ml的腺病毒混懸液混合，得到腺病毒/殼聚糖混合液、腺病毒/殼聚糖-聚乙二 醇混合液、腺病毒/殼聚糖-葉酸混合液、腺病毒/殼聚糖-聚乙二醇-葉酸混合液，將上 述混合液按照體積比為1 :1:1: 1的比例再次全部混合后進(jìn)行靜電紡絲，其中，所述靜 電紡絲的電紡系統(tǒng)(NNC-ESP 200，Nano NC, Seoul, Korea)的參數(shù)如下電壓15KV、溶液流 速5mL/h、針尖到磷酸三甲苯脂(TPP)接收池的接收距離5cm，接收后緩慢攪動(dòng)20min，再進(jìn) 行離心濃縮除去未反應(yīng)的物質(zhì)，得到腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料，于4°C下儲(chǔ)存。實(shí)踐證明，利用本發(fā)明的方法制備的腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料對(duì)肝臟的毒性 低，且具有靶向功能，其中，腺病毒被有效包裹，但其生物活性和傳染性卻沒(méi)有降低，從而實(shí) 現(xiàn)了其在體循環(huán)中延長(zhǎng)活性周期，且提高了靶向部位的局部濃度，另外，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易 于操作，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。
權(quán)利要求
1. 一種腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)聚乙二醇-葉酸縮合物的合成將葉酸、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺按 照1 1 1 1 5 5的摩爾比溶于二甲基亞砜，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下活化6 48小時(shí)，過(guò) 濾后得到活化的葉酸溶液，然后按照葉酸與聚乙二醇的摩爾比為20 1 1 2的比例加 入重均分子量為2000 10000的聚乙二醇，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)1 M小時(shí)，加入丙酮沉淀 后離心除去多余葉酸，上清液用去離子水透析后凍干即得到聚乙二醇-葉酸縮合物；(2)殼聚糖-聚乙二醇縮合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉酸的 合成將低分子量的殼聚糖溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量百分濃度為0. 10%的殼聚糖溶 液，攪拌過(guò)夜；然后在常溫下分別按摩爾比為1 1 1 5 5 1加入聚乙二醇、二氯 乙烷以及N-羥基丁二酰亞胺，按摩爾比為1 1 1 5 5 1加入葉酸、二氯乙烷以 及N-羥基丁二酰亞胺，按摩爾比為1 1 1 5 5 1加入聚乙二醇-葉酸縮合物、 二氯乙烷以及N-羥基丁二酰亞胺，攪拌過(guò)夜，反應(yīng)液分別用去離子水透析，凍干后得到殼 聚糖-聚乙二醇縮合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉酸縮合物，其中， 殼聚糖與聚乙二醇的摩爾比為1 5 5 1，殼聚糖與葉酸的摩爾比為1 5 5 1;(3)腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合物的制備將低分子量殼聚糖、殼聚糖-聚乙二醇縮合 物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉酸縮合物分別在常溫下溶解于磷酸鹽 緩沖液中，制成質(zhì)量百分濃度為的溶液；將所述溶液分別與60 μ 1濃度為lX1012VP/ml 的腺病毒混懸液混合，得到腺病毒/殼聚糖混合液、腺病毒/殼聚糖-聚乙二醇混合液、腺 病毒/殼聚糖-葉酸混合液、腺病毒/殼聚糖-聚乙二醇-葉酸混合液，將上述混合液按照 體積比為1 1 1 1 2 3 2 3的比例再次全部混合后進(jìn)行靜電紡絲，其中，所 述靜電紡絲的參數(shù)如下電壓為10 20KV、溶液流速為2 10mL/h、針尖到磷酸三甲苯脂 接收池的接收距離為5 15cm，接收后緩慢攪動(dòng)10 30min，再進(jìn)行離心濃縮除去未反應(yīng) 的物質(zhì)，得到腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料，于4°C下儲(chǔ)存。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料的制備方法，包括聚乙二醇-葉酸縮合物的合成，殼聚糖-聚乙二醇縮合物、殼聚糖-葉酸縮合物以及殼聚糖-聚乙二醇-葉酸的合成，腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合物的制備等步驟，制得腺病毒-殼聚糖納米復(fù)合材料，通過(guò)對(duì)腺病毒進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)減少其對(duì)肝臟的毒性，降低抗體對(duì)其的抵制；通過(guò)在腺病毒表面的離子交聯(lián)殼聚糖或其與聚乙二醇以及葉酸的縮合物，提供了化學(xué)交聯(lián)位點(diǎn)以及實(shí)現(xiàn)靶向的物質(zhì)，維持了腺病毒的原始生物活性的同時(shí)，也延長(zhǎng)了其在體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間，且不降低其生物活性和傳染性，進(jìn)一步地，還可提高靶向部位的局部濃度，治療效果好且可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模加工生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102091334SQ201010557329
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者李立藏, 申孟芝, 許杉杉, 韓志超 申請(qǐng)人:無(wú)錫中科光遠(yuǎn)生物材料有限公司