專利名稱：雙特異性免疫細(xì)胞因子?？?和-加鎖(dnl)復(fù)合物及其治療性用途的制作方法
雙特異性免疫細(xì)胞因子?？?和-加鎖(DNL)復(fù)合物及其
治療性用途交叉參考相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2010年4月6日提交的第12/7M，740號(hào)美國專利申請(qǐng)；2010年4月 5日提交的第12/7M，140號(hào)美國專利申請(qǐng)；2010年4月1日提交的第12/752，649號(hào)美國專利申請(qǐng)；2010年3月25日提交的第12/731，781號(hào)美國專利申請(qǐng)；2009年12月22日提交的第12/644，146號(hào)美國專利申請(qǐng)；和2009年8月31日提交的第61/238，似4號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。每一個(gè)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)通過引用整體并入本文。政府資助本工作部分由來自美國國立衛(wèi)生研究院的美國國家癌癥研究所的基金 2R44CA108083-02A2支持。聯(lián)邦政府可具有本發(fā)明的某些權(quán)利。領(lǐng)域本發(fā)明涉及雙特異性抗體免疫細(xì)胞因子DNL構(gòu)建體的組合物和使用方法，所述構(gòu)建體包含第一和第二抗體或抗原結(jié)合抗體片段以及一個(gè)或多個(gè)拷貝的細(xì)胞因子。更常見地，本發(fā)明涉及任何DNL構(gòu)建體的組合物和使用方法，在所述構(gòu)建體中使用下面描述的 DDD ( 二聚化和停靠結(jié)構(gòu)域)和AD (錨定結(jié)構(gòu)域)綴合技術(shù)將3種不同效應(yīng)物部分連接在一起。第一和第二抗體或其片段優(yōu)選結(jié)合兩種不同的靶抗原。包含治療性細(xì)胞因子的雙特異性免疫細(xì)胞因子DNL構(gòu)建體的施用將細(xì)胞因子高效地遞送至靶細(xì)胞、組織或器官，同時(shí)允許提高藥代動(dòng)力學(xué)、給藥方案和/或功效。雙特異性免疫細(xì)胞因子構(gòu)建體顯示比單獨(dú)的親代抗體、單獨(dú)的細(xì)胞因子、抗體與細(xì)胞因子的非綴合組合以及綴合至對(duì)照抗體的細(xì)胞因子更強(qiáng)的針對(duì)靶細(xì)胞的效力。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNL構(gòu)建體可包含與抗-CD20 IgG和抗-HLA-DR Fab連接的干擾素-a 2b。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-⑶20IgG是veltuzumab 并且抗-HLA-DR Fab衍生自人源化L243抗體。所述DNL復(fù)合物在體外和體內(nèi)顯示對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞和其它造血癌癥(hematopoietic cancer)的高毒性。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，本發(fā)明的DNL復(fù)合物可包含具有針對(duì)可由任何腫瘤、自身免疫性疾病細(xì)胞或其它患病細(xì)胞表達(dá)的靶抗原的特異性的抗體或抗體片段的任何組合。類似地，本發(fā)明的DNL復(fù)合物可用于遞送用于治療許多種疾病例如癌癥、免疫功能失調(diào)或自身免疫性疾病的任何治療性細(xì)胞因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步了解，本發(fā)明的雙特異性復(fù)合物不限于細(xì)胞因子的遞送，而且還可提供任何治療性蛋白質(zhì)、肽或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它治療性效應(yīng)物部分的高效遞送。
背景技術(shù)：
在美國，2009年有65，980例非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)的新發(fā)病例并且有19，500 人死于該疾病(Jemal等人，CA Cancer J Clin 2009 ；59 :225-49)。約一半NHL患者的一線治療未獲成功并且鮮有治愈的(McLaughlin等人，J Clin Oncol 1998;16:2825-33)。除了 NHL外，還存在20，580例多發(fā)性骨髓瘤(MM)新病例并且有10，580人死于該疾病(Jemal 等人，CA Cancer J Clin 2009 ；59 :225-49)。干擾素-α (IFNa)的臨床活性在NHL治療中得至IJ確定(Amitage等人，Bone Marrow Transplant 2006 ；38 :701-2 ；Ann Oncol 2000 ；11
6359-61)，并且將IFN α添加至利妥昔單抗免疫療法已顯示某些臨床有利方面(Davis等人， Clin Cancer Res 2000 ；6 :2644-52 ；Kimby 等人，Leuk Lymphoma 2008 ；49 :102-12)?？色@得的數(shù)據(jù)表明IFNa提高了 MM患者的無疾病進(jìn)展存活率，但益處很小并且其使用因毒性而仍有爭議(Gisslinger 和 Kees，Wien Klin Wochenschr 2003 ；115 :451-61)。已報(bào)導(dǎo)干擾素-α (IFN α )在癌癥的動(dòng)物模型O^errantini等人，1994，J Immunol 153 :4604-15)和人癌癥患者(Gutterman 等人，1980，Ann Intern Med 93 :399-406)中都具有抗-腫瘤活性。IFNa可產(chǎn)生多種直接抗-腫瘤效應(yīng)，包括癌基因的下調(diào)、腫瘤抑制基因的上調(diào)、經(jīng)增加的腫瘤表面MHC I型蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生的免疫識(shí)別的增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)以及對(duì)化學(xué)治療劑的敏化(Gutterman等人，1994，PNAS USA 91 :1198-205 ；Matarrese等人，2002，Am J Pathol 160 :1507-20 ；Mecchia 等人，2000，Gene Ther 7 :167-79 ；Sabaawy 等人，1999，ht J Oncol 14 :1143-51 ;Takaoka 等人，2003，Nature 424:516-23)。對(duì)于某些腫瘤，IFNci可通過STATl的激活而具有直接且有力的抗-增殖效應(yīng) (Grimley 等人，1998 Blood 91:3017-27)。間接地，IFNa 可抑制血管生成(Sidky 和 Borden, 1987, Cancer Res 47:5155-61)并且刺激宿主免疫細(xì)胞，這對(duì)于總體抗腫瘤反應(yīng)是至關(guān)重要的但一直被大大低估(Belardelli等人，1996，Immunol Today 17:369-72)。 IFNa 通過對(duì)髓樣細(xì)胞(Raefsky 等人，1 985，J Immunol 135 :2507-1 2 ;Luft 等人，1998， J Immunol 161 :1947-53)、T 細(xì)胞(Carrero 等人，2006，J Exp Med 203 :933-40 ；Pilling 等人，1999，Eur J Immuol 29:1041-50)和 B 細(xì)胞(Le 等人，2001，Immunity 14:461-70) 的效應(yīng)而具有對(duì)免疫反應(yīng)的多效性影響。作為天然免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑，IFNa誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的快速分化和活化(Belardelli 等人，2004，Cancer Res 64 :6827-30 ；Paquette 等人，1998，J Leukoc biol 64 :358-67 ；Santini 等人，2000，J Exp med 191 :1777-88)并且增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性、遷移、細(xì)胞因子產(chǎn)量和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC) (Biron等人， 1999，Annu Rev Immunol 17 :189-220 ；Brunda 等人 1984，Cancer Res 44 :597-601)。IFNa作為癌癥治療劑的希望一直以來主要因其短暫的循環(huán)半衰期和全身性毒性而受到阻礙。IFNa 2的PEG化形式顯示增加的循環(huán)時(shí)間，這增加了它們的生物功效(Harris 禾口 Chess，2003，Nat Rev Drug Discov 2 :214-21 ;0sborn 等人，2002，J Pharmacol Exp Ther 303:540-8)。IFNa與單克隆抗體(MAb)的融合可提供與PEG化相似的益處，包括減少的腎清除率、提高的溶解度和穩(wěn)定性以及顯著增加的循環(huán)半衰期。該融合的直接臨床益處是需要更低的頻率和更低的劑量，從而允許延長的治療濃度。使用針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的MAb將IFNa靶向腫瘤可顯著增加其腫瘤粘連 (accretion)和貯留(retention)同時(shí)限制其全身性濃度，從而增加治療指數(shù)。IFNa的增加的腫瘤濃度可增加其直接抗增殖、細(xì)胞凋亡和抗-血管生成活性，以及引發(fā)和集中抗腫瘤免疫反應(yīng)。事實(shí)上，使用同基因型鼠IFNa-分泌性轉(zhuǎn)基因腫瘤的小鼠的研究顯示了由IFNa的局部濃度引發(fā)的增強(qiáng)的免疫反應(yīng)O^errantini等人，2007，Biochimie 89 884-93)。⑶20是用于使用MAb-IFNa進(jìn)行的B細(xì)胞淋巴瘤的治療的吸引人的候選TAA。 利用利妥昔單抗的抗-CD20免疫療法是抗淋巴瘤的最成功療法之一，其具有相對(duì)低的毒性(McLaughlin等人，1998，J Clin Oncol 16:2825-33)。由于利妥昔單抗是可在某些患者群體中顯示免疫原性并且對(duì)于最初施用具有相當(dāng)長的輸注時(shí)間的嵌合抗體(Cheson等人，2008，NEJM 359 :613-26)，所以更好的用于CD20-靶向的候選物是人源化MAb， veltuzumab (Stein 等人，2004，Clin Cancer Res 10:2868-78)。目前處于臨床評(píng)定下的使用利妥昔單抗和IFNa的聯(lián)合治療已顯示高于單獨(dú)的利妥昔單抗的提高的功效(Kimby等人，2008，Leuk Lymphoma 49 :102-12 ;Salles等人， 2008, Blood 112:4824-31)。這些研究顯示該組合的某些有利方面以及與IFN α相關(guān)的缺點(diǎn)。除了每周一次利用利妥昔單抗的輸注外，患者通常還要在數(shù)月時(shí)間中每周施用IFNa 3 次，遭受流感樣癥狀，所述癥狀為與IFNa療法相關(guān)的常見副作用并且限制可耐受劑量?？贵w-IFNa綴合物可允許以更少的劑量以更低的頻率施用單一試劑，限制或消除了副作用， 并且可產(chǎn)生高得多的功效。然而，幾乎不表達(dá)或不表達(dá)⑶20的淋巴瘤和白血病預(yù)期對(duì)利用免疫綴合的抗-CD20-IFNci構(gòu)建體的治療有抗性。在本領(lǐng)域存在對(duì)可將IFN-α或其它治療性細(xì)胞因子靶向兩種或更多種不同的腫瘤相關(guān)抗原例如CD20和HLA-DR，提供更有效的抗許多種造血惡性腫瘤和其它惡性腫瘤的治療的雙特異性免疫細(xì)胞因子構(gòu)建體的需要。人白細(xì)胞抗原-DR(HLA-DR)是主要組織相容性復(fù)合體(MHC) II型抗原的3種同種型之一。HLA-DR在多種造血惡性腫瘤和某些實(shí)體瘤上高度表達(dá)，并且已被活躍地用于基于抗體的淋巴瘤治療(Brown 等人，2001，Clin Lymphoma 2 :188-90 ;DeNardo 等人，2005， Clin Cancer Res 11 :7075s_9s ;Stein 等人，2006，Bloood 108:2736-44)。初步研究顯示抗-HLA-DR mAb在淋巴瘤、白血病和多發(fā)性骨髓瘤的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中比具有當(dāng)前臨床益處的其它裸mAb明顯更有效力(Stein等人，未公布的結(jié)果)。HLA-DR也在一組正常免疫細(xì)胞(包括B細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、郎格爾漢斯細(xì)胞、樹突細(xì)胞和活化的T細(xì)胞)上表達(dá)(Dechant 等人，2003，Semin Oncol 30 :465-75)。MM本發(fā)明涉及包含三種或更多種不同效應(yīng)物部分例如抗原、抗體片段和細(xì)胞因子的停靠-加鎖(DNL)構(gòu)建體(復(fù)合物)的組合物及使用方法。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道DNL 構(gòu)建體不限定于此并且使用的效應(yīng)物部分可包含可被連接至DDD或AD部分的任何蛋白質(zhì)、 肽或其它分子。用于DNL構(gòu)建體中的效應(yīng)物部分包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、抗體、抗體片段、 免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子、激素、酶、反義寡核苷酸例如siRNA、毒素例如核糖核酸酶、異種抗原、聚乙二醇(PEG)和其它聚合物、抗-血管生成劑、細(xì)胞毒素劑、促細(xì)胞凋亡劑和其它已知的治療劑。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包含三種不同效應(yīng)物部分-第一和第二抗體或抗體片段以及一個(gè)或多個(gè)拷貝的細(xì)胞因子的DNL構(gòu)建體。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNL構(gòu)建體包含抗-⑶20抗體，例如veltuzumab、抗-HLA-DR抗體片段例如hL243和細(xì)胞因子例如 IFN- α 2b。此類DNL構(gòu)建體對(duì)于造血惡性腫瘤和表達(dá)⑶20、HLA-DR或兩者的其它腫瘤的治療是高度有效的。雖然多功能復(fù)合物的每一種組分(veltuzumab、抗-HLA-DR Fab和 IFN-α 2b)獨(dú)立地具有抗-腫瘤活性，但所述組合的構(gòu)建體顯示比任何單一成分或以未綴合的形式施用的單一成分的混合物更大的功效。在具體的實(shí)施方案中，DNL構(gòu)建體可包含人源化抗-HLA-DR抗體或其片段，例如 hL243抗體，其包含連接至人抗體構(gòu)架(FR)和恒定區(qū)序列的重鏈⑶R序列⑶Rl (NYGMN, SEQ ID NO :1)、CDR2 (WINTYTREPTYADDFKG, SEQ ID NO 2)和 CDR3 (DITAVVPTGFDY, SEQ ID NO 3)以及輕鏈 CDR 序歹Ij CDRl (RASENIYSNLA, SEQ ID NO :4)、CDR2 (AASNLAD，SEQ ID NO 5)禾口
8⑶R3 (QHFWTTPWA，SEQ ID NO :6)(參見人，例如，第7，612，180號(hào)美國專利，其實(shí)施例部分通過引用并入本文)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化L243抗體還可包含來自鼠L243 (mL243) 重鏈的替代的構(gòu)架殘基27、38、46、68和91的一個(gè)或多個(gè)殘基和/或來自mL243輕鏈的替代的構(gòu)架殘基37、39、48和49的一個(gè)或多個(gè)殘基。可在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville， MD (參見登錄號(hào)ATCCHB55)獲得mL243。在其它具體的實(shí)施方案中，DNL構(gòu)建體可包含人源化抗-CD20抗體或其片段，例如 veltuzumab，其包含輕鏈可變區(qū) CDR1(RASSSVSYIH，SEQ ID NO 7) ；CDR2 (ATSNLAS，SEQ ID NO 8)；和 CDR3 ^jQWTSNPPT，SEQ ID NO 9)；以及重鏈可變區(qū) CDRl (SYNMH，SEQ ID NO: 10)； CDR2(AIYPGNGDTSYNQKFKG，SEQ ID NO 11)和 CDR3(STYYG⑶WYFDV 或 VVYYSNSYWYFDV，SEQ ID NO 12)(參見，例如，第7，435，803號(hào)美國專利，其實(shí)施例部分通過引用并入本文)。在更具體的實(shí)施方案中，DNL構(gòu)建體可包含人IFN-α 2b氨基酸序列。包含此類序列的克隆可從多個(gè)來源商購獲得，例如全長人IFNa 2b cDNA克隆(Ultimate ORF人克隆 cat# HORFOlClone IDI0H35221, Invitrogen,Carlsbad, CA) 在各種實(shí)施方案中，DNL構(gòu)建體可包含一種或多種結(jié)合除⑶20和/或HLA-DR外的抗原的抗體或其片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原可選自碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、 CSAp, CDU CDla, CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、 CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、 CD46、CD52、CD54, CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、 CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA, CEACAM5、CEACAM-6、B7、纖連蛋白的 ED-B、 因子H、FHL-l、Flt-3、葉酸受體、GR0B、HMGB-1、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、ΗΜ1. Μ、胰島素樣生長因子-1 (ILGF-I)、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、 IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-l、MIP_lA、 MIP-1B、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、NCA-95、NCA-90、la、HMl. 24, EGP-I、 EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le (y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、 腫瘤壞死抗原、TNF- α、TRAIL 受體(Rl 和 R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、補(bǔ)體因子 C3、C3a、C3b、 C5a、C5和癌基因產(chǎn)物?？衫玫氖纠钥贵w包括但不限于hRl (抗-IGF_1R，2010年12月3日提交的第12/722，645號(hào)美國專利申請(qǐng))、hPAM4 (抗-粘蛋白，第7，282’ 567號(hào)美國專利)、 hA20 (抗-CD20，第 7，251，164 號(hào)美國專利)、hA19 (抗-CD19，第 7，109，304 號(hào)美國專利)、 hIMMU31 (抗-AFP，第 7，300, 655 號(hào)美國專利)、hLLl (抗-CD74，第 7，312，318 號(hào)美國專利)、 hLL2 (抗-CD22，第 7，074，403 號(hào)美國專利)、hMu_9 (抗-CSAp，第 7，387，773 號(hào)美國專利)、 hL243 (抗-HLA-DR，第 7，612，180 號(hào)美國專利)、hMN_14 (抗-CEACAM5，第 6，676，924 號(hào)美國專利)、hMN-15 (抗-CEACAM6，第 7，541，440 號(hào)美國專利)、hRS7 (抗-EGP-1，第 7，238，785 號(hào)美國專利)和hMN-3 (抗-CEACAM6，第7，541, 440號(hào)美國專利申請(qǐng))，每一個(gè)引用的專利或申請(qǐng)的實(shí)施例部分通過引用并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，該列表不是限制性的并且可使用任何已知的抗體，如在下面更詳細(xì)地論述的。可被整合進(jìn)入DNL構(gòu)建體的示例性細(xì)胞因子包括但不限于MIF (巨噬細(xì)胞游走抑制因子)、HMGB-1 (高遷移率族框蛋白 1) >TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL_7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15, IL-16、IL-17, IL-18, IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-U RANTES, MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-U IP-10、Gro-β、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)、干擾素-α、-β、-λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt_3 配體、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、P1GF、胰島素、 hGH、降鈣素、因子VIII、IGF、促生長素抑制素、組織型纖溶酶原激活物和LIF。每一個(gè)引用的細(xì)胞因子的人形式的序列在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參見例如NCBI數(shù)據(jù)庫)并且編碼許多示例性細(xì)胞因子的克隆可從hvitrogen、美國典型培養(yǎng)物保藏中心和本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它來源商購獲得。多種實(shí)施方案可涉及本發(fā)明的DNL構(gòu)建體用于治療或診斷疾病的用途，所述疾病包括但不限于非-何杰金氏淋巴瘤、B細(xì)胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、多毛細(xì)胞白血病，急性和慢性髓樣白血病、T細(xì)胞淋巴瘤和白血病、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、癌癥、黑素瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和皮膚癌。癌癥可選自口腔癌、胃腸道癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、膽囊癌、腎癌、皮膚癌和睪丸癌。此外，本發(fā)明的 DNL構(gòu)建體可用于治療自身免疫性疾病例如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham' s chorea)、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風(fēng)濕熱、多腺性綜合征、大皰性類天皰瘡、糖尿病、亨-舍二氏紫癜 (Henoch-Schonlein purpura)、鏈球菌感染后白勺 1H^炎(post-streptococcal nephritis) > 結(jié)節(jié)性紅斑、高安(氏)動(dòng)脈炎(Takayasu' s arteritis)、艾迪生病(Addison' s disease)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、古德帕斯丘綜合征(Goodpasture' s syndrome)、血栓閉塞性脈管炎(thromboangitisubiteran)、斯耶格倫綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto' s thyroiditis)、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動(dòng)性肝炎、多肌炎/ 皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰瘡、韋格納氏肉芽腫(Wegener' s granulomatisis)、膜性腎病、肌萎縮側(cè)索硬化、脊髓癆、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球腎炎、銀屑病或纖維性肺泡炎。在某些實(shí)施方案中，受試抗體可用于治療白血病例如慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓樣白血病或急性髓樣白血病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可用于治療患有代謝疾病例如淀粉樣變性或神經(jīng)退行性疾病例如阿爾茨海默病的受試者。此外，本發(fā)明的藥物組合物可用于治療患有免疫失調(diào)障礙的受試者。附圖簡述下列附圖形成本說明書的部分并且被用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案。通過參考與本文中提供的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述結(jié)合的這些附圖的一個(gè)或多個(gè)，可更好地理解所述實(shí)施方案。

圖1.顯示細(xì)胞因子-MAb DNL構(gòu)建體與PEG化或天然IFNa相比較的體外IFNa活性。如實(shí)施例中所述測量的比活性(IU/pmol)。從rhIFNa 2b標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷已知濃度的每一種試驗(yàn)品的活性。在濃度遞增的 20-2b ( · )、734-2b ( ■ )、v-mab (〇)、V-mab+734_2b ( □)、 PEGASYS ( ▼ )、PEG-Intron (A )或lR4b( ▽)存在的情況下生長培養(yǎng)物，并且利用MTS 測量相對(duì)活細(xì)胞密度。將獲自未處理的細(xì)胞的信號(hào)％對(duì)摩爾濃度的對(duì)數(shù)作圖。使用I^rism 軟件產(chǎn)生劑量-反應(yīng)曲線和EC5tl值。誤差棒，SD。(A)基于細(xì)胞的報(bào)告基因測定。(B)利用
10EMC病毒和A549細(xì)胞的病毒保護(hù)測定。(C)使用Daudi細(xì)胞的體外淋巴瘤增殖測定。(D) 使用Jeko-I細(xì)胞的體外淋巴瘤增殖測定。圖2.顯示Swiss-Webster小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果。給小鼠施用20_2b、 α 2b-413、佩樂能(PEGINTR0N)或派羅欣(PEGASYS)，并且在96個(gè)小時(shí)內(nèi)中利用ELISA分析血清樣品的IFNc^b濃度。顯示血清消除曲線。血清半衰期(T1/2)消除速率和平均滯留時(shí)間(MRT)概述于插入的表中。圖3. (A)舉例說明20_2b的ADCC效應(yīng)子功能。在細(xì)胞裂解的定量之前，在新鮮分離的PBMC存在的情況下，利用5 μ g/ml的20_2b、22_2b、v_mab、依帕珠單抗(e_mab)或 h734溫育Daudi或Raji細(xì)胞4小時(shí)。(B)顯示20-2B的⑶C效應(yīng)子功能。在人補(bǔ)體存在的情況下，利用系列稀釋的20-2b ( · )、734-2b ( ■)或v-mab (〇)溫育Daudi細(xì)胞。將補(bǔ)體對(duì)照％ (與只利用補(bǔ)體處理的細(xì)胞相比較的測試樣品的活細(xì)胞的數(shù)目)對(duì)nM濃度的對(duì)數(shù)作圖。誤差棒，SD。圖4.顯示20_2b增強(qiáng)來自全血的NHL細(xì)胞的消耗。將新鮮的肝素化人血與Daudi 或 Ramos 混合并且利用 0. 01,0. 1 或 InM 的 20_2b ( · )、v-mab (〇)、734_2b ( ■)或 v-mab+734-2b ( □)溫育2天。使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估所示處理對(duì)淋巴瘤和外周血淋巴細(xì)胞的作用。誤差棒，SD。圖5. (A)舉例說明顯示20- 在播散性伯基特淋巴瘤(disseminated Burkitt's lymphoma) (Daudi)異種移植模型中的治療功效。在第0天給雌性C. B. 17 SCID小鼠靜脈內(nèi)施用Daudi細(xì)胞。處理由以單次皮下劑量提供的20-2b( · )、734-2b( ■ )、v-mab ( O )、 PEGASYS( ▼)或鹽水(X)組成。處理的天數(shù)用箭頭指示。使用Prism軟件分析存活曲線。 在早期Daudi模型中。在第1天給10只小鼠的組施用0. 7pmol (實(shí)線)或0. 07pmol (虛線)的單次劑量。(B)顯示與圖6(A)的相似但在晚期Daudi模型中進(jìn)行的研究。在第7天給10只小鼠的組施用0. 7pmol (實(shí)線)、7pmol (虛線)或70pmol (灰色線)的單次劑量。圖6. (A)顯示20_2b在播散性伯基特淋巴瘤(Raji和NAMALWA)異種移植模型中的治療功效的存活曲線。在第0天給雌性C. B. 17SCID小鼠靜脈內(nèi)施用NHL細(xì)胞。處理由以皮下劑量給予的20-2b ( · )、734-2b ( ■ ) ,v-mab (〇)或鹽水(X)組成。處理的天數(shù)用箭頭指示。使用I^rism軟件分析存活曲線。在晚期Raji模型中。10只小鼠的組在第5、7、 9、12、14和16天接受250pmol的劑量。(B)顯示與圖7(A)的相似但在早期NAMALWA模型中的研究。6只小鼠的組在第1、3、5、8、10和127天接受250pmol劑量的20_2b或734_2b 或在第1、5、9、13、17、21和25天接受3. 5nmol劑量的v-mab。圖7.顯示使用EPO標(biāo)準(zhǔn)、7;34-EPO或EP0-DDD2處理72小時(shí)的TFl細(xì)胞的EPO活性的基于細(xì)胞的測定的結(jié)果。使用Graph Pad Prism軟件產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線和EC5tl值。圖8. 20-C2-2b的生物活性。A和B，顯示MAb和MAb-IFN α對(duì)活NHL細(xì)胞(Raji 或RL)的結(jié)合的間接免疫熒光。在用PE-綴合的山羊-抗人Fc探測之前，在5ηΜ(Α)或 0. 2-50ηΜ⑶的所示構(gòu)建體存在的情況下于4°C溫育細(xì)胞1小時(shí)。MFI，平均熒光強(qiáng)度；誤差棒，95% Cl。(C)使用基于細(xì)胞的報(bào)告基因測定法測定的IFNa 2比活性顯示為IU/pmol的完整分子和IU/pmol的IFNa 2b。圖9. NHL和匪細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。在利用流式細(xì)胞數(shù)定量膜聯(lián)蛋白_V_陽性細(xì)胞％ 之前處理細(xì)胞 48 小時(shí)。(A)對(duì)于 Daudi v-mab 和 hL243 Y 4p 為 IOpM ；20-C2-2b、20-2b_2b和 V+LM3+2b (v-mab、hL243 γ 4ρ 和 7!M-2b-2b 的混合物)為 ΙρΜ。對(duì)于 Jeko-I，全部處理在 0. 5nM 上進(jìn)行。(B)以 1、0. 1 和 0. OlnM 處理 CAG。(C)以 20 和 2nM 處理 KMS12-BM。V+L243， v-mab 和 hL243 γ 4ρ 的混合物；L243+2b、hL243 γ 4ρ 和 734_2b_2b 的混合物。圖10.多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的表征。(A)所選擇的骨髓瘤細(xì)胞系上的HLA-DR和 ⑶20的抗原密度。在利用hL243 y 4p、v-mab或hMN_14(同種型對(duì)照MAb)溫育30分鐘后， 利用PE-山羊抗-人IgG(Fab)探測細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。(B)黑素瘤細(xì)胞系對(duì) IFN α 2的相對(duì)敏感性。在利用MTS定量活細(xì)胞之前，在3ηΜ聚乙二醇干擾素α -2b存在或不存在的情況下溫育細(xì)胞4天。圖11.多發(fā)性骨髓瘤的體外細(xì)胞毒性。在濃度遞增的所示構(gòu)建體或組合存在的情況下培養(yǎng)所示細(xì)胞系，利用MTS測量相對(duì)活細(xì)胞密度。將獲自未處理的細(xì)胞的信號(hào)％對(duì)摩爾濃度的對(duì)數(shù)作圖。使用I^rism軟件產(chǎn)生劑量-反應(yīng)曲線和EC5tl值。誤差棒，SD。圖12.增強(qiáng)的來自全血的NHL細(xì)胞的消耗。將新鮮的肝素化人血與Daudi混合， 與InM的所示Mab-IFN α或MAb —起溫育2天。利用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估對(duì)Daudi、B細(xì)胞、T 細(xì)胞和單核細(xì)胞的作用。誤差棒，SD。發(fā)明詳述定義除非另外明確地指出，否則〃 一〃或〃 一個(gè)〃可指“一個(gè)或多個(gè)”。本文所使用的術(shù)語“和”與“或”可用于合取(conjunctive)或析取 (disjunctive) 0也就是說，除非另有說明，否則這兩個(gè)術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解為等同于“和/或”?！爸委焺笔强捎糜谥委熂膊〉脑印⒎肿踊蚧衔?。治療劑的實(shí)例包括抗體、抗體片段、肽、藥物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、小干擾RNA(SiRNA)、螯合劑、硼化合物、光敏劑、染料和放射性同位素?！霸\斷劑”是可用于診斷疾病的原子、分子或化合物。有用的診斷劑包括但不限于放射性同位素、染料(例如帶有生物素-鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合物)、造影劑、熒光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增強(qiáng)劑(例如順磁離子)。本文所使用的“抗體”是指全長(即天然存在的或經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)免疫球蛋白基因片段重組方法而形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特異性結(jié)合)部分，如抗體片段?！翱贵w”包括單克隆抗體、多克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體?！奥憧贵w”是未與治療劑或診斷劑連接的抗體或其抗原結(jié)合片段。完整裸抗體的 Fc部分可提供效應(yīng)子功能，例如補(bǔ)體結(jié)合和ADCC(參見，例如，Markrides, Pharmacol Rev 50:59-87,1998)。裸抗體籍以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的其它機(jī)制可包括細(xì)胞凋亡。(Vaswani和 Hamilton, Ann Allergy Asthma Immunol 81 :105-119,1998.)?！翱贵w片段”是完整抗體的部分，例如F (ab' )2、Fab'、Fab、Fv、sFv、scFv等。無論其結(jié)構(gòu)如何，抗體片段所結(jié)合的抗原與完整抗體所識(shí)別的抗原相同?？贵w片段包括由可變區(qū)組成的分離的片段(例如由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段)或重組單鏈多肽分子(其中輕鏈和重鏈可變區(qū)由肽連接體連接(“scFv蛋白”))?！皢捂溈贵w”(通常縮寫為 "scFv")由包含相互作用以形成抗原結(jié)合部位的Vh和八結(jié)構(gòu)域的多肽鏈組成。Vh和八結(jié)構(gòu)域通常由1至25個(gè)氨基酸殘基的肽連接?？贵w片段還包括雙鏈抗體、三鏈抗體和單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)。如果所施用的劑量具有生理上的意義時(shí)，就可以說是以“治療有效量”施用抗體或免疫綴合物制劑或本文所述的組合物。如果試劑的存在導(dǎo)致受體受試者的生理狀態(tài)的可檢測的變化，則該試劑就具有生理上的意義。在具體的實(shí)施方案中，如果抗體制劑的存在引起抗腫瘤反應(yīng)或減輕自身免疫性疾病狀態(tài)的體征和癥狀時(shí)，該抗體制劑就具有生理上的意義。生理意義的效果也可以是誘發(fā)受體受試者的體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致靶細(xì)胞的生長抑制或死亡。?？亢图渔i(DNL)法“?？?和-加鎖”(DNL)法利用cAMP依賴的蛋白激酶(PKA)的調(diào)節(jié)(R)亞基與A-激酶錨定蛋白(AKAP)的錨定結(jié)構(gòu)域(AD)之間發(fā)生的特定的蛋白質(zhì)間相互作用(Baillie 等人，F(xiàn)EBS Letters. 2005 ;579 :3264. Wong 和 kott，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 959)。PKA(在被最詳盡研究的通過第二信使cAMP與R亞基的結(jié)合觸發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一中起著主要作用)于1968年首次從兔子分離(Walsh等人，J.Biol. Chem. 1968 ；243 3763)。全酶的結(jié)構(gòu)由兩個(gè)催化亞基組成，這兩個(gè)亞基通過R亞基維持無活性形式(Taylor, J. Biol. Chem. 1989 ；264 :8443)。發(fā)現(xiàn)PKA的同功酶類具有兩類R亞基(RI 和 RII)，并且每一類具有 α 和 β 同種型(Scott, Pharmacol. Ther. 1991 ；50 :123)。R 亞基只以穩(wěn)定的二聚體被分離，而且已顯示二聚化結(jié)構(gòu)域由前44個(gè)氨基端殘基組成(Newlon等人，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222)。cAMP與R亞基的結(jié)合導(dǎo)致用于廣譜絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的活性催化亞基的釋放，所述釋放通過PKA經(jīng)由其與AKAP的?？康膮^(qū)室化被定向至所選擇的底物(Scott 等人，J. Biol. Chem. 1990 ；265 ；21561)。由于第一 AKAP，微管締合蛋白2，于1984年得以表征(Lohmann等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984 ；81 :6723)，在酵母至人類的物種范圍中已鑒定出了超過50種具有不同結(jié)構(gòu)的定位至不同亞細(xì)胞位置(包括質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))的 AKAP(Wong 和 Scott,Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 :959)。PKA 的 AKAP 的 AD 是 14-18個(gè)殘基的兩親性螺旋(Carr等人，J. Biol. Chem. 1991 ；266 :14188)。AD的氨基酸序列在個(gè)體AKAP中是相當(dāng)多變的，所報(bào)道的對(duì)RII 二聚體的結(jié)合親和力范圍為2至90nM(Alto 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA. 2003 ； 100 :4445)。有趣地，AKAP 將只結(jié)合二聚 R 亞基。對(duì)于人RII，AD結(jié)合由23個(gè)氨基末端殘基形成的疏水表面(Colledge和kott，Trends Cell Biol. 1999 ；6 216) ο因此，人RII α的二聚化結(jié)構(gòu)域和AKAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域都位于相同的N 末端 44 個(gè)氨基酸序列中(Newlon 等人，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222 ；Newlon 等人，EMBO J. 2001 ；20 :1651)，所述氨基酸序列在本文中稱為DDD。作為連接模塊(Linker Module)的人RII α的DDD和AKAP的AD我們已開發(fā)了這樣的平臺(tái)技術(shù)，其利用人RII α的DDD和AKAP蛋白的AD作為一對(duì)優(yōu)良的連接模塊以用于將在下文中稱為A和B的實(shí)體的任何組合?？恐练枪矁r(jià)復(fù)合物中， 非共價(jià)復(fù)合物可通過將半胱氨酸殘基引入DDD和AD兩者的戰(zhàn)略位置上以促進(jìn)二硫鍵的形成而進(jìn)一步鎖入穩(wěn)定束縛的結(jié)構(gòu)中?！巴？?和-加鎖”法的一般方法如下。通過將DDD序列與A的前體連接(結(jié)果產(chǎn)生在下文中稱為a的第一組分)來構(gòu)建的實(shí)體A。因?yàn)镈DD序列可引起二聚體的自發(fā)形成，因此A可由 組成?？赏ㄟ^將AD序列與B的前體連接(結(jié)果產(chǎn)生在下文中稱為b的第二組分)來構(gòu)建實(shí)體B。 中包含的DDD的二聚基元可產(chǎn)生用于與b中包含的AD序列結(jié)合的?？课稽c(diǎn)，從而促進(jìn)％與b的容易締合以形成由a2b組成的三聚復(fù)合物。這樣的結(jié)合事件因后續(xù)反應(yīng)而不可逆地進(jìn)行，所述后續(xù)反應(yīng)通過二硫橋共價(jià)保護(hù)了所述兩個(gè)實(shí)體，所述反應(yīng)基于有效的局部濃縮的原理非常有效地發(fā)生，因?yàn)槠鹗冀Y(jié)合相互作用應(yīng)當(dāng)使置于DDD和AD上的反應(yīng)性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 2001 ；98 8480)以便進(jìn)行位點(diǎn)特異性連接。雖然在某些實(shí)施方案中，％亞基可包含兩個(gè)相同的效應(yīng)物部分，但在下文中描述的優(yōu)選的實(shí)施方案中，％亞基可包含不同的效應(yīng)物部分，每一個(gè)效應(yīng)物與相同的DDD序列連接。因此，三聚 b復(fù)合物可包含三種不同的效應(yīng)物部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞因子DNL構(gòu)建體可基于a2b結(jié)構(gòu)的變化，其中第一和第二效應(yīng)物與DDD部分連接并且第三效應(yīng)物與AD部分連接。每一個(gè)AD部分能夠結(jié)合以二聚體形式存在的兩個(gè)DDD部分。通過連接遠(yuǎn)離前體的官能團(tuán)的DDD和AD，此類位點(diǎn)特異性連接也預(yù)期保持前體的原始活性。該方法本質(zhì)上是模塊并且潛在地可用于位點(diǎn)特異性和共價(jià)地連接許多種物質(zhì)。DNL法公開于第7，550，143號(hào)；第7，521，056號(hào)；第76，534，866 號(hào)；第7，527，787號(hào)和第7，666，400號(hào)美國專利中，每一個(gè)專利的實(shí)施例部分通過引用并入本文。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，效應(yīng)物部分是可與DDD或AD部分連接與形成融合蛋白或肽的蛋白質(zhì)或肽，更優(yōu)選抗體、抗體片段或細(xì)胞因子。用于制備融合蛋白的多種方法是已知的，包括核酸合成、雜交和/或擴(kuò)增以產(chǎn)生編碼目的融合蛋白的合成雙鏈核酸。可利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(參見，例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A laboratory manual, 第2版，1989)將此類雙鏈核酸插入用于融合蛋白產(chǎn)生的表達(dá)載體。在此類優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將AD和/或DDD部分與效應(yīng)蛋白或肽的N末端或C末端連接。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道，AD或DDD部分至效應(yīng)物部分的連接的位點(diǎn)可取決于效應(yīng)物部分的化學(xué)性質(zhì)而變化，并且效應(yīng)物部分的部分牽涉其生理活性。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，AD或DDD部分至抗體或抗體片段的連接可在重鏈亞單位的C末端、來自抗原結(jié)合部位的分子的相對(duì)末端上發(fā)生。然而，如下文中所論述的，也可使用至抗體或抗體片段的N末端連接，同時(shí)保持抗原結(jié)合活性?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)例如使用二價(jià)交聯(lián)試劑和/或其它化學(xué)綴合技術(shù)來進(jìn)行多種效應(yīng)物部分的位點(diǎn)特異性連接。DDD和AD序列變體在某些實(shí)施方案中，整合入免疫細(xì)胞因子DNL復(fù)合物的AD和DDD序列包含下文中的DDDl和ADl的氨基酸序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，AD和DDD序列包含DDD2和AD2的氨基酸序列，所述序列經(jīng)設(shè)計(jì)促進(jìn)DDD與AD部分之間二硫鍵的形成。DDDlSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :13)DDD2CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :14)ADlQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO :15)AD2CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO :16)
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本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)了解，DDDl和DDD2包含蛋白激酶A的人RII α形式的DDD序列。然而，在可選擇的實(shí)施方案中，DDD和AD部分可基于蛋白激酶AWARIIa形式的DDD 序列和相應(yīng)的AKAP序列，如下文中的DDD3、DDD3C和AD3中所舉例說明的。DDD3SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO :17)DDD3CMSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO :18)AD3CGFEELAffKIAKMIffSDVFQQGC(SEQ ID NO :19)還可設(shè)計(jì)和利用基于已知的人RI β和RII β氨基酸序列的其它可選擇的DDD部分(參見，例如，NCBI登錄號(hào)ΝΡ_001158233和ΝΡ_002727，下文中的序列)。人PKA RI β氨基酸序列MASPPACPSE EDESLKGCEL YVQLHGIQQV LKDCIVHLCI SKPERPMKFLREHFEKLEKE ENRQILARQK SNSQSDSHDE EVSPTPPNPV VKARRRRGGVSAEVYTEEDA VSYVRKVIPK DYKTMTALAK AISKNVLFAH LDDNERSDIFDAMFPVTHIA GETVIQQGNE GDNFYVVDQG EVDVYVNGEff VTNISEGGSFGELALIYGTP RAATVKAKTD LKLffGIDRDS YRRILMGSTL RKRKMYEEFLSKVSILESLE KffERLTVADA LEPVQFEDGE KIVVQGEPGD DFYIITEGTASVLQRRSPNE EYVEVGRLGP SDYFGEIALL LNRPRAATVV ARGPLKCVKLDRPRFERVLG PCSEILKRNI QRYNSFISLT V (SEQ ID NO 20)人PKA RI β氨基酸序列MSIEIPAGLT ELLQGFTVEV LRHQPADLLE FALQHFTRLQ QENERKGTARFGHEGRTffGD LGAAAGGGTP SKGVNFAEEP MQSDSEDGEE EEAAPADAGAFNAPVINRFT RRASVCAEAY NPDEEEDDAE SRIIHPKTDD QRNRLQEACKDILLFKNLDP EQMSQVLDAM FEKLVKDGEH VIDQGDD⑶N FYVIDRGTFDIYVKCDGVGR CVGNYDNRGS FGELALMYNT PRAATITATS PGALffGLDRVTFRRIIVKNN AKKRKMYESF IESLPFLKSL EFSERLKVVD VIGTKVYNDGEQIIAQGDSA DSFFIVESGE VKITMKRKGK SEVEENGAVE IARCSRGQYFGELALVTNKP RAASAHAIGT VKCLAMDVQA FERLLGPCME IMKRNIATYEEQLVALFGTN MDIVEPTA(SEQ IDNO :21)在其它可選擇的實(shí)施方案中，AD和/或DDD部分的不同序列變體可用于雙特異性免疫細(xì)胞因子DNL復(fù)合物的構(gòu)建。AD與DDD結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系一直是調(diào)查研究的主題。(參見，例如，Burns-Hamuro 等人，2005，Protein Sci 14 :2982-92 ;Carr 等人，2001，J Biol Chem 276 17332-38 ;Alto 等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100 4445-50 ；Hundsrucker 等人，2006，Biochem J 396 :297-306 ;Stokka 等人，2006，Biochem J 400 :493-99 ;Gold 等人，2006，Mol Cell 24 :383-95 ;Kinderman 等人，2006，Mol Cell 24: 397-408，每一個(gè)文獻(xiàn)的完整文本通過引用并入本文)。例如，Kinderman等人Q006)檢驗(yàn)了 AD-DDD結(jié)合相互作用的晶體結(jié)構(gòu)并且得出人DDD序列包含許多保守氨基酸殘基(所述氨基酸殘基在二聚體形成和AKAP結(jié)合中特別
15重要)，在下列的序列中加下劃線。(參見Kinderman等人，2006的圖1，所述文獻(xiàn)通過引用并入本文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在設(shè)計(jì)DDD序列的序列變體中，期望地避免改變?nèi)魏渭酉聞澗€的殘基，然而可對(duì)對(duì)于二聚化和AKAP結(jié)合不太緊要的殘基進(jìn)行保守氨基酸替代。因此，用于構(gòu)建DNL復(fù)合物的潛在可選擇的DDD序列示于下列序列中，其中“X”表示保守氨基酸替代。保守氨基酸序列替代在下文中進(jìn)行更詳細(xì)的論述，但可包括例如天冬氨酸殘基替代谷氨酸殘基或者亮氨酸或纈氨酸殘基替代異亮氨酸殘基等。此類保守氨基酸替代在本領(lǐng)域是公知的。來自蛋白激酶A的人DDD序列SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :13)ΧΧΙΧΙΧΧΧ ΧΧαΧΧΥΧνχν ΧΧΧΧΧΧΙ,νΧΡΧνΧΥΕΧΧ ΧΧΧΧΧ(8Ε0 ID NO :22)Alto等人Q003)進(jìn)行了多種AKAP蛋白的AD序列的生物信息學(xué)分析以設(shè)計(jì)下文中顯示的稱為AKAP-IS的RII選擇性AD序列，其具有0. 4nM的對(duì)DDD的結(jié)合常數(shù)。AKAP-IS 序列被設(shè)計(jì)為結(jié)合PKA的AKAP的肽拮抗劑。其中替代傾向于減少與DDD的結(jié)合的AKAP-IS 序列中的殘基在下列的序列中加下劃線。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)了解，可發(fā)揮DNL構(gòu)建體的功能的變體由下列序列指示，其中“X”是保守氨基酸替代。AKAP-IS 序列QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO: 15)XXXXXAXXIVXXAIXXX(SEQ ID NO :23)類似地，Gold(2006)利用晶體學(xué)和肽篩選來開發(fā)下文中顯示的SuperAKAP-IS序列，其顯示對(duì)PKA的RII同種型的選擇性高出對(duì)RI同種型的選擇性5個(gè)數(shù)量級(jí)。加下劃線的殘基表示相對(duì)于AKAP-IS序列的氨基酸替代的位置，所述替代增加與RII α的DDD部分的結(jié)合。在該序列中，N末端Q殘基被編號(hào)為殘基號(hào)4并且C末端A殘基是殘基號(hào)20。其中可進(jìn)行替代以影響對(duì)RII α的親和力的殘基為殘基8、11、15、16、18、19和20 (Gold等人， 2006)。預(yù)期在某些可選擇的實(shí)施方案中，可用SuperAKAP-IS序列替代AKAP-IS AD部分序列以制備雙特異性免疫細(xì)胞因子DNL構(gòu)建體。可被用于替代AKAP-IS AD序列的其它可選擇的序列示于下文中。加下劃線相對(duì)于AKAP-IS序列的替代。預(yù)期，關(guān)于AKAP-IS序列，AD 部分還可包括額外的N末端殘基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端殘基甘氨酸和半胱氨酸。SuperAKAP-ISQIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO 24)可選擇的AKAP序列QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO 25)QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO 26)QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO 27)Gold等人的圖2公開了下文中顯示的來自多種AKAP蛋白的額外DDD-結(jié)合序列。RII-特異性 AKAPAKAP-KLPLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO 28)AKAP79LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO 29)
AKAP-LbcLIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO :30)RI-特異件 AKAPAKAPceALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO :31)RIADLEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO :32)PV38FEELAffKIAKMIffSDVF(SEQ ID NO :33)Dual-特異件 AKAPAKAP7ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO :34)MAP2DTAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO :35)DAKAPlQIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO :36)DAKAP2LAffKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO :37)Stokka等人Q006)還開發(fā)了下文中顯示的結(jié)合PKA的AKAP的肽競爭劑。所述肽拮抗劑被命名為Ht31、RIAD和PV-38。Ht-31肽顯示更大的對(duì)PKA的RII同種型的親和力，而RIAD和V-38顯示更大的對(duì)RI的親和力。Ht31DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO :38)RIADLEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO :39)PV-38FEELAffKIAKMIffSDVFQQC(SEQ ID NO :40)Hundsrucker等人^)06)還開發(fā)了結(jié)合PKA的AKAP的其它肽競爭劑，具有低至 0. 4nM的對(duì)PKA的RII形式的DDD的結(jié)合常數(shù)。多種AKAP拮抗性肽的序列提供于下文中復(fù)制的Hundsrucker等人的表1中。表IAKAP肽序列AKAPIS表示合成RII亞基結(jié)合肽。所有其它肽衍生自所示AKAP的RII結(jié)合結(jié)構(gòu)域。肽序列AKAPlSQIEYLAKQlVDNAJQQA (SF.Q ID NO 1 5)
AKAPIS-PQTEYLAKQiPDNAIQQA (SEQ ID NO :41)
Ht31KGADIJHHAASRIVDAVIEQVKAAG (SEQ JD NO:42)
HtJl-FKGADLIEEAASRIPDAPIEOVKAAG (SEQ ID NO:43)
ΑΚΛΡ7( -wt-pep PEDAF.LVRLSKRLVENAVLIC4VQQY (SEQ ID NO:44) AKAP7c>-L304T-pep PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (SHQ 1DN0:45) AKAf7ci-l308D-pep FHDAF,L￥RLSKRDVENAVLKAVQQY (SEQ ID NO;46) AJC4P ci-P-pep PEDAELVRLSKRLPEKAVLKAVQQ Y (SEQ ID NO:47) AK/\P7d-FP^pcp FEDAKLVRLSKRLPENAPLKAVQQY (SEQ ID NO;48j AKAP7d'-L314E-pep PEDAELVRLSICRLVtNAVEKAVQQY (SHQ ID NO:49) AKAP1 'pepEFriLDRNEElKRj-XAFQIISQVISFA (SEQ ID M0:50)
AK/\P2-pcpLVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ (SEQ ID KO:511
AKAP5-pepQYRTI,LIFTASS『-VKNAIQLSTRQI, (SEQ fD NO:52)
AKAP9-pepLHKQYQHQLEEEVAICVIVSMSIAFA (SEQ ID NO:55)
AKAP!0-pepNTOEAQEELAWKiAKMiVSDIMQQA (SEQ fD NO:54)
ΛΚAPU-pepVWLDKKAVLAHKlVAEAtiiKAERHL (SEQ ID NO:55j
AKAP12-pepNGILELETKSSKLVQNHQTAVDQF (SEQ ID NO:56)
AKAP14-pepTQDO YHOHLl'OVALALVtD VIN YA (SHQ ID KO:57)
Rab32冊(cè)pepETRAKDNiNIEEAARFLVEKILVNH (SEQ II) NO:58)在不同AKAP蛋白的AD結(jié)構(gòu)域中高度保守的殘基通過參考下列AKAP IS序列在下文中由加下劃線標(biāo)示。除了 C末端丙氨酸殘基的添加外，所述殘基與由Alto等人Q003) 觀察到的相同。(參見Hundsrucker等人Q006)的圖4，將所述文獻(xiàn)通過引用并入本文)。 具有特別高的對(duì)RII DDD序列的親和力的肽拮抗劑的序列是AKAP-IS、AKAP7 δ -wt-pep, AKAP7 δ -L304T-p印和 ΑΚΑΡ7 δ -L308D_p印的序列。AKAP-ISQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO: 15)Carr等人QOO1)檢驗(yàn)了來自人和非人蛋白質(zhì)的不同AKAP結(jié)合DDD序列之間的序列同源性程度并且鑒定了 DDD序列中似乎在不同DDD部分中最高度保守的殘基。這些可通過參考人PKA RIIa DDD序列在下文中由加下劃線標(biāo)示。特別保守的殘基進(jìn)一步由斜體字標(biāo)示。所述殘基與由Kinderman等人Q006)提出的對(duì)于結(jié)合AKAP蛋白重要的那些殘基重疊，但不與其相同。因此，下文中指示潛在的DDD序列，其中“X”表示保守氨基酸替代。SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO 13)XHIXIPXGLXELLQGYTXEVLRXQPXDLVEFAXXYFXXLXEXRX(SEQ ID NO :59)本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)了解，一般而言，這些在來自不同蛋白質(zhì)的DDD和AD序列中高度保守的氨基酸殘基是可以優(yōu)選在產(chǎn)生氨基酸替代中保持恒定的殘基，然而不太高度保守的殘基可以被更容易改變以產(chǎn)生本文中描述的AD和/或DDD序列的序列變體。
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除了 DDD和/或AD部分的序列變體外，在某些實(shí)施方案中，可以優(yōu)選在抗體部分或連接抗體與AD序列的連接體肽序列中弓丨入序列變異。在一個(gè)舉例說明性實(shí)例中，融合蛋白序列的3個(gè)可能變體示于下面。(L)QKSLSLSPGLGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO 60)(A)QKSLSLSPGAGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO 61)(-)QKSLSLSPGGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO 62)氨基酸替代在某些實(shí)施方案中，所公開的方法和組合物可包括具有一個(gè)或多個(gè)替代的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)或肽的產(chǎn)生和使用。可通過取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來最優(yōu)化天然抗體、 嵌合抗體、人源化抗體或人抗體或AD或DDD序列的結(jié)構(gòu)、物理和/或治療特征。例如，眾所周知可通過用親代鼠抗體的相應(yīng)FR氨基酸替代有限數(shù)目的人構(gòu)架區(qū)(FR)氨基酸來改善人源化抗體的功能特征。當(dāng)構(gòu)架區(qū)氨基酸殘基與⑶R殘基十分靠近時(shí)，這種情況尤其正確。在其它情況下，可通過有限數(shù)目的氨基酸替代最優(yōu)化抗體的治療特性，例如對(duì)靶抗原的結(jié)合親和力、抗體與其靶抗原的離解或解離速率或甚至抗體對(duì)CDC(補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性)或ADCC(抗體依賴性細(xì)胞毒性)的誘導(dǎo)的效率。在可選擇的實(shí)施方案中，可進(jìn)一步最優(yōu)化用于產(chǎn)生本發(fā)明的DNL構(gòu)建體的DDD和 /或AD序列，例如以增加DDD-AD結(jié)合親和力。上文中論述了 DDD或AD序列中的潛在序列變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，一般而言，氨基酸替代通常包括用具有相對(duì)相似的性質(zhì)的另一種氨基酸替代氨基酸(即，保守氨基酸替代)。不同氨基酸的性質(zhì)和氨基酸替代對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響一直以來是本領(lǐng)域內(nèi)廣泛研究和知識(shí)的主題。例如，可考慮氨基酸的親水指數(shù)(Kyte&Doolittle，1982，J.Mol. Biol.，157 105-132)。氨基酸的相對(duì)親水特征促成了所得蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這反過來確定了蛋白質(zhì)與其它分子的相互作用。每一種氨基酸基于其疏水性和電荷特征被賦予親水指數(shù)(Kyte&D00little，19^)，這些氨基酸是異亮氨酸(+4. 5)；纈氨酸(+4. 2)；亮氨酸 (+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)； 甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸 (-1.6)；組氨酸(-3. 2)；谷氨酸(-3. 5)；谷氨酰胺(-3. 5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺 (-3. 5)；賴氨酸(-3. 9)；和精氨酸(-4. 5)。在產(chǎn)生保守替代中，其親水性指數(shù)在士2內(nèi)的氨基酸的使用是優(yōu)選的，其親水性指數(shù)在士 1內(nèi)的是更優(yōu)選的，其親水性指數(shù)在士0. 5內(nèi)的是進(jìn)一步更優(yōu)選的。氨基酸替代也可考慮氨基酸殘基的親水性(例如，第4，554，101號(hào)美國專利)。親水性值已被賦予給氨基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸 (+3.0)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)； 脯氨酸("0. 5. +-· 1)；丙氨酸(-0. 5)；組氨酸(-0. 5)；半胱氨酸(-1. 0)；甲硫氨酸(-1. 3)； 纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。用具有相似親水性的其它氨基酸來替代氨基酸是優(yōu)選的。其它考慮包括氨基酸側(cè)鏈的大小。例如，用具有體積大的側(cè)鏈的氨基酸例如色氨酸或酪氨酸替代具有緊湊側(cè)鏈的氨基酸例如甘氨酸或絲氨酸通常不是優(yōu)選的。也要考慮不同氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。通過經(jīng)驗(yàn)研究，不同氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域采取α-螺旋、β-折疊片或反轉(zhuǎn)二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向的影響已被確定并且在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參見，例如，Chou&Fasman，1974,Biochemistry, 13 :222-245 ； 1978,Ann. Rev. Biochem.， 47:251-276 ；1979，Biophys. J. ,26 :367-384)?；谶@樣的考慮和廣泛的經(jīng)驗(yàn)研究，保守氨基酸替代的表達(dá)已被構(gòu)建并且在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。可選擇地Ala(A) leu、ile、val ；Arg (R) gin、 asn、lys ;Asn(N)his、asp、lys、arg、gln ；Asp (D)asn、glu ；Cys (C)ala、ser ；Gln (Q)glu、asn ； Glu(E)gln、asp ；Gly (G) ala ；His(H) asn、gin、lys、arg ；Ile(I)val、met、ala、phe、leu ； Leu (L)val、met、ala、phe、ile ；Lys (K)gin、asn、arg ；Met (M)phe、ile、leu ；Phe (F)leu、val、 ile、ala、tyr ；Pro (P)ala ；Ser(S)、thr ；Thr (T)ser ；Trp(W)phe、tyr ；Tyr (Y)trp、phe、thr、 ser ；Val(V) ile、leu、met、phe、ala0對(duì)于氨基酸替代的其它考慮包括殘基是否位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部或是否暴露于溶劑。 對(duì)于內(nèi)部殘基，保守替代可包括:Asp和Asn ；Ser和Thr ；Ser和Ala ；Thr和Ala ；Ala和 Gly ；Ile 和 Val ；Val 和 Leu ；Leu 和 Ile ；Leu 和 Met ；Phe 和 Tyr ；Tyr 和 Trp.(參見，例如， rockefeller, edu上的PROWL網(wǎng)站)。對(duì)于暴露于溶劑的殘基，保守替代可包括Asp和Asn ； Asp 禾口 Glu ；Glu 禾口 Gln ；Glu 禾口 Ala ；Gly 禾口 Asn ；Ala 禾口 Pro ；Ala 禾口 Gly ；Ala 禾口 Ser ；Ala 禾口 Lys ；Ser 和 Thr ；Lys 和 Arg ；Val 和 Leu ；Leu 和 Ile ；Ile 和 Val ；Phe 和 Tyr. (Id.)。已構(gòu)建多種矩陣來幫助選擇氨基酸替代，例如PAM250評(píng)分矩陣、Dayhoff矩陣、Grantham矩陣、 McLachlan 矩陣、Doolittle 矩陣、Henikoff 矩陣、Miyata 矩陣、Fitch 矩陣、Jones 矩陣、 Rao 矩陣、Levin 矩陣和 Risler 矩陣(Idem.)。在測定氨基酸替代中，也可考慮分子間或分子內(nèi)鍵的存在，例如帶正電荷的殘基 (例如，HiS、Arg、LyS)與帶負(fù)電荷的殘基(例如，Asp、Glu)之間離子鍵的形成或附近半胱氨酸殘基之間二硫鍵的形成。用任何氨基酸替代編碼的蛋白質(zhì)序列中的任何其它氨基酸的方法是公知的并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說只不過是常規(guī)實(shí)驗(yàn)，例如通過定點(diǎn)誘變的技術(shù)或通過合成和裝配編碼氨基酸替代的寡核苷酸，然后將其拼接入表達(dá)載體構(gòu)建體來進(jìn)行。細(xì)胞因子和其它免疫調(diào)節(jié)劑在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，效應(yīng)物部分可以是免疫調(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)劑是當(dāng)存在時(shí)改變、抑制或刺激身體的免疫系統(tǒng)的試劑。使用的免疫調(diào)節(jié)劑可包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素及其組合。特別有用的是淋巴細(xì)胞毒素例如腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子例如白細(xì)胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素例如干擾素-α、_ β或-γ以及干細(xì)胞生長因子例如命名為“Si因子”的干細(xì)胞生長因子。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，效應(yīng)物部分是細(xì)胞因子例如淋巴因子、單核細(xì)胞激活
20素、生長因子和常規(guī)多肽激素。細(xì)胞因子包括生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如卵泡刺激素(FSH)、甲狀腺刺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；胎盤生長因子 (PIGF)、肝細(xì)胞生長因子；前列腺素、成纖維生長因子；催乳素；胎盤催乳素、OB蛋白；腫瘤壞死因子-α和-β ；苗勒抑制物質(zhì)(mullerian inhibiting substance)；鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子例如NGF-β ；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β ；胰島素樣生長因子-I和-II ；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素例如干擾素-α、-β和-γ ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；白介素(II)例如IL_1、IL-I α、IL_2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12 ；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配體或FLT-3、血管生長抑素、血小板反應(yīng)蛋白、內(nèi)皮生長抑素、腫瘤壞死因子(TNF^f^BTNF-a)和LT。蛋白質(zhì)或肽免疫調(diào)節(jié)劑例如細(xì)胞因子的氨基酸序列在本領(lǐng)域是公知的并且任何此類已知的序列可用于實(shí)施本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道關(guān)于細(xì)胞因子序列的公共信息的眾多來源。例如，NCBI數(shù)據(jù)庫包含大量細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑的蛋白質(zhì)和編碼核酸序列， 所述細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑是例如紅細(xì)胞生成素(GenBank NM 000799)、IL-I β (GenPept AAH08678)、GM-CSF (GenP印t AAA52578)、TNF_ α (GenP印t CAA26669)、干擾素-α (GenP印t AAA52716. 1)、干擾素-α 2b (GenP印t AAP20099. 1)和上文中所列的實(shí)際上任何肽或蛋白質(zhì)免疫調(diào)節(jié)劑。鑒定基本上任何目的蛋白質(zhì)或肽效應(yīng)物部分的適當(dāng)?shù)陌被岷?或核酸序列對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)的事情?？贵w和抗體片段用于制備實(shí)際上抗任何靶抗原的單克隆抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。參見， 例如，Kohler 和 Milstein, Nature 256 :495(1975),和 Coligan 等人(編)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第 1 卷，第 2. 5. 1-2. 6· 7 頁(John ffiley&Sons 1991)。簡而言之，可通過如下獲得單克隆抗體用包含抗原的組合物注射小鼠，取出脾臟以獲得B淋巴細(xì)胞，將所述B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的抗體的克隆，培養(yǎng)產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的抗體的克隆以及從雜交瘤培養(yǎng)物分離抗體?？衫枚喾N完善的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物分離和純化MAb。此類分離技術(shù)包括利用蛋白A瓊脂糖的親和層析、大小排阻層析和離子交換層析。參見，例如，第2. 7. 1-2. 7. 12 頁和第 2. 9. 1-2. 9. 3 頁的 Coligan0 此外，參見 Baines 等人，“Purification of Immunoglobulin G(IgG), "in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 10 卷，第 79-104 頁(The Humana Press, Inc.1992)。在初始產(chǎn)生針對(duì)免疫原的抗體后，可測定抗體的序列，隨后通過重組技術(shù)進(jìn)行制備。鼠抗體和抗體片段的人源化和表征對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。衍生自人源化抗體、嵌合抗體或人抗體的抗體成分的使用排除了與鼠恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問題。嵌合抗體嵌合抗體為重組蛋白質(zhì)，其中人抗體的可變區(qū)被例如包括小鼠抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的小鼠抗體的可變區(qū)取代。當(dāng)給受試者施用時(shí)，嵌合抗體顯示出免疫原性降低而穩(wěn)定性增加。用于克隆鼠免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的一般技術(shù)公開于例如Orlandi等人，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 86:3833(1989)中。用于構(gòu)建嵌抗體的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。作為例子，Leung等人，Hybridoma 13:469(1994)通過將編碼鼠 LL2 (抗-⑶22單克隆抗體)的Vk和Vh結(jié)構(gòu)域的DNA序列與分別的人κ和IgG1恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域組合來產(chǎn)生LL2嵌合抗體。人源化抗體用于產(chǎn)生人源化MAb的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(參見，例如，Jones等人，Nature 321 522 (1986)，Riechmann 等人，Nature 332 :323 (1988)，Verhoeyen 等人，Science 239 1534(1988)，Carter 等人，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 89 :4285(1992)，Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12 :437(1992)和 Singer 等人，J. Immun. 150 :2844(1993)) 可通過將小鼠 CDR自小鼠免疫球蛋白的可變重鏈和可變輕鏈轉(zhuǎn)移入人抗體的相應(yīng)可變結(jié)構(gòu)域來人源化嵌合或鼠單克隆抗體。嵌合單克隆抗體中的小鼠構(gòu)架區(qū)(FR)也用人FR序列取代。由于簡單地將小鼠⑶R轉(zhuǎn)移入人FR中通常導(dǎo)致抗體親和力的減少或甚至喪失，因此為了恢復(fù)鼠抗體的原始親和力可能需要額外的修飾。這可通過將FR區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)人殘基用它們的鼠對(duì)應(yīng)物替代以獲得對(duì)其表位具有良好結(jié)合親和力的抗體來實(shí)現(xiàn)。參見，例如Tempest等人， Biotechnology 9 :266(1991)和 Verhoeyen 等人，Science 239 :1534(1988)。通常，與它們的鼠對(duì)應(yīng)物不同并且緊位于或接觸一個(gè)或多個(gè)CDR氨基酸殘基的那些人FR氨基酸殘基可以是替代的候選者。人抗體用組合方法或經(jīng)人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來產(chǎn)生完整人抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，Mancini 等人，2004，NewMicrobiol. 27 :315-28 ；Conrad 和 Scheller,2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8 :117-26 ；Brekke 禾口 Loset,2003, Curr. Opin. Phamaco 1. 3 :544-50)。還可利用基因或染色體轉(zhuǎn)染法以及噬菌體顯示技術(shù)(所有所述技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)都是已知的)構(gòu)建完整人抗體。參見例如McCafferty等人，Nature 348 :552-553 (1990)。這樣的完整人抗體預(yù)期表現(xiàn)出比嵌合抗體或人源化抗體更少的副作用并且如基本上內(nèi)源的人抗體一樣在體內(nèi)起作用。在某些實(shí)施方案中，要求保護(hù)的方法和過程可使用通過此類技術(shù)而產(chǎn)生的人抗體。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，噬菌體顯示技術(shù)可用于產(chǎn)生人抗體(例如， Dantas-Barbosa等，2005，Genet. Mol. Res. 4 :126-40)。人抗體可從正常人或表現(xiàn)出特定疾病狀態(tài)如癌癥的人中制備(Dantas-Barbosa等，200幻。從患病個(gè)體中構(gòu)建人抗體的有利方面在于循環(huán)抗體全庫可能對(duì)針對(duì)疾病相關(guān)抗原的抗體具有偏好性。在此方法的一個(gè)非限制性實(shí)例中，Dantas-Barbosa等^00 構(gòu)建了來自骨肉瘤患者的人Fab抗體片段的噬菌體顯示文庫。一般而言，總RNA獲自循環(huán)血淋巴細(xì)胞(Id.)。從 μ、Y和κ鏈抗體全庫中克隆重組Fab，并將其插入噬菌體顯示文庫(Id.)。RNA可通過使用對(duì)重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列特異的引物轉(zhuǎn)化為cDNA，并用于制備FabcDNA文庫(Marks 等人，1991，J. Mol. Biol. 222 :581-97)。文庫構(gòu)建按 Andris-Widhopf 等(2000，在 Phage Display Laboratory Manual,Barbas^ (1 ")1 lK Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 9. 1至9. 22中)進(jìn)行。最終的Fab片段用限制性核酸內(nèi)切酶消化，然后插入噬菌體基因組以制備所述噬菌體顯示文庫。此類文庫可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)噬菌體顯示方法進(jìn)行篩選(參見，例如，Pasqualini and Ruoslahti，1996， Nature 380 :364-366 ；Pasqualini,1999, The Quart. J. Nuc1. Med. 43 :159-162)?？梢砸远喾N形式實(shí)施噬菌體顯示，關(guān)于它們的綜述，參見例如Johnson和 Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。還可利用體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生人抗體。參見，第5，567，610號(hào)和第5，229，275號(hào)美國專利，將所述專利通過引用整體并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)了解，這些技術(shù)是示例性的并且可利用用于制備和篩選人抗體或抗體片段的任何已知方法。在另一替代實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫實(shí)驗(yàn)方案，經(jīng)過基因工程改造以產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于產(chǎn)生針對(duì)基本上任何免疫靶的抗體。用于從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得人抗體的方法由 Green 等人，Nature Genet. 7 :13(1994)，Lonberg 等人，Nature 368 856(1994)和Taylor等人，Int. Immun. 6 :579 (1994)公開。此系統(tǒng)的非限制性示例為 Abgenix (Fremont, CA)的 XenoMouse (例如，Green 等人，1999，J. Immunol. Methods 231 11-23)。在XenoMouse 和相似動(dòng)物中，小鼠抗體基因已被失活，并替換為功能性人抗體基因，但是鼠免疫系統(tǒng)的剩余部分仍保持完整。XenoMouse 已轉(zhuǎn)化了種系配置的YAC (酵母人工染色體)，該YAC包含部分人IgH 和IgK基因座，包括可變區(qū)序列的大部分區(qū)域，以及輔助基因和調(diào)控序列。人可變區(qū)全庫可用于制備產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，而B細(xì)胞可通過已知技術(shù)融合至雜交瘤。用靶抗原免疫的 XenoMouse 將通過正常的免疫反應(yīng)產(chǎn)生人抗體，所述人抗體可通過上述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行收獲和/或產(chǎn)生。有多個(gè)種系的XenoMouse 可用，每個(gè)種系均能產(chǎn)生不同類別的抗體。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的人抗體已顯示出治療潛力，并保留了正常人抗體的藥代動(dòng)力學(xué)特性(Green等， 1999)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)了解，要求保護(hù)的組合物和方法并不限于使用XenoMouse 系統(tǒng)，而是可以使用已經(jīng)過基因工程改造來產(chǎn)生人抗體的任何轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。抗體片段可利用已知技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別特定表位的抗體片段。抗體片段是抗體的抗原結(jié)合部分例如F(ab' )2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等?？赏ㄟ^胃蛋白酶降解抗體分子來產(chǎn)生 F(ab，)2片段，并且可通過還原F(ab，)2片段的二硫橋來產(chǎn)生Fab'片段?？蛇x擇地，可構(gòu)建Fab'表達(dá)文庫(Huse等人，1989，kience，M6 :1274-1觀1)以允許快速且容易地鑒定具有期望的特異性的單克隆Fab'片段?？赏ㄟ^木瓜蛋白酶消化抗體來產(chǎn)生？(油)2片段，并且通過二硫化物還原來獲得Fab片段。單鏈Fv分子(scFv)包含VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域。VL和VH結(jié)構(gòu)域締合以形成靶結(jié)合部位。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過肽連接體(L)進(jìn)一步共價(jià)連接。用于制備scFv分子和設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)碾倪B接體的方法公開于第4，704，692號(hào)美國專利，第4，946，778號(hào)美國專利，R. Raag 和 M. Whitlow, "Single Chain Fvs. ” FASEB 第 9 卷:73-80(1995)以及 R.E. Bird 和 B. W. Walker/‘Single Chain Antibody Variable Regions，”TIBTECH，第 9 卷 132-137(1991)中。用于產(chǎn)生單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)的技術(shù)在本領(lǐng)域也是已知的，如例如Cossins等人 (2006, Prot Express Purif 51 :253-259)(通過引用并入本文)中公開的?？赏ㄟ^蛋白水解全長抗體或通過在大腸桿菌(E. coli)或另一種宿組中表達(dá)編碼所述片段的DNA來制備抗體片段?？衫贸Ｒ?guī)方法通過胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解全長抗體來獲得抗體片段。此類方法由例如Goldenberg,第4，036，945號(hào)和第4，331，647 號(hào)美國專利以及本文中包括的參考資料描述。此外，參見Nisonoff等人，Arch Biochem. Biophys. 89 :230(1960) ；Porter，Biochem. J. 73 :119 (1959)，Edelman 等人，in METHODS IN ENZYM0L0GY 第 1 卷，第 422 頁(Academic Press 1967)和第 2. 8. 1-2. 8. 10 和 2. 10. -2. 10. 4 頁的 Coligan0已知抗體使用的抗體可從許多已知的來源商購獲得。例如，多個(gè)抗體分泌型雜交瘤品系可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)。大量抗不同疾病靶(包括但不限于腫瘤相關(guān)抗原)的抗體已保藏在ATCC和/或具有公布的可變區(qū)序列，并且可獲得用于要求保護(hù)的方法和組合物。參見，例如，第7，312，318 ；7, 282, 567 ；7, 151，164 ；7，074，403 ； 7，060，802 ；7，056，509 ；7，049，060 ；7，045，132 ；7，041，803 ；7，041，802 ；7，041，293 ； 7，038，018 ；7，037，498 ；7，012，133 ；7，001，598 ；6，998，468 ；6，994，976 ；6，994，852 ； 6，989，241 ；6，974，863 ；6，965，018 ；6，964，854 ；6，962，981 ；6，962，813 ；6，956，107 ； 6，951，924 ；6，949，244 ；6，946，129 ；6，943，020 ；6，939，547 ；6，921，645 ；6，921，645 ； 6，921，533 ；6，919，433 ；6，919，078 ；6，916，475 ；6，905，681 ；6，899，879 ；6，893，625 ； 6，887，468 ；6，887，466 ；6，884，594 ；6，881，405 ；6，878，812 ；6，875，580 ；6，872，568 ； 6，867，006 ；6，864，062 ；6，861，511 ；6，861，227 ；6，861，226 ；6，838，282 ；6，835，549 ； 6，835，370 ；6，824，780 ；6，824，778 ；6，812，206 ；6，793，924 ；6，783，758 ；6，770，450 ； 6，767，711 ；6，764，688 ；6，764，681 ；6，764，679 ；6，743，898 ；6，733，981 ；6，730，307 ； 6，720，15 ；6，716，966 ；6，709，653 ；6，693，176 ；6，692，908 ；6，689，607 ；6，689，362 ； 6，689，355 ；6，682，737 ；6，682，736 ；6，682，734 ；6，673，344 ；6，653，104 ；6，652，852 ； 6，635，482 ；6，630，144 ；6，610，833 ；6，610，294 ；6，605，441 ；6，605，279 ；6，596，852 ； 6，592，868 ；6，576，745 ；6，572 ；856 ；6，566，076 ；6，562，618 ；6，545，130 ；6，544，749 ； 6，534，058 ；6，528，625 ；6，528，269 ；6，521，227 ；6，518，404 ；6，511，665 ；6，491，915 ； 6，488，930 ；6，482，598 ；6，482，408 ；6，479，247 ；6，468，531 ；6，468，529 ；6，465，173 ； 6，461，823 ；6，458，356 ；6，455，044 ；6，455，040,6，451，310 ；6，444，206' 6，441，143 ； 6，432，404 ；6，432，402 ；6，419，928 ；6，413，726 ；6，406，694 ；6，403，770 ；6，403，091 ； 6，395，276 ；6，395，274 ；6，387，350 ；6，383，759 ；6，383，484 ；6，376，654 ；6，372，215 ； 6，359，126 ；6，355，481 ；6，355，444 ；6，355，245 ；6，355，244 ；6，346，246 ；6，344，198 ； 6，340，571 ；6，340，459 ；6，331，175 ；6，306，393 ；6，254，868 ；6，187，287 ；6，183，744 ； 6，129，914 ；6，120，767 ；6，096，289 ；6，077，499 ；5，922，302 ；5，874，540 ；5，814，440 ； 5，798，229 ；5，789，554 ；5，776，456 ；5，736，119 ；5，716，595 ；5，677，136 ；5，587，459 ； 5，443，953,5, 525，338號(hào)美國專利。這些僅是示例性的并且許多種其它抗體和它們的雜交瘤在本領(lǐng)域是已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)了解，抗幾乎任何疾病相關(guān)抗原的抗體序列或抗體分泌型雜交瘤可通過就抗所選擇的疾病相關(guān)目標(biāo)靶的抗體簡單地搜索ATCC、NCBI和 /或USPTO數(shù)據(jù)庫來獲得。可使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增克隆的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，將其切割，然后連接入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)移入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并且用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)。免疫綴合物在某些實(shí)施方案中，可將抗體或其片段綴合至一種或多種治療劑或診斷劑。治療
24劑不必相同而是可以不同，例如藥物和放射性同位素。例如，可將131I摻入抗體或融合蛋白的酪氨酸和連接至賴氨酸殘基的ε氨基的藥物。還可將治療劑和診斷劑連接至例如還原型SH基團(tuán)和/或糖類側(cè)鏈。用于制備治療劑或診斷劑與抗體或融合蛋白的共價(jià)或非共價(jià)綴合物的許多方法在本領(lǐng)域是已知的并且可利用任何這樣已知的方法?？赏ㄟ^二硫鍵的形成在還原型抗體成分的鉸鏈區(qū)上連接治療劑或診斷劑?？蛇x擇地，可使用異雙功能交聯(lián)劑例如N-琥珀?；?-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)連接此類試劑。Yu等人，Int. J. Cancer 56:244(1994)。用于這樣的綴合的一般技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。參見，例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991) ；Upeslacis等人,“Modification of Antibodies by Chemical Methods, "in MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等人(編)，第 187-230 頁(ffiley-Liss, Inc.1995) ；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，” in MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter 等人(編)，第60-84頁(Cambridge University Press 1995)。可選擇地，可通過抗體的Fc區(qū)中的糖類部分綴合治療劑或診斷劑。糖基可用于增加與巰基結(jié)合的相同試劑的裝載，或糖類部分可用于結(jié)合不同的治療劑或診斷劑。用于將肽經(jīng)由抗體的糖類部分綴合至抗體成分的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。參見，例如，Shih 等人，Int. J. Cancer 41 :832(1988) ；Shih 等人，Int. J. Cancer 46 :1101(1990)和Shih等人，U. S. Patent No. 5，057，313，將所述文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。一般方法包括使具有氧化型糖類部分的抗體組分與具有至少一個(gè)游離胺功能的載體聚合物反應(yīng)。該反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)生最初的希夫堿(亞胺)鍵合，其可通過還原成仲胺以形成最終的綴合物來獲得穩(wěn)定。如果用作免疫綴合物的抗體成分的抗體是抗體片段，那么Fc區(qū)可以不存在。然而，可能將糖類部分引入全長抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)。參見，例如，Leimg等人， J. Immunol. 154 :5919 (1995) ；Hansen 等人，U. S. Patent No. 5，443，953 (1995)，Leung 等人， 第6，254，868號(hào)美國專利，將所述文獻(xiàn)和專利通過引用整體并入本文。將基因工程改造的糖類部分用于連接治療劑或診斷劑。在某些實(shí)施方案中，可將螯合劑連接至抗體、抗體片段或融合蛋白，然后用于螯合治療劑或診斷劑例如放射性核素。示例性螯合劑包括但不限于DTPA(例如Mx-DTPA)、D0TA、 TETA、NETA或Ν0ΤΑ。用于螯合劑的綴合和使用其將金屬或其它配體連接至蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域是公知的(參見，例如，第12/112，289號(hào)美國專利申請(qǐng)，將其通過引用整體并入本文)。在某些實(shí)施方案中，可通過與具有長尾的試劑反應(yīng)來將放射性金屬或順磁離子連接至蛋白質(zhì)或肽，可將多個(gè)用于結(jié)合離子的螯合基團(tuán)連接至所述長尾。這樣的尾可以是聚合物例如多聚賴氨酸、多糖或其它具有側(cè)基的衍生多聚物或可衍生鏈，所述側(cè)基可結(jié)合已知可用于此用途的螯合基團(tuán)，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、 多胺、冠醚、雙-縮氨基硫脲、聚肟(polyoxime)等?？蓪Ⅱ蟿┲苯舆B接至抗體或肽，例如如第4，824，659號(hào)美國專利(其通過引用并入本文)中公開的。特別有用的金屬-螯合劑組合包括與在60至4，OOOkeV的一般能量范圍內(nèi)的用于放射性成像(radioimaging)的診斷同位素(例如125I、mI、123I、124I、ffiCu、64Cu,18F^111In,67Ga,68Ga,99mTc,94mTc,nC,13N,150 , 76Br) 一起使用的 2-芐基-DTPA 及其單甲基和環(huán)己基類似物。當(dāng)與非放射性金屬例如錳、鐵和釓絡(luò)合時(shí)，相同螯合劑可用于MRI。大環(huán)螯合劑，如ΝΟΤΑ、DOTA和ΤΕΤΑ，可用于多種金屬和射電金屬，特別是分別用于鎵、釔和銅放射性核素。通過根據(jù)目標(biāo)金屬調(diào)節(jié)環(huán)的大小，可使此類金屬-螯合劑絡(luò)合物非常穩(wěn)定?？砂ㄆ渌h(huán)類型的螯合劑，例如大環(huán)聚酯，其被關(guān)注用于穩(wěn)定地結(jié)合核素例如223Ra(對(duì)于 RAIT)。最近，已公開了用于PET掃描技術(shù)的18F-標(biāo)記的方法，例如通過F-18與金屬或其它原子例如鋁的反應(yīng)來進(jìn)行?？蓪?8F-Al綴合物與螯合基團(tuán)例如D0TA、N0TA或NETA絡(luò)合， 所述螯合基被直接連接至抗體或在預(yù)靶向方法中被用于標(biāo)記可靶向的構(gòu)建體。這樣的F-18 標(biāo)記技術(shù)公開于第7，563，433美國專利中，將其實(shí)施例部分通過引用并入本文。治療劑在可選擇的實(shí)施方案中，可使用治療劑，將其綴合至本發(fā)明的DNL復(fù)合物，或在抗體施用之前、同時(shí)或之后分開地施用其，所述治療劑是例如細(xì)胞毒素劑、抗-血管生成劑、 促細(xì)胞凋亡劑、抗生素、激素、激素拮抗劑、趨化因子、藥物、前體藥物、毒素、酶或其它試劑。 使用的藥物可具有選自抗有絲分裂劑、抗激酶、烷化劑、抗代謝物、抗生素、生物堿、抗-血管生成劑、促細(xì)胞凋亡劑和其組合的藥物特性。使用的示例性藥物可包括5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽環(huán)類、 苯達(dá)莫司汀、博來霉素、硼替佐米、苔蘚抑素1、白消安、加利車霉素、喜樹堿、卡鉬、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉬(CDDP)、C0X-2抑制劑、伊立替康(CPT-11)、 SN-38、卡鉬、克拉屈濱、喜樹堿、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、多西他賽、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、2- 二氫吡咯多柔比星(2P-D0X)、氰基-嗎啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、雌莫司汀、表鬼白毒素、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(VP16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3'，5' -0-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟達(dá)拉濱、氟他胺、法呢基蛋白轉(zhuǎn)化酶抑制劑、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、L-天門冬酰胺酶、來那度胺、亞葉酸鈣、洛莫司汀、氮芥、美法侖、巰嘌呤、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、諾維本、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴胼、 紫杉醇、噴司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、鏈佐星(str印tozocin)、他莫昔芬、泰素、 替莫唑胺(DTIC的含水形式)、反鉬(transplatinum)、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、烏拉莫司汀、長春瑞濱、長春堿、長春新堿和長春花生物堿。使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)， 例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素Α、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。使用的趨化因子可包括RANTES、MCAF、MIPl-α、MIPl-β和 ΙΡ-10。在某些實(shí)施方案中，可使用抗-血管生成劑例如血管生長抑素(angiostatin)、 baculostatin、血管能抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白(maspin)、抗VEGF抗體、抗-PlGF 肽和抗體、抗-血管生長因子抗體、抗Flk-I抗體、抗Flt-I抗體和肽、抗-Kras抗體、 抗-cMET抗體、抗-MIF(巨噬細(xì)胞遷移-抑制因子)抗體、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板反應(yīng)蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、羧酰胺三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、馬立馬司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸鹽、血管生成素-2、干擾素α、除莠霉素 A、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide (利諾胺)、沙利度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、 ΤΝΡ-470、內(nèi)皮抑制素、紫杉醇、accutin、血管生長抑素、西多福韋、長春新堿、博萊霉素、 AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。使用的免疫調(diào)節(jié)劑可選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素和其組合。特別有用的是淋巴毒素例如腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子例如白細(xì)胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素例如干擾素-α、-β或-Y以及干細(xì)胞生長因子例如命名為“Si因子”的干細(xì)胞生長因子。細(xì)胞因子中包括生長激素例如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素； 甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如卵泡刺激素(FSH)、甲狀腺刺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；肝細(xì)胞生長因子；前列腺素、成纖維生長因子；催乳素；胎盤催乳素、OB蛋白；腫瘤壞死因子-α和-β ；苗勒抑制物質(zhì)(mullerian inhibiting substance)；鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子例如NGF-β ；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)例如 TGF-α和TGF-β ；胰島素樣生長因子_1和-II ；紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素例如干擾素-α、_β和-γ ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；白細(xì)胞介素(IL)例如 IL-I、IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12 ；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL_25、LIF、kit 配體或 FLT-3、血管生長抑素、血小板反應(yīng)蛋白、內(nèi)皮抑制素、腫瘤壞死因子和LT。使用的放射性核素包括但不限于111^K177Liu2i2BL213BL211AI62Ciu67Ciu9°Y、125I、 131I、32P、33P、47SC、mAg、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、16fiH0、186Re、188Re、189Re、212Pb 嚴(yán)Ra、225Ac、 59Fe J5Se J7As,89Sr,^o,105Rh,109Pd,143Pr,149Pm,169Er,194Ir,198Au,199Au 和 211Pb0 治療性放射性核素優(yōu)選具有在60至6，OOOkeV范圍內(nèi)的衰變能，俄歇發(fā)射體的衰變能優(yōu)選為60 至200keV范圍內(nèi)，β發(fā)射體的衰變能優(yōu)選為100_2，500keV，α發(fā)射體的衰變能優(yōu)選為 4, 000-6, OOOkeV0有用的β粒子輻射核素的最大衰變能優(yōu)選為20_5，OOOkeV，更優(yōu)選地為 100-4, OOOkeV，最優(yōu)選地為500-2，500keV?；旧贤ㄟ^輻射俄歇粒子進(jìn)行衰變的放射性核素也是優(yōu)選的。例如，Co-58、Ga-67、Br_80m、Tc_99m、Rh_103m、Pt-109、In-Ill、Sb-119、 l-125、Ho-161、0s-189m和Ir-192。有用的β粒子輻射核素的衰變能優(yōu)選為< 1，OOOkeV， 更優(yōu)選地為< IOOkeV,最優(yōu)選地為< 70keV?；旧贤ㄟ^產(chǎn)生α粒子進(jìn)行衰變的放射性核素也是優(yōu)選的。此類放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、foi-219、 Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213 和 Fm-255。有用的 α 粒子輻射的放射性核素的衰變能優(yōu)選為2，000-10, OOOkeV,更優(yōu)選地為3，000-8, OOOkeV,最優(yōu)選地為 4，000-7，OOOkeV。使用的其它潛在放射性同位素包括"(:、13Ν、15θ/5Βι·、198Αιι、224Α(3、126Ι、133Ι、 77Br、113mh、95RU、97RU、10l 嚴(yán)Κυ、10、、203^、121ηιΤθ、1221θ、125ηιΤθ、165 ιι、167 ιι、168Τπι、197Ρ 、109Ρ(1、 艦他、14^、14^、161!^、16^)、19、、57^)、58^)、51^·、59!^、7^、2。1!!、22^、 !·、165^ 等。某些有用的診斷核素可包括呷、52!^、62^!、64^!、67^!、6^!、，^、89^·、94!^、94"^、99"^ 或 mh。治療劑可包括光敏劑或染料。已使用熒光組合物例如熒光染料和其它發(fā)色團(tuán)或染料(例如對(duì)可見敏感的卟啉)來檢測和治療病變，即用合適的光照射病變部位。在治療中，這被稱為光輻射、光療或光動(dòng)力療法。參見Jori等人(編)，PH0T0DYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985) ；van den Bergh, Chem. Britain (1986)，22:430。此外，已將單克隆抗體與光敏染料偶聯(lián)，用于進(jìn)行光療。參見 Mew 等人，J. Immunol. (1983)，130 :1473 ；idem.，Cancer Res. (1985)，45 :4380 ；Oseroff 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) ,83 8744 ；idem. ， Photochem. Photobiol. (1987) ,46 83 ；Hasan 等)κ, Prog. Clin. Biol. Res. (1989)，288 471 ；Tatsuta 等)κ, Lasers Surg. Med. (1989)，9 422 ；Pelegrin 等人，Cancer (1991), 67 :2529。其它有用的治療劑可包括寡核苷酸，特別是優(yōu)選導(dǎo)向抗癌基因和癌基因產(chǎn)物例如 bcl-2或p53的反義寡核苷酸。治療性寡核苷酸的優(yōu)選形式為siRNA。診斷劑診斷劑優(yōu)選選自放射性核素、放射性造影劑、順磁離子、金屬、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、超聲造影劑和光敏試劑。此類診斷劑是公知的并且可使用任何此類已知的診斷齊U。診斷劑的非限定性實(shí)例可包括放射性核素例如11IrK111IrKmLiu 18F、5￥e、62CU、64CU、OTCU、
67λλ 68ΛΛ 86v 90v 89v 94mrp 94^ 99mrp 120T 123T 124T 125T 131T 154—158廣 j 32n Il0 13Λτ I5r\ 186r)
Ga λ Ga、 Y、 Y、 Zr λ Ic、 Ic、 Ic、丄、丄、丄、丄、 丄、 Gd、 P、 C、 N、 0、 Re、
188Re、51Mn、52mMn、55C0、72AS、75Br、76Br、82mRb、83Sr 或其它、、β 或正電子發(fā)射體。使用的順磁離子包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(III)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、銣(III)、釤(III)、 鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)或鉺(III)。超聲造影劑可包括脂質(zhì)體例如氣體填充的脂質(zhì)體。不透射線的診斷劑可選自化合物、鋇化合物、鎵化合物和鉈化合物。許多種熒光標(biāo)記物在本領(lǐng)域是已知的，包括但不限于異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。使用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可包括魯米諾、 異魯米諾、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶鹽或草酸酯。治療性治療的方法不同的實(shí)施方案涉及治療受試者例如哺乳動(dòng)物(包括人、馴養(yǎng)或伴侶寵物例如狗和貓)的癌癥的方法，包括給所述受試者施用治療有效量的雙特異性免疫細(xì)胞因子DNL構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可利用本發(fā)明的DNL構(gòu)建體治療的免疫疾病可包括例如關(guān)節(jié)疾病例如強(qiáng)直性脊柱炎、幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；神經(jīng)疾病例如多發(fā)性硬化和重癥肌無力；胰腺疾病例如糖尿病，特別是青少年型糖尿病；胃腸道疾病例如慢性活動(dòng)型肝炎、乳糜瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、惡性貧血；皮膚病例如銀屑病或硬皮??；變應(yīng)性疾病例如哮喘和移植相關(guān)病癥例如移植物抗宿主病和同種異體移植物排斥?？赏ㄟ^同時(shí)或相繼地施用治療有效量的另一種抗體(所述抗體結(jié)合靶細(xì)胞表面上的另一種抗原或與所述抗原反應(yīng))來補(bǔ)充雙特異性免疫細(xì)胞因子DNL構(gòu)建體的施用。 優(yōu)選的其它MAb包含至少一種人源化MAb、嵌合MAb或人MAb，其選自與如下物質(zhì)反應(yīng)的 MAb :CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、 CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、 CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA, EGP-U EGP-2、碳酸酐酶 IX、PAM4 抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、la、MIF、HMl. 24、HLA-DR、生腱蛋白、 Flt-3、VEGFR、PlGF, ILGF、IL-6、IL-25、生腱蛋白、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、補(bǔ)體因子 C5、癌基因產(chǎn)物或其組合。使用的不同抗體例如抗-CD19、抗-CD20和抗-CD22抗體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。參見，例如，Ghetie等人，Cancer Res. 48 :2610 (1988) ；Hekman等人’ Cancer Immunol. Immunother. 32 :364(1991) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 :353(1996), 第 5，798，554 ；6，187，287 ；6，306，393 ；6，676，924 ；7，109，304 ；7，151，164 ；7，230，084 ； 7，230，085 ；7，238，785 ；7，238，786 ；7，282，567 ；7，300，655 ；7，312，318 號(hào)美國專禾Ij ；和第 20080131363 ；20080089838 ；20070172920 ；20060193865 ；20060210475 ；20080138333 和 20080146784號(hào)美國專利申請(qǐng)公布，將上述每一篇的實(shí)施例部分通過引用并入本文。還可通過同時(shí)或相繼地施用至少一種治療劑來進(jìn)一步補(bǔ)充DNL構(gòu)建體療法。例如“CVB” (1. 5g/m2環(huán)磷酰胺，200-400mg/m2依托泊苷和150_200mg/m2卡莫司汀)是用于治療非-何杰金氏淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur J. Haematol. 51 18 (1993)。其它適當(dāng)?shù)穆?lián)合化學(xué)治療方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。參見，例如，F(xiàn)reedman等人，“Non-Hodgkin' s lymphomas, “ in CANCER MEDICINE，第 2 卷，第 3 版，Holland 等人(編)，第2(^8-2068頁(Lea&Febiger 1993)。作為舉例說明，用于治療中度非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化學(xué)治療方案包括C-MOPP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、丙卡巴胼和潑尼松)和CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松)。有用的第二代化學(xué)治療方案是 m-BAC0D(甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸)，而適當(dāng)?shù)牡谌桨甘荕ACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸)。其它有用的藥物包括苯基丁酸鹽、苯達(dá)莫司汀和苔蘚抑素-1?？砂匆阎椒ㄅ渲票景l(fā)明的DNL構(gòu)建體以制備藥學(xué)上有用的組合物，由將DNL構(gòu)建體與藥學(xué)上適宜的賦形劑組合在混合物中。無菌的磷酸鹽緩沖液即為藥學(xué)上適宜的賦形劑的一個(gè)實(shí)例。其它適當(dāng)?shù)馁x形劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知。參見，例如，Ansel等人， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng))， 第 5 版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro (編)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES (雷明頓氏藥物科學(xué))，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修訂版本。可將本發(fā)明的DNL構(gòu)建體配制用于靜脈內(nèi)施用，通過例如推注注射或連續(xù)輸注。 優(yōu)選，在短于約4小時(shí)的時(shí)期內(nèi)，更優(yōu)選短于約3小時(shí)的時(shí)期內(nèi)輸注DNL構(gòu)建體。例如， 可在30分鐘內(nèi)，優(yōu)選甚至15分鐘內(nèi)輸注前25-50mg，在隨后的2_3小時(shí)內(nèi)輸注剩余部分。 注射用制劑可呈單位劑型，例如裝在安瓿中，或者裝在多劑量容器中并且添加防腐劑。組合物可采用例如在油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配方劑 (formulatory agents)例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x擇地，活性成分可呈粉劑形式，用于在使用前用適當(dāng)?shù)拿浇槲?例如無菌無熱原水)配制?？蓪⑵渌扑幏椒ㄓ糜诳刂艱NL構(gòu)建體的作用持續(xù)時(shí)間。控釋制劑可通過使用生物相容性聚合物絡(luò)合或者吸附DNL構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn)。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基質(zhì)和硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酸酐共聚物基質(zhì)。Sherwood等人，Bio/ Technology 10:1446(1992)。從此基質(zhì)上釋放的速率取決于該DNL構(gòu)建體的分子量、基質(zhì)內(nèi)的DNL構(gòu)建體的量和分散粒子的大小。Saltzman等人，Biophys. J. 55 163 (1989)； Sierwood等人，同上。其它固體劑型描述于Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng))，第 5 版(Lea&Febiger 1990)， 和 Gennaro (編)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES (雷明頓氏藥物科學(xué))，第 18 版 (Mack Publishing Company 1990)，及其修訂版本。
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還可將DNL構(gòu)建體皮下或甚至通過其它胃腸外途徑施用至哺乳動(dòng)物。此外，可通過連續(xù)輸注或通過單次或多次推注進(jìn)行施用。優(yōu)選，在短于約4小時(shí)的時(shí)期內(nèi)，更優(yōu)選在短于約3小時(shí)的時(shí)期內(nèi)輸注DNL構(gòu)建體。更常見，用于人的DNL構(gòu)建體的施用劑量取決于諸如患者年齡、體重、身高、性別、 總體健康狀況和先前的治療歷史等因素而變化。可能需要向受者提供約lmg/kg至25mg/ kg范圍內(nèi)的DNL構(gòu)建體的劑量作為單次靜脈內(nèi)輸注，但是也可根據(jù)情況需要施用更低或更高的劑量。對(duì)于70kg患者按l_20mg/kg施用的劑量例如為70-1，400mg，或?qū)τ?. 7米的患者，劑量為41-82%ig/m2?？砂葱枰貜?fù)此劑量，例如，每周一次，持續(xù)4-10周，或每周一次， 持續(xù)8周或每周一次，持續(xù)4周。還可以更低的頻率給藥，例如每隔一周一次，持續(xù)數(shù)月，或每月一次或每季度一次，持續(xù)多月，如維持療法中所需的?？蛇x擇地，以每2或3周一個(gè)劑量施用DNL構(gòu)建體，重復(fù)總共至少3個(gè)劑量?；蛘?，每周兩次施用所述構(gòu)建體，持續(xù)4-6周。如果將劑量減少至約200-300mg/m2 (每個(gè)劑量 340mg (對(duì)于1. 7米的患者)或4. 9mg/kg (對(duì)于70kg的患者)，可每周施用一次或甚至二次， 持續(xù)4至10周。可選擇地，可減少療程劑量，即每2或3周一次，持續(xù)2-3個(gè)月。然而，已確定甚至可以通過緩慢的靜脈內(nèi)輸注施用更高的劑量(例如每周一次或每2-3周一次20mg/ kg)，進(jìn)行重復(fù)的給藥循環(huán)?？梢匀芜x地以其它間隔重復(fù)給藥方案，并且可通過不同胃腸外途徑(對(duì)劑量和治療方案進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整)提供劑量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNL構(gòu)建體用于癌癥的治療。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌、淋巴瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病、骨髓瘤或淋巴樣惡性腫瘤(lymphoid malignancies)。下文中指出此類癌癥的更具體的實(shí)例，包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì)胞癌)、尤因肉瘤、Wilms瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌(gastric cancer)或胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、肝細(xì)胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、 甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid cancer)、分化的甲狀腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌癥或子宮癌、唾液腺癌、腎癌或腎癌(renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、 肛門癌、陰莖癌以及頭頸癌。術(shù)語“癌癥”包括原發(fā)性惡性細(xì)胞或腫瘤(例如，其細(xì)胞還未遷移至除了原始惡性腫瘤或腫瘤的位置外的受試者的身體的位置的惡性細(xì)胞或腫瘤)和繼發(fā)性惡性細(xì)胞或腫瘤(例如，通過惡性細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞至與原始腫瘤的位置不同的繼發(fā)性位置的轉(zhuǎn)移、遷移產(chǎn)生的惡性細(xì)胞或腫瘤)。適合于本發(fā)明的治療方法的癌癥包括表達(dá)、 過表達(dá)或異常表達(dá)IGF-IR的細(xì)胞。癌癥或惡性腫瘤的其它實(shí)例包括但不限于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病(Acute Lymphocytic Leukemia)、急性髓樣白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、成人(原發(fā)性)肝細(xì)胞癌、成人(原發(fā)性)肝癌、成人急性淋巴細(xì)胞性白血病、成人急性髓樣白血病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴細(xì)胞白血病、成人非-何杰金氏淋巴瘤、成人原發(fā)性肝癌、成人軟組織肉瘤、AIDS-相關(guān)淋巴瘤、AIDS-相關(guān)惡性腫瘤、 直腸癌、星形細(xì)胞瘤、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦瘤、乳腺癌、腎盂和輸尿管的癌癥、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、小腦星形細(xì)胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、腦星形細(xì)胞瘤(Cerebral Astrocytoma)、宮頸癌、兒童(原發(fā)性)肝細(xì)胞癌、兒童(原發(fā)性)肝癌、兒童急性淋巴母細(xì)胞白血病(Childhood Acute LymphoblasticLeukemia)、兒童急性髓樣白血病、兒童腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童小腦星形細(xì)胞瘤(Childhood Cerebellar Astrocytoma)、兒童小腦星形細(xì)胞瘤 Childhood Cerebral Astrocytoma) > 兒童顱外生殖細(xì)胞腫瘤(Childhood Extracranial Germ Cell Tumors)、兒童何杰金氏病(Childhood Hodgkin' s Disease)、兒童何杰金氏淋巴瘤、兒童下丘腦和視通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童淋巴細(xì)胞白血病(Childhood Lymphoblastic Leukemia)、兒童髓母細(xì)胞瘤 (Childhood Medulloblastoma)、兒童非-何杰金氏淋巴瘤、兒童松果體和幕上原始神經(jīng)外胚瘤、兒童原發(fā)性肝癌、兒童橫紋肌肉瘤、兒童軟組織肉瘤、兒童視通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓性白血病、結(jié)腸癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、內(nèi)分泌胰島細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌癥、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相關(guān)腫瘤、外分泌胰腺癌、 盧頁夕卜胚細(xì)胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺夕卜胚細(xì)胞瘤(Extragonadal Germ Cell Tumor)、肝外膽管癌、眼癌、雌性乳腺癌、高歇氏病(Gaucher' s Disease)、膽囊癌、 胃癌、胃腸道類癌(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃腸瘤(Gastrointestinal Tumors)、生殖細(xì)胞瘤、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、多毛細(xì)胞白血病、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、何杰金氏淋巴瘤、高丙種球蛋白血癥(Hypergammaglobulinemia)、下咽癌、腸癌、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴組織增殖性疾病(Lymphoproliferative Disorders)、巨球蛋白血癥、雄性乳腺癌、惡性間皮瘤 (Maiignant Mesothelioma)、惡性胸腺瘤、髓母細(xì)胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移性原發(fā)性鱗狀頸癌(Metastatic Occult Primary Squamous Neck Cancer)、轉(zhuǎn)移性原發(fā)性鱗狀頸癌 (Metastatic Primary Squamous Neck Cancer)、$f,t生.! (Metastatic Squamous Neck Cancer)、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤、骨髓增生異常綜合征、髓性白血病(Myelogenous Leukemia)、髓樣白血病(Myeloid Leukemia)、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻竇癌(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer)、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌、隱匿性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌(Occult Primary Metastatic Squamous Neck Cancer)、口咽癌、骨肉瘤/惡性纖維肉瘤、骨肉瘤/惡性纖維組織細(xì)胞瘤、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤、卵巢上皮性癌、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、 卵巢低度惡性潛能腫瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)、胰腺癌、副蛋白血癥(Paraproteinemias)、真性紅細(xì)胞增多癥、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(Primary Central Nervous System Lymphoma)、原發(fā)性肝癌、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌、腎盂和輸尿管癌(Renal Pelvis and Ureter Cancer)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、涎腺癌、肉狀瘤病肉瘤、賽扎里氏綜合征(Sezary Syndrome)、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀頸癌(Squamous Neck Cancer)、胃癌、幕上原始神經(jīng)外胚層和松果體瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌(Transitional Cell Cancer of the Renal Pelvis and Ureter)、腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌(Transitional Ren al Pelvis and Ureter Cancer)、滋養(yǎng)細(xì)胞月中瘤(Trophoblastic Tumors)、輸尿管和腎盂細(xì)胞癌(teeter and Renal Pelvis Cell Cancer)、尿道癌、子宮癌、 子宮肉瘤、陰道癌、視通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、外陰癌、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、腎母細(xì)胞瘤和任何其它過度增殖性疾病，除新生物形成外，都位于上面所列的器官系統(tǒng)中。
本文中描述的和要求保護(hù)的方法和組合物可用于治療惡性或惡化前狀態(tài)以及用于阻止至瘤形成狀態(tài)(neoplastic state)或惡性狀態(tài)(包括但不限于上述那些障礙)的進(jìn)展。此類用途適用于已知或懷疑進(jìn)行至瘤形成或癌癥，特別是其中由超常增生、化生 (metaplasia)或最特別地發(fā)育不良組成的非瘤形成細(xì)胞生長已發(fā)生的疾病(關(guān)于此類異常生長條件的綜述，參見Robbins和Angell,Basic Pathology，第 2版，W. B. Saunders Co.， Philadelphia, pp. 68-79(1976))的進(jìn)展的狀態(tài)。發(fā)育不良通常是癌癥的先兆，并且主要見于上皮中。其為非瘤形成細(xì)胞生長的最紊亂形式，包括個(gè)體細(xì)胞一致性和細(xì)胞的構(gòu)造朝向(architectural orientation) 的損失。當(dāng)存在慢性刺激或炎癥時(shí)，發(fā)育不良特征性地發(fā)生?？杀恢委煹陌l(fā)育不良障礙包括但不限于無汗性外胚層發(fā)育不良(anhidrotic ectodermal dysplasia)、異側(cè)發(fā)育不良(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓發(fā)育不良、心房-手指發(fā)育不良 (atriodigital dysplasia)、支氣管月市發(fā)育不良、腦發(fā)育不良(cerebral dysplasia)、宮頸發(fā)育不良、軟骨外胚層發(fā)育不良、鎖骨顱骨發(fā)育不全、先天性外胚葉發(fā)育不良、顱骨骨
胃胃胃(craniodiaphysial dysplasia) λΜΙΙεΚ^^^^^ (craniocarpotarsal dysplasia)、盧頁骨干飯端發(fā)育不全(craniometaphysial dysplasia)、牙本質(zhì)發(fā)育異常(dentin dysplasia)、骨干發(fā)育不全(diaphysial dysplasia)、夕卜胚層發(fā)育不良(ectodermal dysplasia)、禾由質(zhì)發(fā)育不全(enamel dysplasia)、腦f生目艮球發(fā)育不全 (encephalo-ophthalmic dysplasia) λ {β {R!j ^ IS ^ W ^ 良(dysplasia epiphysialis hemimelia)、多發(fā)性骨飯發(fā)育不良(dysplasia epiphysialis multiplex)、點(diǎn)狀骨飯發(fā)胃f 良(dysplasia epiphysialis punctata)^ (epithelial dysplasia) Λ
面-指(趾)-生殖器發(fā)育不良(faciodigitogenital dysplasia)、家族性頜骨纖維性發(fā)育異常(familial fibrous dysplasia of jaws)、家族性白色鮍璧發(fā)育異常(familial white folded dysplasia)、肌纖維發(fā)育不良(fibromuscular dysplasia)、骨纖維異常增殖癥 (fibrous dysplasia of bone)、日王盛骨f生發(fā)育不良(florid osseous dysplasia)、j^傳f生腎臟-視網(wǎng)膜發(fā)育不良(hereditary renal-retinal dysplasia)、出汗性外胚層發(fā)育不良 (hidrotic ectodermal dysplasia)、少汗性夕卜胚層發(fā)育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia)、淋巴細(xì)胞減少性胸腺發(fā)育不全(lymphopenic thymic dysplasia)、乳房發(fā)育不良(mammary dysplasia)、下頜面發(fā)育不良(mandibulofacial dysplasia)、干骨后端發(fā)育不良(metaphysial dysplasia)、蒙底尼發(fā)育異常(Mondini dysplasia)、單骨纖維性發(fā)育不良(monostotic fibrous dysplasia)、粘膜上皮發(fā)育不良(mucoepithelial dysplasia)、多發(fā)性骨飯發(fā)育不良(multiple epiphysial dysplasia)、目艮-耳-脊椎綜合征(oculoauriculovertebral dysplasia)、目艮一牙一才旨(Klh)發(fā)育不良(oculodentodigital dysplasia)、目艮椎骨發(fā)育不全(oculovertebral dysplasia)、牙體發(fā)育異常(odontogenic dysplasia)、opthalmomandibulomelic dysplasia、根尖周牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)不良(periapical cemental dysplasia)、多骨纖維發(fā)育不良(polyostotic fibrous dysplasia)、假性軟骨發(fā)育不全性脊椎骨飯發(fā)育不良(pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia)、視網(wǎng)膜發(fā)育不良(retinal dysplasia)、隔-視神經(jīng)發(fā)育不良(s印to-optic dysplasia)、脊椎骨飯發(fā)育不全(spondyloepiphysial dysplasia)禾口 ventriculoradial可被治療的另外的腫瘤前障礙包括但不限于良性過度增生性障礙(例如，良性腫瘤、纖維囊性狀態(tài)、組織肥大、腸息肉或腺瘤以及食道發(fā)育不良)、白斑、角化病、鮑溫病、農(nóng)
32民皮膚病(Farmer' s Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于抑制癌癥特別是上文所列的那些癌癥的生長、進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移。其它過度增殖性疾病、障礙和/或狀態(tài)包括但不限于惡性腫瘤和相關(guān)障礙的進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移，所述惡性腫瘤和相關(guān)障礙是例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病(包括成髓細(xì)胞白血病、前髓細(xì)胞性白血病、骨髓單核細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞白血病和紅白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病))、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(例如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、重鏈病和實(shí)體瘤，包括但不限于肉瘤和癌癥例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、 結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤(h印atoma)、 膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、腎母細(xì)胞瘤((Wilm' s tumor)、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤(emangioblastoma)、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。表達(dá)載體其它實(shí)施方案可涉及包含編碼DNL構(gòu)建體的抗體、抗體片段、細(xì)胞因子或組成融合蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白可包括連接至例如AD或DDD部分的抗體或片段或細(xì)胞因子。各種實(shí)施方案涉及包含編碼DNA序列的表達(dá)載體。所述載體可包含編碼人免疫球蛋白的輕鏈和重鏈恒定區(qū)以及鉸鏈區(qū)的序列，可將該序列與嵌合、人源化或人可變區(qū)序列連接。所述載體可額外地包含在所選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和信號(hào)序列或前導(dǎo)序列。特別有用的載體是pdHL2或GS。更優(yōu)選地，輕鏈和重鏈恒定區(qū)及鉸鏈區(qū)可來自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任選地將同種異型位置上的氨基酸的至少一個(gè)改變成在不同IgGl同種異型中發(fā)現(xiàn)的氨基酸，并且其中任選地可用丙氨酸替代基于EU 編號(hào)系統(tǒng)的EU的重鏈的氨基酸253。參見Edelman等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 63 78-85(1969)。在其它實(shí)施方案中，可將IgGl序列轉(zhuǎn)變成IgG4序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)了解，基因工程改造表達(dá)載體和插入宿主細(xì)胞以表達(dá)工程蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域是公知的并且只不過是常規(guī)實(shí)驗(yàn)。已在例如第7，531，327號(hào)和第 7，537，930號(hào)美國專利(其各自的實(shí)施例部分通過引用并入本文)中描述了用于表達(dá)克隆的抗體或片段的宿主細(xì)胞和方法。試劑盒各種實(shí)施方案可涉及含有適合用于治療或診斷患者的患病組織的組分的試劑盒。 示例性試劑盒可包含一種或多種本文中描述的DNL構(gòu)建體。如果包含施用組分的組合物未制成通過消化道(如通過口服遞送)遞送，則試劑盒還可包括能夠通過一些其它途徑遞送試劑盒組分的設(shè)備。一種用于施用例如腸胃外遞送的設(shè)備類型為注射器，其用于將所述組合物注射到受試者體內(nèi)。也可使用吸入設(shè)備。在某些實(shí)施方案中，可以以裝有無菌液體制劑或凍干制劑的預(yù)裝注射器或自動(dòng)注射筆(autoinjection pen)的形式提供治療劑。所述試劑盒組分可包裝在一起或者分開包裝在兩個(gè)或更多個(gè)容器中。在某些實(shí)施方案中，所述容器可以是包含適合重建(reconstitution)的組合物的無菌、凍干制劑的管形瓶。試劑盒還可包含適用于重建和/或稀釋其它試劑的一種或多種緩沖液。其它可使用的容器包括但不限于袋、盤、盒、管等。試劑盒組分可無菌包裝并保存在所述容器中?？砂ǖ牧硪唤M成部分為給使用試劑盒的人員的使用說明。
實(shí)施例下列實(shí)施例被提供用以舉例說明，但不限定本發(fā)明的權(quán)利要求。實(shí)施例1.用于產(chǎn)生模塊Fab亞單位的一般策略Fab模塊可制備成包含DDD或AD序列的融合蛋白。為每個(gè)Fab融合蛋白開發(fā)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。當(dāng)制備時(shí)，如果需要，模塊可進(jìn)行純化或保存在細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中。 制備之后，任何DD&模塊與任何AD模塊之間可任意組合，以產(chǎn)生三價(jià)DNL構(gòu)建體。質(zhì)粒載體pdHL2已用于產(chǎn)生多種抗體和基于抗體的構(gòu)建體。參見Gillies等人，J Immunol Methods (1989)，125 :191-202 ；Losman 等人，Cancer (Phila) (1997) ,80 :2660_6。 雙順反子哺乳動(dòng)物表達(dá)載體介導(dǎo)IgG重鏈和輕鏈的合成。許多不同IgG-pdHL2構(gòu)建體的載體序列絕大部分都是相同的，僅在可變區(qū)(VH和VL)序列存在差異。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)工具，可將這些IgG表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為Fab-DDD或Fab-AD表達(dá)載體。為了產(chǎn)生Fab-DDD表達(dá)載體，重鏈的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的編碼序列替換為編碼所述鉸鏈的前4個(gè)殘基、14個(gè)殘基的Gly-Ser連接體和人RII α的前44個(gè)殘基的序列(稱為DDD1)。 為了產(chǎn)生Fab-AD表達(dá)載體，IgG的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的序列替換為編碼所述鉸鏈的前4個(gè)殘基、15個(gè)殘基的Gly-Ser連接體和名為AKAP-IS的17個(gè)殘基的合成AD的序列 (稱為ADl)，該序列系使用生物信息學(xué)和肽陣列技術(shù)產(chǎn)生，并顯示非常高的與RII α 二聚體結(jié)合的親和力(0. 4ηΜ)。參見Alto 等人Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. A (2003)，100 4445-50 設(shè)計(jì)了兩個(gè)穿梭載體，以利于將IgG_pdHL2載體轉(zhuǎn)化為Fab-DDDl或Fab-ADl表達(dá)載體，如下所述。CHl的制備 CHl結(jié)構(gòu)域系使用pdHL2質(zhì)粒載體作為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得。左側(cè)PCR引物由 CHl結(jié)構(gòu)域的上游(5’ )和McII限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(即CHl編碼序列的5’ )組成。 右側(cè)引物由編碼鉸鏈的前4個(gè)殘基以及短連接體(最后兩個(gè)密碼子包含Bam HI限制性酶切位點(diǎn))的序列組成。CHl左側(cè)引物的5’5，GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3，(SEQ ID NO 63)CHl+G^S-Bam 右側(cè)5 ‘ GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG-3‘ (SEQ ID N0: 64)將410bp PCR擴(kuò)增引物克隆入pGemT PCR克隆載體(ftOmega，Inc.)，然后篩選克隆以獲得T7(5’ )方向的插入物。(G4S)2DDDl 的構(gòu)建
使用Sigma Genosys (Haverhill,UK)合成雙鏈體寡核苷酸(命名為(QS)2DDDl)， 以編碼DDDl的氨基酸序列，所述DDDl前面有連接肽的11個(gè)殘基，其中前兩個(gè)密碼子包含 Bam HI限制性酶切位點(diǎn)。終止密碼予和fegl限制性酶切位點(diǎn)位于3’端。編碼的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTFLLQGYTVFVLRQQPPDLVFFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :65)合成兩個(gè)寡核苷酸(命名為RIIA1-44上和RIIA1-44下，它們的3，端有30個(gè)堿基對(duì)的重疊)(Sigma Genosys)，并將它們組合在一起以包含174bp DDDl序列的1 個(gè)居中堿基對(duì)。對(duì)寡核苷酸進(jìn)行退火，然后使用Taq聚合酶進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。RIIA1-44 上5’ GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGG CTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3，(SEQ ID NO 66)RIIA1-44 下5 ’ GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTC GCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3，(SEQ ID NO 67)引物延伸之后，使用以下引物對(duì)所述雙鏈體進(jìn)行擴(kuò)增G4S Bam-左5，-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3，(SEQ ID NO 68)1-44 終 lh Eag 右5，-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3，(SEQ ID NO 69)將此擴(kuò)增引物克隆入pGemT，然后篩選T7(5’ )方向的插入物。(G4S)2-ADl 的構(gòu)建合成雙鏈體寡核苷酸(命名為(QS)2-ADl) (Sigma Genosys)，以編碼ADl的氨基酸序列，所述ADl前面有連接肽的11個(gè)殘基，其中前兩個(gè)密碼子包含Bam HI限制性酶切位點(diǎn)。終止密碼子和fegl限制性酶切位點(diǎn)位于3’端。編碼的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO :70)合成兩個(gè)互補(bǔ)并有重疊的寡核苷酸(命名為AKAP-IS上和AKAP-IS下)。AKAP-IS 上5’ GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGG ACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3’ (SEQ ID NO 71)AKAP-IS 下5’ CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCA CCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3，(SEQ ID NO 72)使用下列引物對(duì)所述雙鏈體進(jìn)行PCR擴(kuò)增G4S Bam-左5，-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3，(SEQ ID NO 73)AKAP-IS 終止 Eag 右5，-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3，(SEQ ID NO 74)將此擴(kuò)增引物克隆至pGemT載體，然后篩選T7 (5’ )方向的插入物。連接DDDl 和 CHl
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使用BamHI和NotI限制性內(nèi)切酶將編碼DDDl序列的190bp片段從pGemT上切下， 然后將該片段連接至CHl-pGemT的相同位點(diǎn)，以產(chǎn)生穿梭載體CHl-DDDl-pGemT。連接ADl 和 CHl使用BamHI和NotI將含有ADl序列的IlObp片段從pGemT上切下，然后將該片段連接至CHl-pGemT的相同位點(diǎn)，以產(chǎn)生穿梭載體CHl-ADl-pGemT。將CHl-DDDl或CH1-AD1克隆入基于pdHL2的載體使用此模塊化設(shè)計(jì)，CHl-DDDl或CHl-ADl均可包含于pdHL2載體中的任何IgG構(gòu)建體。通過去除pdHL2的McII/fegl限制性片段(CH1-CH3)，并將其替換為從相應(yīng)pGemT 穿梭載體上切下的CHl-DDDl或CHl-ADl的McII/fegl片段，整個(gè)重鏈恒定區(qū)即替換為上述構(gòu)建體之一。N-末端DDD結(jié)構(gòu)域DDD或AD的位置并不限于CHl的羧基末端。已改造了其中DDDl序列連接至VH結(jié)構(gòu)域的氨基末端的構(gòu)建體。實(shí)施例2 表達(dá)載體h679-Fd-ADl-pdHL2 的構(gòu)建h679-Fd-ADl-pdHL2是用于產(chǎn)生h679Fab的表達(dá)載體，其中ADl通過由14個(gè)氨基酸殘基組成的柔性Gly/Ser肽間隔區(qū)偶聯(lián)至Fd的CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端。將包含h679的可變區(qū)的基于pdHL2的載體的McII/fegl片段替換為CHl-ADl片段(由SacII和fegl從 CH1-AD1-SV3穿梭載體上切下)，該載體即轉(zhuǎn)化為h679-Fd-ADl-pdHL2。C-DDDl-Fd-hMN-14_pdHL2 的構(gòu)建C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2 是用于產(chǎn)生融合蛋白 C_DDDl-Fab-hMN_14 的表達(dá)載體， 在所述融合蛋白中，DDDl通過柔性肽間隔區(qū)連接至hMN-14 Fab的CHl羧基末端。質(zhì)粒載體hMN14(I)-pdHL2(已用于產(chǎn)生hMN_14 IgG)通過用SacII和fegl限制性核酸內(nèi)切酶消化以去除CH1-CH3結(jié)構(gòu)域，然后插入CHl-DDDl片段(由SacII和fegl從CH1-DDD1-SV3穿梭載體上切下)，即轉(zhuǎn)化為C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2。N-DDDl-Fd-hMN-14_pdHL2 的構(gòu)建N-DDDl-Fd-hMN-14_pdHL2是用于產(chǎn)生包含兩個(gè)拷貝的融合蛋白 N-DDDl-Fab-hMN-14的穩(wěn)定二聚體的表達(dá)載體，在所述融合蛋白中，DDDl通過柔性肽間隔區(qū)連接至hMN-14Fab的VH的氨基末端。如下對(duì)所述表達(dá)載體進(jìn)行改造。使用下面所示的兩個(gè)引物對(duì)DDDl結(jié)構(gòu)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。DDDl Nco 左5，CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3，(SEQ ID NO 75)DDDl-G1S Bam 右5’ GGATCCGCCACCTCCAGATCCTCCGCCGCCAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTG-3’ (SEQ ID NO 76)作為PCR的結(jié)果，NcoI限制性酶切位點(diǎn)和連接體中包含BamHI限制性酶切位點(diǎn)的部分的編碼序列即分別連接至5’和3’末端。將170bp PCR擴(kuò)增引物克隆至pGemT載體， 然后篩選克隆以獲得T7 (5’ )方向的插入物。194bp插入物由NcoI和MlI限制性內(nèi)切酶從所述PGemT載體上切下，并克隆入所述SV3穿梭載體(使用相同的酶消化制備而成)，以生成中間載體DDDl-SV3。使用下面所示的寡核苷酸引物對(duì)hMN_14Fd序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。hMN~14VH 左 G4S Bam5，-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3，(SEQ ID NO 77)CHl-C 終丨h(huán) Eag5，-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3，(SEQ ID NO 78)作為PCR的結(jié)果，BamHI限制性酶切位點(diǎn)和連接體的部分的編碼序列即連接到擴(kuò)增引物的5’端。終止密碼子和EagI限制性酶切位點(diǎn)則連接至3’端。將該1043bp擴(kuò)增引物克隆入pGemT。使用BamHI和EagI限制性內(nèi)切酶將h麗-14_Fd插入物從pGemT上切下，然后將該插入物連接至DDD1-SV3載體(使用相同的酶消化制備而成)，以產(chǎn)生構(gòu)建體 N-DDDl-hMN-14Fd-SV3。使用XhoI和EagI限制性內(nèi)切酶將N-DDDl-hMN_14Fd序列切下，然后將該1. 28kb 插入片段連接至經(jīng)相同酶消化C-hMN-14-pdHL2制備的載體片段。最終的表達(dá)載體即為 N-DDD1-Fd-hMN-14_pDHL2。實(shí)施例3. h679-Fab-ADl的產(chǎn)生和純化679抗體結(jié)合HSG靶抗原并且可利用親和層析進(jìn)行純化。h679-Fd_ADl-pdHL2載體用Sail限制性核酸內(nèi)切酶消化而被線性化，然后通過電穿孔方法轉(zhuǎn)染Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞。該雙順反子表達(dá)載體介導(dǎo)h679 κ輕鏈和h679Fd-ADl兩者的合成和分泌，它們結(jié)合形成h679Fab-ADl。電穿孔之后，用所述細(xì)胞涂布96孔組織培養(yǎng)板，并用0. 05 μ M甲氨蝶呤 (MTX)選擇轉(zhuǎn)染克隆。使用涂布BSA-IMP-260(HSG)綴合物的微量滴定板通過ELISA篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并使用綴合HRP的山羊抗人Fab進(jìn)行檢測。將使用HSG(IMP-239)傳感器芯片的BIAcore分析用于通過測量獲自注射的稀釋培養(yǎng)基樣品的初始斜率來確定產(chǎn)率。產(chǎn)量最高的克隆具有約為30mg/L的初始產(chǎn)率。使用單步IMP-291親和層析，從4. 5升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)230mg h679-Fab-ADl。在加至IMP_291_affigel柱之前，培養(yǎng)基用超濾方法濃縮了約10倍。使用PBS將該柱洗脫至基線，然后使用IM咪唑、ImM EDTA、0. IM NaAc, PH 4. 5洗脫h679-Fab-ADl。對(duì)洗脫液的SE-HPLC分析表明存在保留時(shí)間(9. 63分鐘)對(duì)應(yīng)于50kDa蛋白(未顯示)的單一銳峰。在還原SDS-PAGE分析中，僅有代表h679-ADl的多肽組分的兩個(gè)條帶可見(未顯示)。實(shí)施例4. N-DDD 1-Fab-hMN-14 和 C_DDDl-Fab-hMN_14 的產(chǎn)生和純化C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2 和 N-DDDl-Fd_hMN-14-pdHL2 載體通過電穿孔轉(zhuǎn)染入Sp2/0衍生的骨髓瘤細(xì)胞。C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2為雙順反子表達(dá)載體，其介導(dǎo) hMN-14 κ輕鏈和hMN-14 Fd-DDDl兩者的合成和分泌，它們組合形成C-DDDl_hMN_14Fab。 N-DDDl-hMN-14-pdHL2為雙順反子表達(dá)載體，其介導(dǎo)hMN-14 κ輕鏈和N-DDDl-Fd-hMN-14兩者的合成和分泌，它們組合形成N-DDDl-Fab-hMN-14。每個(gè)融合蛋白均通過DDDl結(jié)構(gòu)域的相互作用形成穩(wěn)定的同型二聚體。電穿孔之后，用所述細(xì)胞涂布96孔組織培養(yǎng)板，并用0. 05 μ M甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染克隆。使用涂布WI2(針對(duì)hMN-14的大鼠抗id單克隆抗體)的微量滴定板通過 ELISA篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并使用綴合HRP的山羊抗人Fab進(jìn)行檢測。產(chǎn)量最高的 C-DDDl-Fab-hMN14 Fab 和 N-DDDl_Fab_hMN14 Fab 克隆的初始產(chǎn)率分別為 60mg/L 和 6mg/L。使用ADl-Affigel 親和純化 N-DDD 1-hMN-14 和 C-DDDl_hMN_14使用DDD/AD相互作用對(duì)包含DDDl的構(gòu)建體進(jìn)行親和純化。ADl-C是通過合成制備的由ADI序列和羧基末端半胱氨酸殘基組成的肽，所述半胱氨酸殘基用于將該肽偶聯(lián)至Affigel (根據(jù)巰基與氯乙酸酐的反應(yīng))。包含DDD的a2結(jié)構(gòu)在中性pH下特異性結(jié)合 ADl-C-Affigel樹脂，并可在低pH(例如，pH 2. 5)下洗脫。使用單步ADl-C親和層析，從1. 2升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)Slmg C-DDDl-Fab-hMN-14。在加至ADl-C-affigel柱之前，培養(yǎng)基用超濾方法濃縮了約10倍。使用PBS將該柱洗脫至基線，然后使用0. IM甘氨酸、pH 2. 5洗脫C-DDDI-Fab_hMN_14。對(duì)洗脫液的SE-HPLC分析表明存在保留時(shí)間(8. 7分鐘)與107kDa蛋白(未顯示)一致的單一蛋白峰。純度還經(jīng)還原SDS-PAGE分析確認(rèn)，僅顯示預(yù)期為C-DDD 1-Fab-hMN-14的兩個(gè)多肽組分的分子大小的兩個(gè)條帶(未顯示)。如上所述，使用單步ADI-C親和層析，從1. 2升轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物中純化出總計(jì)IOmg N-DDDl-hMN-14。對(duì)洗脫液的SE-HPLC分析表明存在類似于C-DDDl_Fab_hMN-14的保留時(shí)間(8. 77分鐘)并與107kDa蛋白(未顯示)一致的單一蛋白峰。還原SDS-PAGE分析僅顯示對(duì)應(yīng)于N-DDD 1-Fab-hMN-14的多肽組分的兩個(gè)條帶(未顯示)。 C-DDDl-Fab-hMN-14的結(jié)合活性通過樣品的SE-HPLC分析確定，在所述樣品中，該試驗(yàn)品與不同量的WI2混合。WI2 Fab和C-DDD 1-Fab-hMN-14按0. 75 1的摩爾比混合制成的樣品顯示三個(gè)峰，對(duì)應(yīng)于未結(jié)合的C-DDDl-Fab-hMN14(8. 71分鐘)、結(jié)合一個(gè)WI2 Fab 的 C-DDD 1-Fab-hMN-14 (7. 95 分鐘)和結(jié)合兩個(gè) WI2 Fab 的 C-DDDl_Fab_hMN14 (7. 37 分鐘) (未顯示)。當(dāng)分析的樣品包含的WI2 Fab和C-DDD 1-Fab-hMN-14的摩爾比為4時(shí)，僅觀察到7. 36分鐘的單峰(未顯示)。這些結(jié)果證明，hMN14-Fab-DDDl為二聚體，并且有兩個(gè)活性結(jié)合位點(diǎn)。使用N-DDDl-Fab-hMN-14重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果非常相似。競爭性ELISA 證明，C_DDDl-Fab-hMN_14 和 N_DDDl-Fab-hMN_14 均以和 hMN-14 IgG相似的親和力與CEA結(jié)合，并且親和力顯著強(qiáng)于單價(jià)hMN-14 Fab (未顯示)。使用包含 hMN-14特異的CEA表位(A3B3)的融合蛋白涂布ELISA平板。實(shí)施例5. a2b復(fù)合物的形成a2b復(fù)合體形成的證據(jù)是由包含等摩爾的C-DDDl-Fab-hMN-14 (作為a2)和 h679-Fab-ADl (作為b)的混合物的SE-HPLC分析首先提供的。對(duì)此樣品進(jìn)行分析時(shí)，觀察到保留時(shí)間為8. 40分鐘的單一峰，這與形成了大于任何單獨(dú)的h679-Fab-ADl (9. 55分鐘)或 C-DDDl-Fab-hMN-14 (8. 73 分鐘)的新蛋白一致(未顯示)。當(dāng) hMN_14F (ab，)2 與h679-Fab-ADl混合，或者C-DDDl-Fab-hMN-14與679_Fab_NEM混合時(shí)，均未觀察到此高磁場位移，證明相互作用明確地通過DDDl和ADl結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)。使用h679-Fab-ADl和 N-DDD 1-Fab-hMN-14獲得非常相似的結(jié)果(未顯示)。使用BIAcore進(jìn)一步證明和鑒定了 DD1與AD1融合蛋白之間的特異性相互作用。此實(shí)驗(yàn)過程如下首先將h679-Fab-ADl或679_Fab_NEM結(jié)合到高密度的HSG偶聯(lián)的 (IMP239)傳感器芯片的表面，然后注射C-DDDl-Fab-hMN-14或hMN-14F(ab，)2來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 如所預(yù)期的，當(dāng)注射后者時(shí)，僅有h679-Fab-ADl和C-DDDl-Fab-hMN-14組合造成響應(yīng)單元的進(jìn)一步增加(未顯示)。使用h679-Fab-ADl與C-DDDl-Fab-hMN-14得到了相似的結(jié)果(未顯示)ο進(jìn)行平衡SE-HPLC實(shí)驗(yàn)以測定存在于各融合蛋白中的ADl與DDDl之間的特異性相互作用的結(jié)合親和力。發(fā)現(xiàn)h679-Fab-ADl與C-DDD 1-Fab_hMN_14、N-DDD 1-hMN-14和重組人RII α的商業(yè)樣品的結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)分別為15ηΜ、8ηΜ和30ηΜ。實(shí)施例6. DDD或AD融合蛋白的親和純化通過產(chǎn)生具有更低親和力?？康腄DD或AD蛋白來開發(fā)通用親和層析系統(tǒng)。由RI α 二聚體形成的DDD以與RII α相比較1/500的親和力(225ηΜ)結(jié)合AKAP-IS (ADl)。因此， 可產(chǎn)生從前44個(gè)氨基酸殘基形成的RI α 二聚體并且將其偶聯(lián)至樹脂以產(chǎn)生用于純化任何含ADl的融合蛋白的親和基質(zhì)。自然界存在許多較低親和力(0. 1 μ Μ) AKAP錨定結(jié)構(gòu)域。如果需要，可引入高度可預(yù)測的氨基酸替代以進(jìn)一步降低所述結(jié)合親和力。低親和力AD可通過合成或生物學(xué)方法制備，并可偶聯(lián)至樹脂以用于任何DDDl融合蛋白的親和純化。實(shí)施例7.用于產(chǎn)生二硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的載體N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2N-DDD2-hMN-14-pdHL2 是用于產(chǎn)生 N-DDD2_Fab-hMN_14 的表達(dá)載體，其擁有與 Fd 的氨基末端連接的DDD2的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域序列。DDD2通過15個(gè)氨基酸殘基的Gly/ Ser肽連接體偶聯(lián)至Vh結(jié)構(gòu)域。DDD2具有與DDDl的序列相同的二聚化序列和?？啃蛄?， 但是在它們之前具有半胱氨酸殘基。如下對(duì)所述表達(dá)載體進(jìn)行改造。通過合成制備兩個(gè)包含DDD2的1_13位殘基的重疊的互補(bǔ)寡核苷酸(DDD2上和DDD2下)。將所述寡核苷酸退火，并用T4多核苷酸激酶 (PNK)磷酸化，以在5’和3’端形成適合與分別用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI和PstI消化的 DNA連接的懸突。DDD2 上5，CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3，(SEQ ID NO 79)DDD2 下5，GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3，(SEQ ID NO 80)所述雙鏈體DNA與載體片段DDDl_hMN14 Fd_SV3(通過用NcoI和PstI消化制備)連接，以生成中間構(gòu)建體DDD2-hMN14 Fd_SV3。使用XhoI和EagI限制性核酸內(nèi)切酶，將包含DDD2-hMN14 Fd編碼序列的1. 28kb插入片段從所述中間構(gòu)建體上切下，然后將該片段連接至使用相同酶消化制備的hMN14-pdHL2載體DNA。最終的表達(dá)載體即為 N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。C-DDD2-Fd-hMN-14_pdHL2C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 是用于產(chǎn)生 C-DDD2_Fab-hMN_14 的表達(dá)載體，其具有通過14個(gè)氨基酸殘基的Gly/Ser肽連接體連接至Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域序列。如下對(duì)所述表達(dá)載體進(jìn)行改造。通過合成制備兩個(gè)包含連接體肽的部分的編碼序列(GGGGSGGGCG，SEQ ID NO 81)和DDD2的1_13位殘基的重疊的互補(bǔ)寡核苷酸。將所述寡核苷酸退火，并用T4 PNK磷酸化，以在5’和3’端形成適合與分別用限制性核酸內(nèi)切酶 BamHI和PstI消化的DNA連接的懸突。G4S-DDD2 上
5’ GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCT GCTGCA-3，(SEQ ID NO 82)G4S-DDD2 下5’ GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3 ，(SEQ ID NO 83)所述雙鏈DNA與穿梭載體CHl-DDDl-pGemT (邐過用BamHI和PstI消化制備)連接，以生成穿梭載體CHl-DDD2-pGemT。使用SacII和EagI將507bp片段從 CHl-DDD2-pGemT上切下，然后將該片段連接至使用SacII和EagI消化制備的IgG表達(dá)載體 hMN14(I)-pdHL2。最終的表達(dá)構(gòu)建體即為 C-DDD2-Fd-hMN_14-pdHL2。h679-Fd-AD2-pdHL2h679-Fd-AD2_pdHL2是用于產(chǎn)生h679-Fab_AD2的表達(dá)載體，其具有通過14個(gè)氨基酸殘基的Gly/Ser肽連接體連接至CHl的羧基末端的AD2的錨定結(jié)構(gòu)域序列。AD2在ADl 錨定結(jié)構(gòu)域序列的前后各有一個(gè)半胱氨酸殘基。如下對(duì)所述表達(dá)載體進(jìn)行改造。通過合成制備兩個(gè)包含AD2的編碼序列和部分連接體序列的重疊的互補(bǔ)寡核苷酸(AD2上和AD2下)。將所述寡核苷酸退火，并用T4 PNK磷酸化，在5’和3’端形成適合與分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和SpeI消化的DNA連接的
懸天οAD2 上5’ GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAA CGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3’ (SEQ ID NO 84)AD2 下5’ TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACA TCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’ (SEQ ID NO 85)所述雙鏈體DNA與穿梭載體CHl-ADl-pGemT (通過用BamHI和Spel消化制備)連接，以生成穿梭載體CHl-AD2-pGemT。使用SacII和EagI限制性內(nèi)切酶將包含CHl和AD2 編碼序列的429堿基對(duì)片段從所述穿梭載體上切下，然后將該片段連接至使用相同酶消化制備的h679-pdHL2載體。最終的表達(dá)載體即為h679-Fd_AD2-pdHL2。實(shí)施例8. TFl的產(chǎn)生如下進(jìn)行三價(jià)DNL構(gòu)建體(稱為TFl)的大規(guī)模制備。首先按照大致的化學(xué)計(jì)量濃度將 N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白 L-純化的)與 h679_Fab_AD2 (IMP-291-純化的)在 ImM EDTA, PBS, pH 7. 4中混合。加入TCEP之前，SE-HPLC未顯示出a2b形成的任何證據(jù)(未顯示)。而是具有代表a4(7. 97 分鐘；200kDa)、a2(8. 91 分鐘；IOOkDa)和B(10. 01 分鐘；50kDa) 的峰。加入5mM TCEP快速導(dǎo)致a2b復(fù)合物的形成，與150kDa蛋白一致的、在8. 43分鐘的新峰證明了這一點(diǎn)(未顯示)。該實(shí)驗(yàn)中顯然有過量的B，因?yàn)閷?duì)應(yīng)于h679-Fab-AD2 (9. 72 分鐘)的峰仍是明顯的，但是對(duì)應(yīng)于a2或a4則未見明顯的峰。還原反應(yīng)1小時(shí)后，針對(duì)幾次更換的PBS進(jìn)行透析過夜，除去TCEP。所得溶液加入10% DMSO并在室溫下保存過夜。當(dāng)用SE-HPLC分析時(shí)，代表a2b的峰明顯變尖，保留時(shí)間稍微降低了 0. 1分鐘，變?yōu)?. 31分鐘(未顯示)，根據(jù)我們先前的發(fā)現(xiàn)，這表示結(jié)合親和性的提高。該復(fù)合物通過 IMP-291親和層析進(jìn)一步純化以除去κ鏈雜質(zhì)。如所預(yù)期的，過量h679-AD2—起被純化出
40來，然后用制備型SE-HPLC除去(未顯示)。TFl是高度穩(wěn)定的復(fù)合物。當(dāng)測定TFl與HSG(IMP_239)傳感器芯片結(jié)合時(shí)，在樣品注射結(jié)束之后所觀察的響應(yīng)未見明顯降低，相比之下，當(dāng)在相似條件下測定含有等摩爾混合物的C-DDD 1-Fab-hMN-14和h679_Fab_ADl的溶液時(shí)，在樣品注射期間和剛注射完后， 所觀察到的響應(yīng)單元的增加伴隨著可檢測的下降，表明開始形成的a2b結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。此外， 盡管隨后注射WI2在針對(duì)TFl的響應(yīng)單元中引起大幅度的增加，但是對(duì)于C-DDD1/AD1混合物來說沒有明顯增加。因WI2與固定在傳感器芯片上的TFl結(jié)合而導(dǎo)致的響應(yīng)單元的額外增加，對(duì)應(yīng)于兩個(gè)完整的功能性結(jié)合位點(diǎn)，其各自是由N-DDD2-Fab-hMN-14的一個(gè)亞基引起的。TFl與 WI2的兩個(gè)Fab片段的結(jié)合能力證實(shí)了這一點(diǎn)(未顯示)。在含有h679-AD2和N-DDDl-hMN14 的混合物被正確還原和氧化成為TFl后，當(dāng)用BIAcore分析時(shí)，WI2幾乎沒有額外結(jié)合(未顯示)，表明二硫鍵穩(wěn)定的a2b復(fù)合物(例如TFl)僅通過DDD2與AD2的相互作用而形成。對(duì)該過程進(jìn)行了兩個(gè)改進(jìn)，以減少過程的時(shí)間和效率。首先，以a4/a2結(jié)構(gòu)混合物形式存在的稍微摩爾過量的N-DDD2-Fab-hMN-14與h679_Fab_AD2反應(yīng)，使得沒有游離的 h679-Fab-AD2存在，而未束縛至h679_Fab_AD2的任何a4/a2結(jié)構(gòu)以及輕鏈，都用IMP-291 親和層析除去。第二，疏水作用層析(HIC)代替透析或滲濾，在還原反應(yīng)后用于除去TCEP， 這不僅縮短過程時(shí)間，而且還增加了潛在病毒的去除步驟。將N-DDD2-Fab-hMN-14與 679-Fab-AD2混合，用5mM TCEP在室溫下還原1小時(shí)。向溶液加入0. 75M硫酸銨，然后上樣到Butyl FF HIC柱上。用含0. 75M硫酸銨、5mM EDTA的PBS洗柱，以除去TCEP。用PBS 從HIC柱上洗脫還原蛋白，加入10% DMS0。在室溫下孵育過夜后，用IMP-291親和層析分離出高度純化的TFl (圖22)。無需額外的純化步驟，例如凝膠過濾。實(shí)施例9. TF2的產(chǎn)生成功產(chǎn)生TF 1之后，將C-DDD2-Fab-hMN-14與h679_Fab_AD2反應(yīng)，也得到一種類似物，稱為TF2。如下產(chǎn)生具有超過90%的收率的試驗(yàn)批量的TF2。將蛋白L-純化的 C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)與 h679-Fab-AD2(60mg)以 1. 4 1 的摩爾比混合。在含有 ImM EDTA的PBS中，總蛋白質(zhì)濃度為1. 5mg/ml。后續(xù)步驟包括TCEP還原、HIC層析、DMSO 氧化和IMP-291親和層析，都與針對(duì)TFl所述的相同。加入TCEP之前，SE-HPLC未顯示出 a2b形成的任何證據(jù)(未顯示)。而是存在對(duì)應(yīng)于a4(8. 40分鐘；215kDa)、a2(9. 32分鐘； 107kDa)和b (10. 33分鐘；50kDa)的峰。加入5mM TCEP快速導(dǎo)致a2b復(fù)合物的形成，正如在8. 77分鐘的新峰所證明的那樣(未顯示)，該峰與二元結(jié)構(gòu)所預(yù)期的157kDa蛋白是一致的。用IMP-291親和層析將TF2純化至接近均質(zhì)(未顯示)。對(duì)IMP-291未結(jié)合級(jí)分進(jìn)行的SE-HPLC分析證明從產(chǎn)物中除去了 a4、a2和游離κ鏈(未顯示)。按照對(duì)于TFl所述的利用BIAC0RE測定TF2的功能。將TF2、 C-DDDl-hMN-14+h679-ADl (用作非共價(jià)a2b復(fù)合物的對(duì)照樣品)或 C-DDD2-hMN-14+h679-AD2 (用作非還原a2和b組分的對(duì)照樣品)稀釋至1 μ g/ml (總蛋白質(zhì))并且通過固定了 HSG的傳感器芯片。對(duì)TF2的響應(yīng)是兩個(gè)對(duì)照樣品反應(yīng)的約2倍，表明對(duì)照樣品中僅有h679-Fab-AD組分與傳感器芯片結(jié)合并保留在其上。隨后注射WI2IgG， 證明僅有TF2具有與h679-Fab-AD緊密結(jié)合的DDD-Fab-hMN_14組分，正如額外的信號(hào)響應(yīng)所示。因WI2與固定在傳感器芯片上的TF2結(jié)合而導(dǎo)致的響應(yīng)單元增加，也對(duì)應(yīng)于兩個(gè)完整的功能性結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)都是由C-DDD2-Fab-hMN-14的一個(gè)亞基引起。TF2與WI2的兩個(gè) Fab片段的結(jié)合能力證實(shí)了這一點(diǎn)(未顯示)。通過競爭性ELISA測定TF2的相對(duì)CEA-結(jié)合親合力。用含有CEA的A3B3結(jié)構(gòu)域的融合蛋白包被各板(0. 5 μ g/孔)，所述蛋白被hMN-14識(shí)別。連續(xù)稀釋TFl、TF2和 hMN-14IgG，一式四份，在含有綴合HRP的hMN-14IgG(lnM)的孔中溫育。數(shù)據(jù)顯示TF2以與 IgG的親合力至少相等的親合力結(jié)合CEA，比TFl強(qiáng)2倍(未顯示)。實(shí)施例10. TFl和TF2的血清穩(wěn)定性將TFl和TF2設(shè)計(jì)成可用于體內(nèi)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其中在血液和組織中會(huì)發(fā)生大量稀釋。用BIAC0RE評(píng)估人血清中TF2的穩(wěn)定性。將TF2用新鮮人血清(是從4個(gè)供體合并而獲得的)稀釋至0. lmg/ml并在5% C02、37°C溫育7天。每天樣品按1 25進(jìn)行稀釋， 然后通過BIAC0RE進(jìn)行分析，使用IMP-239HSG傳感器芯片。注射WI2IgG，用于定量測定完整而完全活性的TF2的量。將血清樣品與直接從原液稀釋的對(duì)照樣品相比較。TF2在血清中高度穩(wěn)定，7天后保持98%的其雙特異性結(jié)合活性(未顯示)。在人或小鼠血清中對(duì)于 TFl觀察到相似的結(jié)果(未顯示)。實(shí)施例11. C-H-AD2-IgG-pdHL2表達(dá)載體的產(chǎn)生pdHL2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體已被用于介導(dǎo)許多重組IgG的表達(dá)(Qu等人， Methods 2005,36:84-95)。產(chǎn)生質(zhì)粒穿梭載體以利于將任何IgG_pdHL2載體轉(zhuǎn)化為 C-H-AD2-IgG-pdHL2載體。使用pdHL2載體作為模板以及寡核苷酸Fc BglII左和Fc Bam-EcoRI右作為引物擴(kuò)增Fc (CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)的基因。Fc BrIII 左5，-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3，(SEQ ID NO 86)Fc Bam-EcoRI 右5，-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3，(SEQ ID NO 87)將擴(kuò)增引物克隆入pGemT PCR克隆載體。使用XbaI和BamHI限制性內(nèi)切酶從 PGemT切下Fc插入物片段，然后將其連接至用XbaI和BamHI消化h679-Fab_AD2-pdHL2而制備的AD2-pdHL2載體，以產(chǎn)生穿梭載體Fc-AD2-pdHL2。為了將任何IgG_pdHL2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化成C-H-AD2_IgG-pdHL2表達(dá)載體，從前者切下861bp BsrGI/Ndel限制性片段，將其替換為從Fc_AD2-pdHL2載體切下的952bp BsrGI/ NdeI限制性片段。BsrGI在CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)切割并且NdeI在表達(dá)盒的下游(3，)切割。實(shí)施例12. C-H-AD2-hLL2 IgG 的產(chǎn)生依帕珠單抗(或hLL2 IgG)是人源化抗-人⑶22 MAb。如實(shí)施例11中所述的， 從hLL2 IgG-pdHL2產(chǎn)生C_H-AD2_hLL2 IgG的表達(dá)載體，通過電穿孔將其用于轉(zhuǎn)染Sp2/0 骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，用所述細(xì)胞涂布96孔板，在含有甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)基因克隆。通過使用涂布hLL2-特異性抗-獨(dú)特型MAb的微量滴定板的夾心ELISA以及綴合過氧化物酶的抗-人IgG的檢測篩選克隆的C-H-AD2-hLL2 IgG產(chǎn)率。將克隆擴(kuò)增至轉(zhuǎn)瓶以制備蛋白質(zhì)，并在使用蛋白質(zhì)-A親和層析的單步驟中從耗盡的培養(yǎng)基純化C-H-AD2-hLL2 IgG。SE-HPLC分析對(duì)兩個(gè)蛋白峰進(jìn)行解析(未顯示)。慢洗脫峰的保留時(shí)間(8. 63分鐘) 與hLL2 IgG相似?？煜疵摲宓谋Ａ魰r(shí)間(7. 75分鐘)對(duì)應(yīng)于約300kDa蛋白質(zhì)。后來確定此峰代表C-H-AD2-hLL2-IgG的二硫鍵連接二聚體。此二聚體在DNL反應(yīng)中被還原為單體形式。SDS-PAGE分析表明，純化的C-H-AD2-hLL2-IgG由模塊的兩種單體和二硫鍵連接的二聚體形式組成(未顯示)。代表這兩種形式的蛋白質(zhì)條帶在非還原性條件下的SDS-PAGE中清晰可見，但是在還原條件下，所有形式均被還原為代表組成性多肽(重鏈-AD2和κ鏈) 的兩個(gè)條帶(未顯示)。未檢測到其它污染條帶。實(shí)施例13. C-H-AD2-hA20IgG 的產(chǎn)生hA20IgG為人源化抗人CD20MAb。按實(shí)施例27所述，從hA20IgG_pDHL2產(chǎn)生 C-H-AD2-hA20 IgG的表達(dá)載體，然后將該載體通過電穿孔轉(zhuǎn)染Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染之后，用所述細(xì)胞涂布96孔板，并在包含甲氨蝶呤的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因克隆。通過使用涂布hA20特異性抗獨(dú)特型MAb的96孔微量滴定板的夾心ELISA以及使用綴合過氧化物酶的抗人IgG的檢測篩選克隆的C-H-AD2-hA20 IgG產(chǎn)率。將克隆擴(kuò)增至轉(zhuǎn)瓶以制備蛋白質(zhì)，并在使用蛋白質(zhì)-A親和層析的單步驟中從耗盡的培養(yǎng)基純化C-H-AD2-hA20 IgG, SE-HPLC和 SDS-PAGE分析得到的結(jié)果與實(shí)施例28中獲得的C_H-AD2_hLL2 IgG的結(jié)果非常相似。實(shí)施例14. AD-和DDD-連接的來自多個(gè)抗體的Fab與IgG融合蛋白的產(chǎn)生通過使用前述實(shí)施例中描述的技術(shù)，構(gòu)建下列IgG或Fab融合蛋白，并將其整合入 DNL構(gòu)建體。所述融合蛋白保持親代抗體的抗原結(jié)合特征并且DNL構(gòu)建體顯示被整合的抗體或抗體片段的抗原結(jié)合活性。表2.包含IgG或Fab部分的融合蛋白
融合蛋白結(jié)合特異性
C-AD1-Fab-h679HSG
C-AD2-Fab-h679HSG
C-(AD2)2-Fab-H679 HSG C-AD2-IgG-h734銦-DTPA
C-AD2-IgG-hA20CD20
C-AD2-IgG-hA20LCD20
C-AD2-IgG-h L243 HLA-DR C-AD2-IgG-hLL2CD22
N-AD2-IgG-hLL2CD22
C-AD2-IgG-hMN-14 CEA C-AD2-IgG-hRlIGF-IR
C-AD2-IgG-hRS7EGP-I
4權(quán)利要求
1.一種包含3種不同效應(yīng)物部分的DNL (?？亢图渔i)構(gòu)建體，其中所述效應(yīng)物部分被連接至兩個(gè)來自蛋白激酶A(PKA)的DDD (二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域)部分和一個(gè)來自AKAP蛋白的AD (錨定結(jié)構(gòu)域)部分，以及其中所述兩個(gè)DDD部分形成二聚體并且與AD部分結(jié)合以形成DNL構(gòu)建體。
2.權(quán)利要求1所述的DNL構(gòu)建體，其中所述DDD部分具有來自人RIα、RI β、RII α或 RII β PKA的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的DNL構(gòu)建體，其中所述效應(yīng)物部分包含第一抗體或抗體片段、第二抗體或抗體片段以及一個(gè)或多個(gè)拷貝的細(xì)胞因子。
4.權(quán)利要求3所述的DNL構(gòu)建體，其中所述第一抗體或抗體片段和第二抗體或抗體片段結(jié)合兩種不同的抗原。
5.權(quán)利要求4所述的DNL構(gòu)建體，其中所述第一和第二抗體或抗體片段結(jié)合抗原，所述抗原選自碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、 CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、 CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、 CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA, CEACAM5、CEACAM-6、B7、纖連蛋白的 ED-B、因子 H、FHL-I、Flt_3、葉酸受體、GROB、HMGB-I、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、HM1. 24、胰島素樣生長因子-I(ILGF-I)、IFN-γ、IFN-α、IFN_3、IL_2、 IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、 IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-l、MIP-lA、MIP-lB、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、NCA-95、NCA-90、la、HMl. 24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le (y)、RANTES、TlOl、 TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、腫瘤壞死抗原、TNF-α、TRAIL 受體(Rl 和 R2)、 VEGFR、EGFR、P1GF、補(bǔ)體因子 C3、C3a、C3b、C5a、C5 和癌基因產(chǎn)物。
6.權(quán)利要求5所述的DNL構(gòu)建體，其中所述第一和第二抗體或抗體片段選自 hRl (抗-IGF-1R)、hPAM4 (抗-粘蛋白)、hA20 (抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、 hIMMU31 (抗-AFP)、hLLl(抗-CD74)、hLL2 (抗-CD22)、hMu_9 (抗-CSAp)、 hL243 (抗-HLA-DR)、hMN-14 (抗-CEACAM5)、hMN-15 (抗-CEACAM6)、hRS7 (抗-EGP-1)禾口 hMN-3(抗-CEACAM6)。
7.權(quán)利要求4所述的DNL構(gòu)建體，其中所述細(xì)胞因子選自人MIF(巨噬細(xì)胞游走抑制因子)、HMGB-I (高遷移率族框蛋白 1)、TNF-α、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6, IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15, IL-16、IL-17, IL-18, IL-19、IL-23、IL-24、 CCL19、CCL21、IL-8、MCP-l、RANTES、MIP-lA、MIP-lB、ENA-78、MCP-l、IP-10、Gro-3、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、干擾素-α、-β、_λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配體、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰島素、hGH、降鈣素、 因子VIII、IGF、促生長素抑制素、組織型纖溶酶原激活物和LIF。
8.權(quán)利要求4所述的DNL構(gòu)建體，其中所述第一抗體或抗體片段是veltuzumab，所述第二抗體或抗體片段是hLM3，并且所述細(xì)胞因子是人干擾素-α 2b。
9.權(quán)利要求8所述的DNL構(gòu)建體，其中所述hL243抗體或抗體片段包含重鏈 CDR 序列 CDRl (NYGMN, SEQ ID NO 1)、CDR2 (WINTYTREPTYADDFKG，SEQ ID NO 2)禾口 CDR3 (DITAVVPTGFDY，SEQ ID NO 3)以及輕鏈 CDR 序列 CDRl (RASENIYSNLA, SEQ ID NO 4)、CDR2 (AASNLAD, SEQ ID NO 5)和 CDR3(QHFWTTPWA, SEQ ID NO 6)。
10.權(quán)利要求1所述的DNL構(gòu)建體，其中所述3種效應(yīng)物部分是融合蛋白，每一種融合蛋白包含AD或DDD部分。
11.權(quán)利要求1所述的DNL構(gòu)建體，其中所述效應(yīng)物部分選自蛋白質(zhì)、肽、抗體、抗原結(jié)合抗體、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子、激素、酶、反義寡核苷酸、siRNA、毒素、核糖核酸酶、異源抗原、聚乙二醇(PEG)、抗-血管生成劑、細(xì)胞毒素劑和促細(xì)胞凋亡劑。
12.權(quán)利要求1所述的DNL構(gòu)建體，其中所述DDD部分具有SEQID NO :13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO :18 的氨基酸序列、SEQ ID NO :20 的前 44 個(gè)氨基酸、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22 或 SEQ ID NO :59 的前 44 個(gè)氨基酸。
13.權(quán)利要求1所述的DNL構(gòu)建體，其中所述AD部分具有SEQID NO 15, SEQ ID N0: 16、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、 SEQ ID NO 39,SEQ ID NO40,SEQ ID N0:41、SEQ ID NO 42,SEQ ID NO43,SEQ ID N0: 44,SEQ ID NO 45,SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO :48、M SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 57 或 SEQ ID NO 58 的氨基酸序列。
14.一種給受試者施用細(xì)胞因子的方法，包括給受試者施用根據(jù)權(quán)利要求4的DNL復(fù)合物。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一和第二抗體或抗體片段結(jié)合抗原，所述抗原選自碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CDl、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDllA、CD14、 CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、 CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、 CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA, CEACAM5, CEACAM-6、B7、纖連蛋白的ED-B、因子H、FHL-I、Flt_3、葉酸受體、GROB、HMGB-I、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、HMl. 24、胰島素樣生長因子-1 (ILGF-I)、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、 IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、 IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、 NCA-9 5、NCA-90、I a、HM1 · 24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le (y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、腫瘤壞死抗原、TNF-α、TRAIL 受體(Rl 和 R2)、VEGFR、 EGFR、P1GF、補(bǔ)體因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因產(chǎn)物。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一和第二抗體或抗體片段選自 hRl (抗-IGF-1R) hPAM4(抗-粘蛋白)、hA20 (抗-CD20)、hA19(抗-CD19), hIMMU31 (抗-AFP)、hLLl(抗-CD74)、hLL2(抗-CD22)、hMu_9 (抗-CSAp)、 hL243(抗-HLA-DR)、hMN-14(抗-CEA)、hMN-15 (抗-CEA)、hRS7 (抗-EGP-1)禾口 hMN-3(抗-CEA)。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自人MIF(巨噬細(xì)胞游走抑制因子)、HMGB-I (高遷移率族框蛋白 1)、TNF-α、IL-U IL-2, IL-3、IL-4、IL-5、IL-6, IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15, IL-16、IL-17, IL-18, IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-l、RANTES、MIP-lA、MIP-lB、ENA-78、MCP-l、IP-10、Gro-3、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、干擾素-α、-β、_λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配體、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰島素、hGH、降鈣素、 因子VIII、IGF、促生長素抑制素、組織型纖溶酶原激活物和LIF。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一抗體或抗體片段是veltuzumab，所述第二抗體或抗體片段是hLM3，并且所述細(xì)胞因子是人干擾素-α 2b。
19.一種治療選自癌癥、免疫功能失調(diào)和自身免疫性疾病的疾病的方法，包括給患有所述疾病的受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1的DNL構(gòu)建體。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述癌癥選自非何杰金氏淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、B 細(xì)胞白血病、T細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞白血病、急性淋巴樣白血病、慢性淋巴樣白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、多毛細(xì)胞白血病、急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、癌、黑素瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、皮膚癌、口腔癌、胃腸道癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌癥、宮頸癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、膽囊癌、腎癌和睪丸癌。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述自身免疫性疾病選自急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風(fēng)濕熱、多腺性綜合征、大皰性類天皰瘡、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、鏈球菌感染后的腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、高安(氏)動(dòng)脈炎、艾迪生病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、 結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、古德帕斯丘綜合征、血栓閉塞性脈管炎、斯耶格倫綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本氏甲狀腺炎、 甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動(dòng)性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰瘡、韋格納氏肉芽腫、膜性腎病、肌萎縮側(cè)索硬化、脊髓癆、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球腎炎、銀屑病或纖維性肺泡炎。
22.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述第一和第二抗體或抗體片段結(jié)合抗原，所述抗原選自碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CDl、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDllA、CD14、 CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、 CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、 CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA, CEACAM5, CEACAM-6、B7、纖連蛋白的ED-B、因子H、FHL-I、Flt_3、葉酸受體、GROB、HMGB-I、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、HMl. 24、胰島素樣生長因子-1 (ILGF-I)、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、 IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、 IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、 NCA-9 5、NCA-90、I a、HM1 · 24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le (y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、腫瘤壞死抗原、TNF- α、TRAIL 受體(Rl 和 R2)、VEGFR、 EGFR、P1GF、補(bǔ)體因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因產(chǎn)物。
23.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述第一和第二抗體或抗體片段選自 hRl (抗-IGF-1R) hPAM4(抗-粘蛋白)、hA20 (抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、 hIMMU31 (抗-AFP)、hLLl(抗-CD74)、hLL2(抗-CD22)、hMu_9 (抗-CSAp)、 hL243(抗-HLA-DR)、hMN-14(抗-CEA)、hMN-15 (抗-CEA)、hRS7 (抗-EGP-1)禾口hMN-3(抗-CEA)。
24.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自人MIF(巨噬細(xì)胞游走抑制因子)、HMGB-I (高遷移率族框蛋白 1)、TNF-α、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、 CCL19、CCL21、IL-8、MCP-l、RANTES、MIP-lA、MIP-lB、ENA-78、MCP-l、IP-10、Gro-3、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、干擾素-α、-β、_λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配體、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰島素、hGH、降鈣素、 因子VIII、IGF、促生長素抑制素、組織型纖溶酶原激活物和LIF。
25.權(quán)利要求19所述的方法，其中第一抗體或抗體片段是veltuzumab，所述第二抗體或抗體片段是hLM3，并且所述細(xì)胞因子是人干擾素-α 2b。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用?？?和-加鎖技術(shù)形成細(xì)胞因子-抗體復(fù)合物的方法和組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性免疫細(xì)胞因子DNL構(gòu)建體包含連接至Fab抗體片段和細(xì)胞因子的IgG抗體，其中IgG和Fab結(jié)合可在相同靶細(xì)胞上表達(dá)的不同靶抗原。雙特異性免疫細(xì)胞因子DNL構(gòu)建體與單獨(dú)的細(xì)胞因子、單獨(dú)的抗體、未綴合的細(xì)胞因子+抗體或甚至其它類型的細(xì)胞因子-抗體DNL構(gòu)建體相比較顯示提高的藥代動(dòng)力學(xué)、具有更長的血清半衰期和顯著更強(qiáng)的效力。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含綴合至抗HLA-DR Fab和IFNα2b的抗CD20 IgG抗體，雖然抗體、抗體片段和細(xì)胞因子的其它組合可用于形成所述本發(fā)明的DNL復(fù)合物。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102481348SQ201080038548
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
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