專利名稱：抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型免疫奶制品，特別是涉及一種含有抗阪歧腸桿菌特異性IgY的免疫奶制品及其制備方法。
背景技術(shù)：
2002年11月1日，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)從「惠氏」公司生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉中檢出阪歧腸桿菌(Enterobacter sakazakii)，并從市場上召回該公司的部分產(chǎn)品。隨后，其它國家的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)也先后在“美贊臣”等大型奶粉廠的嬰兒奶粉中檢測出阪歧腸桿菌等致病菌。
這就警示人類嬰兒配方奶粉并非無菌產(chǎn)品，可能含有致病的細(xì)菌，例如阪歧腸桿菌、沙門氏菌。
世界衛(wèi)生組織(WHO)指出，2004年法國兩名體重不足的嬰兒在醫(yī)院喝下遭細(xì)菌污染的嬰兒配方奶粉后夭折，類似的案例在新西蘭也有一例。WHO和聯(lián)合國食品專家推論，嬰兒配方奶粉遭細(xì)菌污染是造成感染，是導(dǎo)致早產(chǎn)兒和體重不足嬰兒生病的一個(gè)原因，甚至可能導(dǎo)致嚴(yán)重發(fā)育受損和死亡。
世界各國對嬰兒配方奶粉遭細(xì)菌污染的問題關(guān)切日深，2005年5月，192個(gè)會員國在的WHO大會最后一天一致通過決議指出，市面上的奶粉存在含阪歧腸桿菌等致病菌的嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)，呼吁為高危險(xiǎn)群(例如早產(chǎn)兒、體重不足、或免疫力差)的嬰兒準(zhǔn)備配方奶粉時(shí)，應(yīng)提高警覺。
由于被檢出奶粉產(chǎn)品中含有阪歧腸桿菌的廠家都是大藥廠，其奶粉產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中必定有高標(biāo)準(zhǔn)的無菌環(huán)境，出產(chǎn)前也肯定經(jīng)過嚴(yán)格滅菌工序；結(jié)果其產(chǎn)品中仍然被檢出有害的阪歧腸桿菌。這就告訴人們，目前的滅菌措施并不能杜絕阪歧腸桿菌。本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為這是一種生命力特強(qiáng)、耐藥性很強(qiáng)的特殊細(xì)菌，目前的消毒方法對其無能為力；而且它會附著在已經(jīng)消毒過的奶粉生產(chǎn)設(shè)備上(有報(bào)告指出生產(chǎn)嬰兒配方奶粉的設(shè)備上曾找到阪歧腸桿菌，此可能是已經(jīng)消毒的奶粉配方的潛在污染源頭)，造成奶粉生產(chǎn)商對其束手無策。迄今為止，全世界都尚未找到有效解決這一令人頭痛的問題之方法；因此，許多國際知名大型奶粉企業(yè)近年來產(chǎn)品銷量大幅滑坡，全球奶粉生產(chǎn)企業(yè)都面臨嚴(yán)重威脅。
阪歧腸桿菌為食源性致病菌，如果被新生兒特別是早產(chǎn)兒和免疫力弱的嬰兒吸食體內(nèi)，極易患膿毒癥、腸壞死癥和敗血癥，在某種情況下，死亡率高達(dá)80％。鑒于這種細(xì)菌對嬰幼兒危害很大，務(wù)必將其從嬰兒奶粉中清除?？墒牵@種特殊的細(xì)菌型種多變，生命力又非常強(qiáng)；目前的方法包括巴氏高溫消毒都無法消除它，又不可能在嬰兒奶粉中添加化學(xué)殺菌藥或抗生素，更何況普通化學(xué)殺菌劑和抗菌素對它也沒有多大效果。針對這一現(xiàn)狀，本發(fā)明提出一種創(chuàng)新方法，制備一種天然安全的抗阪歧腸桿菌特異性IgY，將其添加到嬰兒奶或奶粉中，嬰幼兒服用這種特殊奶或奶粉，其中所含的抗阪歧腸桿菌特異性IgY就會特異性與這種頑固的阪歧腸桿菌等致病菌結(jié)合，將其抑滅，從而避免阪歧腸桿菌等致病菌危害嬰幼兒身體健康。同時(shí)，由于腹瀉病是發(fā)展中國家小兒死亡的第一位原因，其中嬰幼兒輪狀病毒和大腸桿菌、沙門氏菌是主要病原體；特別是對輪狀病毒引致的腹瀉，全世界無藥可治，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有60萬嬰幼兒因此夭折。本發(fā)明采用特別技術(shù)將阪歧腸桿菌與沙門氏菌、大腸桿菌以及嬰幼兒輪狀病毒復(fù)合制成一種復(fù)合抗原免疫產(chǎn)蛋禽類，制備一種抗阪歧腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒等病原體的特異性復(fù)合IgY，將其添加到奶粉或液體奶中，制成一種安全奶粉；既可抑滅乳制品中殘留的阪歧腸桿菌和沙門氏菌等致病菌，又能同時(shí)有效抑滅對嬰幼兒生命威脅很大的嬰幼兒輪狀病毒，全面提升嬰幼兒免疫力，使嬰幼兒從此擺脫腹瀉的困擾。從而，為全球奶粉企業(yè)提供了一種切實(shí)有效的消滅阪歧腸桿菌的手段，既可提升這些企業(yè)的產(chǎn)品的功效和品質(zhì)又可增加其經(jīng)濟(jì)收益；同時(shí)，保護(hù)了千百萬嬰幼兒的健康和生命，具有很大的經(jīng)濟(jì)意義和社會意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有奶制品的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于為解決現(xiàn)有的奶制品中殘存阪歧腸桿菌等致病菌的問題，提供一種可有效排除阪歧腸桿菌或同時(shí)有效排除阪歧腸桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌以及嬰幼輪狀病毒對嬰幼兒的侵襲的新型免疫奶制品。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是，提供一種抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品，其特征在于，該奶制品中含有阪歧腸桿菌特異性IgY抗體。
本發(fā)明所提供的奶制品為嬰兒免疫奶或奶粉，其中阪歧腸桿菌特異性IgY抗體的含量為0.01-1‰。該奶制品中含有的阪歧腸桿菌特異性IgY抗體，還可以是抗阪歧腸桿菌、抗沙門氏菌、抗大腸桿菌和抗嬰幼兒輪狀病毒的復(fù)合IgY抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品的制備方法，其特征在于，包含以下步驟1)對普通奶制品中檢測到的殘留細(xì)菌以及從受感染人體內(nèi)獲取的病原體進(jìn)行分析，篩選并確定最常見的阪歧腸桿菌作為單一免疫抗原，或?qū)⒑Y選出的阪歧腸桿菌和沙門氏菌、大腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒一起作為復(fù)合免疫抗原；2)培養(yǎng)上述篩選出的阪歧腸桿菌，或同時(shí)培養(yǎng)阪歧腸桿菌和采用常規(guī)方法培飬沙門氏菌、大腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒；3)利用上述培養(yǎng)出的阪歧腸桿菌制備單一抗原，或者采用阪歧腸桿菌和沙門氏菌、大腸桿菌以及嬰幼輪狀病毒，制備含阪歧腸桿菌的復(fù)合抗原；4)利用所述阪歧腸桿菌單一抗原或含阪歧腸桿菌的復(fù)合抗原，對產(chǎn)蛋禽類進(jìn)行高免疫注射，并檢取免疫禽類所產(chǎn)的免疫蛋；5)取所述免疫蛋的蛋黃，制備相應(yīng)的阪歧腸桿菌特異性IgY抗體粗提物或復(fù)合IgY抗體粗提物；6)對所述阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體粗提物進(jìn)行純化，并進(jìn)行過濾處理以濾除各種細(xì)菌和病毒，得到相應(yīng)的阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體成品；7)取所述阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體成品按事先確定好的比例與液態(tài)奶或奶粉原料混合，制成相應(yīng)的抗阪歧腸桿菌免疫奶制品。
上述制備方法中，在所述步驟(3)中制備單一阪歧腸桿菌抗原的方法可以是取事先培養(yǎng)好的單一型種阪歧腸桿菌2×109/mL或多型種阪歧腸桿菌按各2×109/mL混合均勻得到阪歧腸桿菌混合液，再按10～1∶1～10的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻漿機(jī)中，以8,000～30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得含阪歧腸桿菌的單一抗原。
上述步驟(3)中制備單一阪歧腸桿菌抗原的方法也可以是取事先培養(yǎng)好的單一型種阪歧腸桿菌2×109/mL或多型種阪歧腸桿菌按各2×109/mL混合均勻得到阪歧腸桿菌混合液，然后置入超聲粉碎機(jī)中加以超聲粉碎，再將經(jīng)粉碎處理后的阪歧腸桿菌菌體混合液按10～1∶1～10比例加入福氏佐劑，即制得含阪歧腸桿菌菌體的單一抗原。
上述制備方法中，在所述步驟(5)中制備阪歧腸桿菌特異性IgY抗體粗提物或復(fù)合IgY抗體粗提物的方法為(i)取步驟4)中所得的免疫蛋洗凈并擦洗消毒，用打蛋機(jī)免疫蛋打碎，再用蛋黃篩篩濾除去蛋清，將留下的蛋黃攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4～6倍加入蒸餾水進(jìn)行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5～6.0之間；(ii)將調(diào)整好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵淅鋮s至2～6℃，靜置12～24小時(shí)；(iii)將稀釋液置入高速離心分離機(jī)中，離心分離20分鐘；(iv)將離心分離所得的上清液再置入超濾器中進(jìn)行超濾并濃縮10～20倍，按0.1～0.3％的比例向濃縮后的漿料中加入海藻酸鈉，充分?jǐn)嚢?；再置入高速離心機(jī)中進(jìn)行離心分離，取上清液，去除脂蛋白；并將離心分離后的漿料置入超濾機(jī)中，經(jīng)過超微膜，進(jìn)行過濾除菌；(v)將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，即制得抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體粗提物或特異性復(fù)合IgY抗體粗提物。
上述制備方法中，步驟(7)制備抗阪歧腸桿菌免疫奶制品的方法是取經(jīng)前述步驟所制得抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體干粉或復(fù)合IgY抗體干粉，按實(shí)現(xiàn)確定好的比例添加到奶粉原料中，采取等量放大勻化法用干粉攪拌機(jī)充分混和勻化，即制成含抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體的免疫奶粉。
上述步驟(7)中制備抗阪歧腸桿菌免疫奶制品的方法還可以是取取經(jīng)前述步驟所制得阪歧腸桿菌特異性IgY抗體液體或復(fù)合IgY抗體液體，按實(shí)現(xiàn)確定好的比例與液態(tài)奶混合，再置入攪拌機(jī)中充分?jǐn)嚢杌旌蛣蚧纯芍瞥珊嫫缒c桿菌特異性IgY抗體抗體或復(fù)合IgY抗體的免疫液態(tài)奶；也可將該液態(tài)奶再經(jīng)冷凍干燥或在60～140℃溫度下進(jìn)行噴霧干燥，制成含抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體的免疫奶粉。
由于卵黃免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk，簡稱IgY)屬IgG類免疫球蛋白，能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，從而抑制或改變了該抗原(為某些細(xì)菌或病毒)的狀態(tài)或活性，并通過調(diào)理作用，促進(jìn)分葉核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞對細(xì)菌或病毒的吞噬；它能與病毒結(jié)合，改變病毒表面的構(gòu)像，阻止病毒吸附于易感細(xì)胞，同時(shí)，形成的病毒-IgY免疫復(fù)合物會被巨噬細(xì)胞吞噬。研究表明，IgY屬天然物質(zhì)，沒有任何藥味，又不會誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性；因然很適合作為一種新型抗菌物質(zhì)加入嬰兒奶制品中。同時(shí)，本發(fā)明創(chuàng)造性地采用抗阪歧腸桿菌特異性IgY這種新型抗體物質(zhì)來解決阪歧腸桿菌污染嬰兒奶粉這一困擾全球奶品業(yè)的難題，還基于發(fā)明人獨(dú)到地發(fā)現(xiàn)IgY應(yīng)用在這里將會發(fā)揮以下其它抗體所沒有的優(yōu)點(diǎn)1)由于進(jìn)化的差異，IgY可和抗原上多個(gè)抗原決定簇起反應(yīng)，這就起了一個(gè)信號放大作用；其靈敏度和抗體活性也比一般哺乳動(dòng)物包括牛的IgG高得多(只需50微克/mL濃度就有理想的特異性活性)，同時(shí)，IgY不會誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。這樣就為解決生命力特強(qiáng)、亞型變化多的頑固阪歧腸桿菌的耐藥性問題創(chuàng)造了條件；2)不會產(chǎn)生交叉血清反應(yīng)或過敏反應(yīng)；也不會將人的病原體帶入人體內(nèi)。這一點(diǎn)對于作為食品添加成份供給免疫能力十分薄弱的嬰幼兒使用，顯得特別重要。
3)試驗(yàn)證明IgY可抵抗胃蛋白酶和腸道胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶對其活性的破壞，能通過胃到達(dá)小腸被人體吸收；這就使其能加入奶粉，通過口服達(dá)到效果。
4)所制的抗體具有類似單克隆抗體的一致性；使得最終產(chǎn)品質(zhì)量和性能穩(wěn)定?？贵w制備成本比從牛等哺乳動(dòng)物中制備低得多。這就為本發(fā)明能在全球奶業(yè)中大面積推廣應(yīng)用提供了保證，具有確切可行的實(shí)用性。
5)雞蛋黃中含有豐富卵磷脂，對嬰幼兒大腦發(fā)育很有益，可制備一種含卵磷脂的IgY抗體。
因此，發(fā)明人經(jīng)過大量的研究試驗(yàn)和對比分析后，選擇制備一種新型的能特異性對抗阪歧腸桿菌的IgY抗體或復(fù)合抗體作為抑滅頑固阪歧腸桿菌等病原體的最理想物質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
一.抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶粉的制備1.制作抗阪歧腸桿菌特異性IgY或抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY1.1.根據(jù)近年來檢驗(yàn)檢疫部門在普通嬰兒奶粉中檢測到的殘留細(xì)菌以及受感染兒童體內(nèi)獲取的病原體，篩選確定常見的四型種的阪歧腸桿菌和沙門氏菌為代表性致病菌，另選擇大腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒作為嬰幼兒腹瀉主要病原體。
1.2.分別培養(yǎng)阪歧腸桿菌和沙門氏菌、大腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒1.2.1.阪歧腸桿菌向美國病毒中心(ATCC)購買四種有代表性的阪歧腸桿菌，編號如下I.No.BAA-8942001年從美國因食用奶粉感染阪歧腸桿菌的人體中提出的品種；II.No.29004寄生在陰溝阪歧腸桿菌(Enterobacter cloacae)[此品種由美國CDC從臨床兒童體內(nèi)獲取培養(yǎng)成]；III.No.29544寄生在兒童體內(nèi)阪歧腸桿菌變種(Enterobacter flavus)[此品種由臨床兒童喉中提出培養(yǎng)成]；IV.No.51329阪歧腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株。
然后分別用下列方法培養(yǎng)；再用蔗糖密度梯度超速離心法或凝膠柱層析法純化培養(yǎng)基ATCC#3大菜湯營養(yǎng)大菜湯(BD234000)ATCC#3瓊脂營養(yǎng)瓊脂(BD213000)環(huán)境 溫度30℃大氣環(huán)境帶氧培飬步驟[1]按附上的指示打開小瓶[2]用一支#3大菜湯(5-6mL)，用滴管吸0.5-1.0mL或移液管吸1mL，滴到小管內(nèi)將整粒菌球浸活。
以無菌方式將同等量抽回大菜湯。搖勻。
從大菜湯中抽取數(shù)滴種到另一支大菜湯或#3傾斜瓊脂或/及瓊脂碟。
在30℃中培養(yǎng)24小時(shí)。
在#3碟上生長的菌落是全緣的、平滑的、閃亮的、及微窿起的，并帶有黃色斑點(diǎn)。
1.2.2.沙門氏菌、大腸桿菌、嬰幼兒輪狀病毒從嬰幼兒腹瀉患者糞便中中分離得到沙門氏菌、大腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒，委托中國「江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室」采用常規(guī)方法培養(yǎng)，然后在香港雅臣藥業(yè)集團(tuán)(遠(yuǎn)東)有限公司本身所屬的「雅臣生命科學(xué)院」純化。
1.3.制備單一抗原或復(fù)合抗原1.3.1.制備不同的含阪歧腸桿菌或阪歧腸桿菌體的單一抗原1.3.1.1.先將培養(yǎng)好的單一型阪歧腸桿菌種2×109/mL或2-4型阪歧腸桿菌種按各2×109/mL混合均勻得到阪歧腸桿菌混合液；再按10-1∶1-10比例加入福氏佐劑(最佳比例為1∶1)。然后將它們置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得含阪歧腸桿菌的單一抗原。
1.3.1.2.為了進(jìn)一步提高所制備的IgY對付多型種和耐藥的阪歧腸桿菌之生物活性，本發(fā)明先將培養(yǎng)好的單一型種液2×109/mL或2-4型種阪歧腸桿菌按各2×109/mL混合均勻，得到阪歧腸桿菌混合液，置入超聲粉碎機(jī)中加以超聲粉碎；再將經(jīng)特殊粉碎處理后的菌體混合液按10-1∶1-10比例加入福氏佐劑(最佳比例為1∶1)，即制得含阪歧腸桿菌菌體的單一抗原。
1.3.2.制備復(fù)合抗原1.3.2.1.先將培養(yǎng)好的No.BAA-894型阪歧腸桿菌(2×109/mL)、大腸桿菌(2×109/mL)和沙門氏菌(2×109/mL)按1-10∶10-1∶10-1比例混合，最佳比例為2∶0.5∶1；然后置入超聲粉碎機(jī)中加以超聲粉碎。
1.3.2.2.再將這三種菌之混合物與已培養(yǎng)好并純化的輪狀病毒液按10-1∶1-10比例混合，最佳比例為3∶1；將所制得的抗原混合液，充分混和均勻，然后，按10-1∶1-10比例加入福氏佐劑，最佳比例為1∶1，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得復(fù)合抗原。
1.4.制備免疫蛋1.4.1.采用以上述方法制備的單一抗原或復(fù)合抗原，對產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行免疫；1.4.2.每隔二周再強(qiáng)化注射一次，計(jì)免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫后的母雞所產(chǎn)免疫蛋，并加以編碼標(biāo)記。
1.4.3.以上免疫方法和注射頻率可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整和變化；也可應(yīng)用上述同樣的免疫技術(shù)，采用上述抗原，分別對產(chǎn)蛋母鴨、產(chǎn)蛋母鵝、產(chǎn)蛋火雞、或產(chǎn)蛋鴕鳥等不同產(chǎn)蛋禽類進(jìn)行免疫，得到相應(yīng)的免疫蛋。
1.5.抗阪歧腸桿菌特異性IgY或特異性復(fù)合IgY的制備1.5.1.首先用流動(dòng)水洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋機(jī)將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進(jìn)行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間。
1.5.2.將調(diào)整好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵淅鋮s至2-6℃，靜置12小時(shí)-24小時(shí)；將稀釋液加入高速離心分離機(jī)中，離心分離20分鐘；1.5.3.將分離所得的上清再加入超濾器中進(jìn)行超濾并濃縮10-20倍，按0.1-0.3％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢?；再加入高速離心機(jī)中離心，取上清，去除脂蛋白；將離心分離后的漿料加入超濾機(jī)，過超微膜，進(jìn)行過濾除菌；1.5.4.將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，分別制得抗阪歧腸桿菌特異性IgY或特異性復(fù)合IgY粗提物。
1.5.5.應(yīng)用SDS-PAGE電泳測定法，分別對按以上工藝所制得的特異性IgY或特異性復(fù)合IgY粗提物進(jìn)行檢測，測得其中純IgY含量均為50％以上。
1.6.抗阪歧腸桿菌特異性IgY或特異性復(fù)合IgY的純化將以上抗阪歧腸桿菌特異性IgY或特異性復(fù)合IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸鹽緩沖液)液中，再先后過離子交換柱和凝膠層析柱層析，即制得抗阪歧腸桿菌特異性IgY或特異性復(fù)合IgY成品。
1.7.對所制得的抗阪歧腸桿菌特異性IgY或抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY，參照常規(guī)“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))分別進(jìn)行活性檢測。
檢測結(jié)果顯示，抗阪歧腸桿菌特異性IgY對阪歧腸桿菌的抗體結(jié)合效價(jià)都達(dá)到1∶1,024以上?？冠嫫缒c桿菌特異性復(fù)合IgY對阪歧腸桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抗體結(jié)合效價(jià)都達(dá)到1∶1,024以上，對輪狀病毒的抗體結(jié)合效價(jià)則達(dá)到1∶4,096。以上測試樣本的IgY濃度均為1mg/mL。
2.制作含抗阪歧腸桿菌特異性IgY或復(fù)合IgY的免疫奶制品2.1.干粉混合法將所制得的抗阪歧腸桿菌特異性IgY或抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY干粉以適當(dāng)比例添加到嬰兒免疫奶粉中，采取等量放大勻化法用干粉攪拌機(jī)充分混和勻化，即制成含抗阪歧腸桿菌和抗嬰兒腹瀉病原體之抗體或復(fù)合抗體之嬰兒免疫安全奶粉。
2.2.液態(tài)混合法將1.5所制得的抗阪歧腸桿菌特異性IgY或抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY液體經(jīng)過過濾除菌后，不要冷凍干燥，按一定比例與普通鮮奶汁混合，置入攪拌機(jī)中充分?jǐn)嚢杌旌蛣蚧?，即制成含抗阪歧腸桿菌和抗嬰兒腹瀉病原體之抗體或復(fù)合抗體之嬰兒免疫安全奶。將這種嬰兒免疫安全奶采用泠涷干燥或以60-140℃溫度進(jìn)行噴霧干燥(注意如用噴霧干燥，干燥時(shí)間要盡量縮短，以免影響其中IgY的抗體活性)，即制成含抗阪歧腸桿菌和抗嬰兒腹瀉病原體抗體或復(fù)合抗體之嬰兒免疫安全奶粉。
二.試驗(yàn)例1.試驗(yàn)例11.1.采用常規(guī)方法培養(yǎng)NO.BAA-894型阪歧腸桿菌和沙門氏菌。然后分別用以下兩種方法處理1.1.1.將NO.BAA-894型阪歧腸桿菌(2×109)、沙門氏菌(2×109)按1∶1比例混合后加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得阪歧腸桿菌和沙門氏菌的原菌抗原。
1.1.2.將NO.BAA-894型阪歧腸桿菌(2×109)、沙門氏菌(2×109)按1∶1比例混合后先加入超聲粉碎機(jī)超聲粉碎；再把所得菌體混合液以1∶1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得阪歧腸桿菌和沙門氏菌的菌體抗原。
1.2.分別用這種兩種抗原免疫雞，得到相應(yīng)的免疫蛋。并采用前敘方法中制備的兩種抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性IgY。
1.3.分別以NO.BAA-894型、NO.29004型、NO.29544型、NO.51329型阪歧腸桿菌以及沙門氏菌和輪狀病毒作檢測抗原，用常規(guī)“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測所制得的兩種抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性IgY對這6種不同抗原的抗體結(jié)合效價(jià)。結(jié)果如下表


(注測試樣本中的濃度均為1mg/mL)從以上檢測結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明的將抗原原菌用超聲粉碎后加入高速勻漿機(jī)制成油包水菌體抗原，免疫禽類后所制備的抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性IgY，對未作為抗原免疫的其它型種的阪歧腸桿菌也有很高的抗體結(jié)合效價(jià)，即所制成的IgY可以對抗多種型種的阪歧腸桿菌。也就是提示我們，「菌體抗原免疫」比「原菌抗原免疫」效果好得多。這一點(diǎn)對于型種變化大的阪歧腸桿菌有著特別重要的意義。試驗(yàn)結(jié)果也表明，由于沒有將輪狀病毒作為抗原免疫，所制得的兩種特異性IgY對輪狀病毒都沒有抗體結(jié)合效價(jià)。
2.試驗(yàn)例2先將培養(yǎng)好的NO.BAA-894型種阪歧腸桿菌(2×109/mL)、大腸桿菌(2×109/mL)和沙門氏菌(2×109/mL)按2∶1∶1比例混合；然后置入超聲粉碎機(jī)中加以超聲粉碎。再將這三種菌之混合物與已培養(yǎng)好并純化的輪狀病毒液按3∶1比例混合；將所制得的抗原混合液，充分混和均勻，然后，按1∶1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，制成復(fù)合抗原。
用這種復(fù)合抗原免疫雞，得到相應(yīng)的免疫蛋。并采用前敘方法制備的抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性復(fù)合IgY，分別以NO.BAA-894型、NO.29004型、NO.29544型、NO.51329型阪歧腸桿菌以及沙門氏菌、大腸桿菌和輪狀病毒作檢測抗原，用常規(guī)“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測所制得的抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性復(fù)合IgY對這7種不同抗原的抗體結(jié)合效價(jià)。
結(jié)果如下表

(注測試樣本中的濃度為1mg/mL)從以上檢測結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明的將細(xì)菌抗原原菌用超聲粉碎后再與輪狀病毒混合，然后加入高速勻漿機(jī)制成油包水復(fù)合抗原，免疫禽類后所制備的抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性復(fù)合IgY，對4種型種的阪歧腸桿菌以及沙門氏菌、大腸桿菌、輪狀病毒有很高的抗體結(jié)合效價(jià)，即所制成的復(fù)合IgY可以對抗多種型種的阪歧腸桿菌以及沙門氏菌、大腸桿菌和輪狀病毒。
3.試驗(yàn)例3將NO.BAA-894型阪歧腸桿菌(2×109)、沙門氏菌(2×109)按1∶1比例混合后先加入超聲粉碎機(jī)超聲粉碎；再把所得菌體混合液以1∶1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，制成阪歧腸桿菌和沙門氏菌的菌體抗原。分別用這種兩種抗原免疫雞，得到免疫蛋。并采用前敘方法制備抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性IgY。將這種抗阪歧腸桿菌特異性IgY液體經(jīng)過過濾除菌后，按一定比例與普通鮮奶汁混合，置入攪拌機(jī)中充分?jǐn)嚢杌旌蛣蚧蝗缓笠?0-140℃溫度進(jìn)行噴霧干燥，即制成含抗阪歧腸桿菌抗體之嬰兒免疫安全奶粉。用純水稀釋這種免疫安全奶粉制成1mg/mL濃度(IgY含量)的溶液；然后，分別以NO.BAA-894型、NO.29004型、NO.29544型、NO.51329型阪歧腸桿菌和沙門氏菌作檢測抗原，用常規(guī)“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測所制得的含抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性IgY的免疫安全奶粉溶液對這5種不同抗原的抗體結(jié)合效價(jià)。結(jié)果如下表

(注測試樣本中的濃度為1mg/mL)以上檢測結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法所制成的含抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性Ig的免疫安全奶粉對多種型種的阪歧腸桿菌以及沙門氏菌都有很高的抗體結(jié)合效價(jià)，即對這些致病菌有理想的抑制作用。
4.試驗(yàn)例4將所培養(yǎng)的NO.BAA-894型種阪歧腸桿菌(2×109/mL)、大腸桿菌(2×109/mL)和沙門氏菌(2×109/mL)按2∶1∶1比例混合；然后置入超聲粉碎機(jī)中加以超聲粉碎。再將這三種菌之混合物與已培養(yǎng)好并純化的輪狀病毒液按3∶1比例混和均勻，再按1∶1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化制成復(fù)合抗原。
用這種復(fù)合抗原免疫雞，得到相應(yīng)的免疫蛋。并采用前敘方法制備抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌特異性復(fù)合IgY。將所制得的抗阪歧腸桿菌特異性IgY或抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY干粉以適當(dāng)比例添加到嬰兒免疫奶粉中，采取等量放大勻化法用干粉攪拌機(jī)充分混和勻化，即制成含抗阪歧腸桿菌和抗嬰兒腹瀉病原體之抗體或復(fù)合抗體之嬰兒免疫安全奶粉。用純水稀釋這種免友安全奶粉制成1mg/mL濃度(IgY含量)的溶液；然后，分別以NO.BAA-894型、NO.29004型、NO.29544型、NO.51329型阪歧腸桿菌和沙門氏菌、大腸桿菌以及嬰幼兒輪狀病毒作檢測抗原，用常規(guī)“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測所制得的含抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY的免疫安全奶粉溶液對這7種不同抗原的抗體結(jié)合效價(jià)。結(jié)果如下表

(注測試樣本中的濃度為1mg/mL)以上檢測結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法所制成的含抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY的免疫安全奶粉對多種型種的阪歧腸桿菌以及沙門氏菌、大腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒都有很高的抗體結(jié)合效價(jià)，即能有效抑制這些病原體。
5.試驗(yàn)例5--抗阪歧腸桿菌特異性IgY抑菌、殺菌試驗(yàn)。
5.1.試驗(yàn)材料和儀器5.1.1.抗阪歧腸桿菌特異性IgY0.1％水溶液，5.1.2.阪歧腸桿菌和沙門氏菌，5.1.3.營養(yǎng)瓊脂，5.1.4.營養(yǎng)肉湯，5.1.5.5％羊血營養(yǎng)肉湯，5.1.6.培養(yǎng)箱，5.1.7.721分光光度計(jì)，5.1.8.生理鹽水，5.1.9.吸管，5.1.10.天平。
5.2.試驗(yàn)方法5.2.1.抑菌(MIC)實(shí)驗(yàn)方法取9支無菌試管，每支試管中加入1mL營養(yǎng)肉湯或1mL 5％牛血清營養(yǎng)肉湯和1mL已調(diào)整好濃度的細(xì)菌液(阪歧腸桿菌OD600＝0.3；沙門氏菌OD600＝0.2)。然后第一支試管加入1mL的IgY水溶液，待充分混勻后吸出1mL液體加入第二管，充分混勻后吸出1mL液體加入第三管......，依次倍比稀釋，稀釋比為1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32......。第十管為不加IgY的水溶液，作為陽性對照。將試管放置培養(yǎng)箱，35℃培養(yǎng)過夜。第二天觀察試管培養(yǎng)液澄清度，最高稀釋度的澄清管為抑菌管，計(jì)算抑菌濃度(MIC)。
5.2.2.殺菌(MBC)實(shí)驗(yàn)方法將上述培養(yǎng)過夜的試管中液體搖勻，從試管中取一接種環(huán)液體接種于血營養(yǎng)瓊脂平板上作次代培養(yǎng)。將血營養(yǎng)瓊脂平板放置培養(yǎng)箱，35℃培養(yǎng)過夜，第二天觀察結(jié)果，殺菌(MBC)的培養(yǎng)皿無菌落生長。
5.3.結(jié)果5.3.1.抑菌(MIC)觀察培養(yǎng)24小時(shí)后最高稀釋度的澄清管為抑菌管，此管的稀釋度為抑菌的稀釋比。
5.3.2.殺菌(MBC)觀察血營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24小時(shí)后觀察菌落，最高稀釋度的無細(xì)菌生長的培養(yǎng)皿為殺菌稀釋比。
抑菌(MIC)表

殺菌(MBC)表

試驗(yàn)結(jié)果表明抗阪歧腸桿菌特異性IgY對阪歧腸桿菌和沙門氏菌有很強(qiáng)的抑滅作用。
三.實(shí)施例實(shí)施例1--用純水提取法制備抗阪歧腸桿菌特異性雞IgY1.1.向美國病毒中心(ATCC)購買四種有代表性的阪歧腸桿菌，編號如下I.No.BAA-8942001年從美國因食用奶粉感染阪歧腸桿菌的人體中提出的品種II.No.29004寄生在陰溝阪歧腸桿菌(Enterobacter cloacae)[此品種由美國CDC從臨床兒童體內(nèi)獲取培養(yǎng)成]III.No.29544寄生在兒童體內(nèi)阪歧腸桿菌變種(Enterobacter flavus)[此品種由臨床兒童喉中提出培養(yǎng)成]IV.No.51329阪歧腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株；1.2.然后分別用下敘方法培養(yǎng)；再用蔗糖密度梯度超速離心法或凝膠柱層析法純化，分別得到提純的四種有代表性的阪歧腸桿菌；具體培飬方法如下培養(yǎng)基 ATCC#3大菜湯營養(yǎng)大菜湯(BD234000)ATCC#3瓊脂營養(yǎng)瓊脂(BD213000)環(huán)境溫度30℃大氣環(huán)境帶氧培飬步驟[1]按附上的指示打開小瓶[2]用一支#3大菜湯(5-6mL)，用滴管吸0.5-1.0mL或移液管吸1mL，滴到小管內(nèi)將整粒菌球浸活。
以無菌方式將同等量抽回大菜湯。搖勻。
從大菜湯中抽取數(shù)滴種到另一支大菜湯或#3傾斜瓊脂或/及瓊脂碟。
在30℃中培養(yǎng)24小時(shí)。
在#3碟上生長的菌落是全緣的、平滑的、閃亮的、及微窿起的，并帶有黃色斑點(diǎn)。
1.3.將以上培飬得到的四種阪歧腸桿菌按1∶1∶1∶1比例(各2×109)混合均勻，然后將此混合液再與沙門氏菌(2×109)按3∶1比例混合，再加入超聲粉碎機(jī)超聲粉碎；最后把所得菌體混合液以1∶1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，制成阪歧腸桿菌和沙門氏菌的菌體抗原；1.4.以所制作的多種阪歧腸桿菌和沙門氏菌的菌體抗原免疫健康的產(chǎn)蛋母雞50只，每只肌內(nèi)注射1mL，每隔二周注射一次，共計(jì)三次；
1.5.第一次注射后第20天開始檢取免疫蛋，至第7個(gè)月將所檢得的7,500只免疫蛋用流動(dòng)水沖凈，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋殼，以蛋黃篩濾去蛋清，留取蛋黃加5倍蒸餾水?dāng)噭?，?.0N HCl調(diào)pH至5.5-6.0，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，于10,000rpm離心20分鐘，取上清進(jìn)行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現(xiàn)渾濁；再加入2.0％CaCI2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃過夜10小時(shí)；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌，UltiporVFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥；即制得抗阪歧腸桿菌特異性IgY粗提物750克；1.6.將以上IgY粗提物先后過離子交換樹脂柱和凝膠層析柱層析，即制得抗阪歧腸桿菌特異性IgY純品150克。
實(shí)施例2--用純水提取法制備抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY2.1.向美國病毒中心(ATCC)購買最有代表性的阪歧腸桿菌，編號No.BAA-894；2.2.然后采用以下方法培飬培養(yǎng)基 ATCC#3大菜湯營養(yǎng)大菜湯(BD234000)ATCC#3瓊脂營養(yǎng)瓊脂(BD213000)環(huán)境溫度30℃大氣環(huán)境帶氧培飬步驟[1]按附上的指示打開小瓶[2]用一支#3大菜湯(5-6mL)，用滴管吸0.5-1.0mL或移液管吸1mL，滴到小管內(nèi)將整粒菌球浸活。
以無菌方式將同等量抽回大菜湯。搖勻。
從大菜湯中抽取數(shù)滴種到另一支大菜湯或#3傾斜瓊脂或/及瓊脂碟。
在30℃中培養(yǎng)24小時(shí)。
在#3碟上生長的菌落是全緣的、平滑的、閃亮的、及微窿起的，并帶有黃色斑點(diǎn)。
再用蔗糖密度梯度超速離心法或凝膠柱層析法純化。得到提純的這種最有代表性的阪歧腸桿菌；2.3.委托“江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室”從嬰幼兒腹瀉患者糞便中中分離得到沙門氏菌、大腸桿菌、嬰幼兒輪狀病毒，然后采用常規(guī)方法培養(yǎng)，再純化；2.4.制備復(fù)合抗原2.4.1.先將培養(yǎng)好的No.BAA-894阪歧腸桿菌2×109/mL、大腸桿菌(2×109/mL)和沙門氏菌(2×109/mL)按2∶0.5∶1比例混合；然后置入超聲粉碎機(jī)中加以超聲粉碎；2.4.2.再將這三種菌之混合物與已培養(yǎng)好并純化的輪狀病毒液按2∶1比例混合，將所制得的抗原混合液，充分混和均勻；然后，按1∶1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，制得復(fù)合抗原；2.5.制備免疫蛋采用所制備的復(fù)合抗原，對產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行免疫；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，計(jì)免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫后的母雞所產(chǎn)免疫蛋；2.6.抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY的制備2.6.1.首先用流動(dòng)水洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋機(jī)將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進(jìn)行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間；2.6.2.將調(diào)整好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12小時(shí)-24小時(shí)；將稀釋液加入高速離心分離機(jī)中，離心分離20分鐘；2.6.3.將分離所得的上清再加入超濾器中進(jìn)行超濾并濃縮10-20倍，按0.1-0.3％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢?；再加入高速離心機(jī)中離心，取上清，去除脂蛋白；將離心分離后的漿料加入超濾機(jī)，過超微膜，進(jìn)行過濾除菌；將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，則制成抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY粗提物；2.6.4.應(yīng)用SDS-PAGE電泳測定法，對所制得的抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY粗提物進(jìn)行檢測，測得其中純IgY含量為50％以上；2.6.5.抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY的純化將抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸鹽緩沖液)液中，再先后過離子交換柱和凝膠層析柱層析，制成抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY成品。對所制得的抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY，參照常規(guī)“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))進(jìn)行活性檢測。檢測結(jié)果顯示，抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY對阪歧腸桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抗體結(jié)合效價(jià)都達(dá)到1∶1,024以上，對輪狀病毒的抗體結(jié)合效價(jià)則達(dá)到1∶4,096(以上測試樣本的IgY濃度均為1mg/mL)。
實(shí)施例3--用純水提取法制備抗阪歧腸桿菌特異性鴨IgY3.1.向美國病毒中心(ATCC)購買其中一種最有代表性的阪歧腸桿菌，編號為No.BAA-894；3.2.用前敘方法培養(yǎng)；再用蔗糖密度梯度超速離心法或凝膠柱層析法純化，得到提純的最有代表性的阪歧腸桿菌；3.3.將培飬所得的這種最有代表性的阪歧腸桿菌(2×109)與沙門氏菌(2×109)按2∶1比例混合，再加入超聲粉碎機(jī)超聲粉碎；最后把所得菌體混合液以1∶1比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，制成阪歧腸桿菌和沙門氏菌的菌體抗原；3.4.以所制作的阪歧腸桿菌和沙門氏菌的菌體抗原免疫健康的產(chǎn)蛋鴨100只，每只肌內(nèi)注射1mL，每隔二周注射一次，共計(jì)三次；3.5.第一次注射后第20天開始檢取免疫蛋，至第7個(gè)月將所檢得的15,000只免疫蛋用流動(dòng)水沖凈，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋殼，以蛋黃篩濾去蛋清，留取蛋黃加5倍蒸餾水?dāng)噭?，?.0N HCI調(diào)pH至5.5-6.0，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，于10,000rpm離心20分鐘，取上清進(jìn)行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現(xiàn)渾濁；再加入2.0％CaCI2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃過夜10小時(shí)；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌，UltiporVFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥；即制得抗阪歧腸桿菌特異性鴨IgY粗提物1,500g；3.6.將以上IgY粗提物先后過離子交換樹脂柱和凝膠層析柱層析，即制得抗阪歧腸桿菌特異性鴨IgY純品300克。
實(shí)施例4--用干粉混合法制備10,000g抗阪歧腸桿菌特異性IgY嬰兒免疫奶粉4.1.先按普通方法制備營養(yǎng)成份齊全含各種脫脂奶、維生素、氨基酸、雙歧桿菌等的優(yōu)質(zhì)普通嬰幼兒奶粉9,990g，并經(jīng)巴氏消毒；4.2.將按本說明書所敘方法制得的抗阪歧腸桿菌特異性IgY干粉10g；4.3.用等量放大勻化法將所制得的IgY干粉加入已制好的優(yōu)質(zhì)普通嬰幼兒奶粉中，要在干粉混和機(jī)中充分?jǐn)嚢杈鶆颍?.4.在包裝機(jī)上包裝出廠；4.5.生產(chǎn)環(huán)境必須符合無菌條件，并嚴(yán)格在無菌、無塵條件下進(jìn)行。
實(shí)施例5--用液態(tài)混合法制備10,000g抗阪歧腸桿菌特異性IgY嬰兒免疫奶粉5.1.先按普通方法制備營養(yǎng)成份齊全含各種脫脂奶、維生素、氨基酸、雙歧桿菌等的優(yōu)質(zhì)普通嬰幼兒奶水，并經(jīng)巴氏消毒；5.2.將按本說明書所敘方法制得的未經(jīng)冷凍干燥的抗阪歧腸桿菌特異性IgY漿料；5.3.0.1％的比例將所制得的IgY抗阪歧腸桿菌特異性IgY漿料加入已制好的優(yōu)質(zhì)普通嬰幼兒奶水中，置入攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢杈鶆颍?.4.采用60-140℃溫度進(jìn)行噴霧干燥(注意干燥時(shí)間要盡量縮短，以免影響其中IgY的抗體活性)。即制成含抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體的嬰兒免疫安全奶粉；5.5.在包裝機(jī)上包裝出廠；5.6.生產(chǎn)環(huán)境必須符合無菌條件，并嚴(yán)格在無菌、無塵條件下進(jìn)行。
實(shí)施例6--用液態(tài)混合法制備10,000g抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY嬰兒免疫奶粉6.1.先按普通方法制備營養(yǎng)成份齊全含各種脫脂奶、維生素、氨基酸、雙歧桿菌等的優(yōu)質(zhì)普通嬰幼兒奶水，并經(jīng)巴氏消毒；6.2.將按前述方法制得的未經(jīng)冷凍干燥的抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY漿料；6.3.將0.1％的比例將所制得的IgY抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY漿料加入已制好的優(yōu)質(zhì)普通嬰幼兒液體奶中，置入攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢杈鶆颍?.4.采用60-140℃溫度進(jìn)行噴霧干燥(注意干燥時(shí)間要盡量縮短，以免影響其中IgY的抗體活性)。即制成含抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY抗體的嬰兒免疫安全奶粉；6.5.在包裝機(jī)上包裝出廠；6.6.生產(chǎn)環(huán)境必須符合無菌條件，并嚴(yán)格在無菌、無塵條件下進(jìn)行。
將按以上實(shí)施例方法所制得的含抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY抗體的嬰兒免疫安全奶粉給嬰幼兒食用，不但可以抑制阪歧腸桿菌和沙門氏菌等致病菌，杜絕這些致病菌的感染，特別有意義的是，還可預(yù)防和治療嬰幼兒輪狀病毒和大腸桿菌、沙門氏菌引起的腹瀉。
權(quán)利要求
1.一種抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品，其特征在于，所述奶制品中含有抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品，其特征在于，所述奶制品為嬰兒免疫奶或奶粉，其中抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體的含量為0.01-1‰。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品，其特征在于，所述奶制品中的阪歧腸桿菌抗體是抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或抗阪歧腸桿菌和沙門氏菌、抗大腸桿菌和抗嬰幼兒輪狀病毒的特異性復(fù)合IgY抗體。
4.一種抗阪歧腸桿菌免疫奶制品的制備方法，其特征在于，包含以下步驟1)對普通奶制品中檢測到的殘留細(xì)菌以及從受感染人體內(nèi)獲取的病原體進(jìn)行分析，篩選并確定最常見的阪歧腸桿菌作為單一免疫抗原，或?qū)⒑Y選出的阪歧腸桿菌和沙門氏菌、大腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒一起作為復(fù)合免疫抗原；2)培養(yǎng)上述篩選出的阪歧腸桿菌，或同時(shí)培養(yǎng)阪歧腸桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和嬰幼兒輪狀病毒；3)利用上述培養(yǎng)出的阪歧腸桿菌制備單一抗原，或者采用阪歧腸桿菌和沙門氏菌、大腸桿菌以及嬰幼輪狀病毒，制備含阪歧腸桿菌的復(fù)合抗原；4)利用所述阪歧腸桿菌單一抗原或含阪歧腸桿菌的復(fù)合抗原，對產(chǎn)蛋禽類進(jìn)行高免疫注射，并檢取免疫禽類所產(chǎn)的免疫蛋；5)取所述免疫蛋的蛋黃，制備相應(yīng)的抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體粗提物或復(fù)合IgY抗體粗提物；6)對所述抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體粗提物進(jìn)行純化，并進(jìn)行過濾處理以濾除各種細(xì)菌和病毒，得到相應(yīng)的抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體成品；7)取所述抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體成品按事先確定好的比例與液態(tài)奶或奶粉原料混合，制成相應(yīng)的抗阪歧腸桿菌免疫奶制品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中制備單一阪歧腸桿菌抗原的方法為取事先培養(yǎng)好的單一型種阪歧腸桿菌2×109/mL或多型種阪歧腸桿菌按各2×109/mL混合均勻得到阪歧腸桿菌混合液，再按10～1∶1～10的比例加入福氏佐劑，然后置入高速勻漿機(jī)中，以8,000～30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得含阪歧腸桿菌的單一抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中制備單一阪歧腸桿菌抗原的方法為取事先培養(yǎng)好的單一型種阪歧腸桿菌2×109/mL或多型種阪歧腸桿菌按各2×109/mL混合均勻得到阪歧腸桿菌混合液，然后置入超聲粉碎機(jī)中加以超聲粉碎，再將經(jīng)粉碎處理后的菌體混合液按10～1∶1～10比例加入福氏佐劑，即制得含阪歧腸桿菌菌體的單一抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中制備含阪歧腸桿菌的復(fù)合抗原的方法為取事先培養(yǎng)好的阪歧腸桿菌2×109/mL、大腸桿菌2×109/mL和沙門氏菌2×109/mL按1～10∶10～1∶10～1的比例混合，然后置入超聲粉碎機(jī)中進(jìn)行超聲粉碎，再取這三種菌體之混合物與事先培養(yǎng)好并純化的輪狀病毒液按10～1∶1～10的比例混合制得抗原混合液，將該混和液充分混和均勻，然后按10～1∶1～10的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得含阪歧腸桿菌的復(fù)合抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品的制備方法，其特征在于，在所述步驟(5)中制備阪歧腸桿菌特異性IgY抗體粗提物或復(fù)合IgY抗體粗提物的方法為(i)取步驟4)中所得的免疫蛋洗凈并擦洗消毒，用打蛋機(jī)免疫蛋打碎，再用蛋黃篩篩濾除去蛋清，將留下的蛋黃攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4～6倍加入蒸餾水進(jìn)行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5～6.0之間；(ii)將調(diào)整好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2～6℃，靜置12～24小時(shí)；(iii)將稀釋液置入高速離心分離機(jī)中，離心分離20分鐘；(iv)將離心分離所得的上清液再置入超濾器中進(jìn)行超濾并濃縮10～20倍，按0.1～0.3％的比例向濃縮后的漿料中加入海藻酸鈉，充分?jǐn)嚢?；再置入高速離心機(jī)中進(jìn)行離心分離，取上清液，去除脂蛋白；并將離心分離后的漿料置入超濾機(jī)中，經(jīng)過超微膜，進(jìn)行過濾除菌；(v)將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，即制得抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體粗提物或特異性復(fù)合IgY抗體粗提物。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任意一項(xiàng)所述的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品的制備方法，其特征在于，在所述步驟(7)中，取經(jīng)前述步驟所制得抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體干粉或抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY抗體干粉，按實(shí)現(xiàn)確定好的比例添加到奶粉原料中，采取等量放大勻化法用干粉攪拌機(jī)充分混和勻化，即制成含抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體的免疫奶粉。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任意一項(xiàng)所述的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品的制備方法，其特征在于，在所述步驟(7)中，取取經(jīng)前述步驟所制得阪歧腸桿菌特異性IgY抗體液體或復(fù)合IgY抗體液體，按實(shí)現(xiàn)確定好的比例與液態(tài)奶混合，再置入攪拌機(jī)中充分?jǐn)嚢杌旌蛣蚧?，即可制成含阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體的免疫液態(tài)奶；或?qū)⒃撘簯B(tài)奶再經(jīng)冷凍干燥或在60～140℃溫度下進(jìn)行噴霧干燥，制成含抗阪歧腸桿菌特異性IgY抗體或復(fù)合IgY抗體的免疫奶粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品及其制備方法，該奶制品中含有阪歧腸桿菌特異性IgY抗體，其制備方法是，先培養(yǎng)單一阪歧腸桿菌或多種致病菌/病毒，再制備單一或復(fù)合抗原；然后采用所制成的抗原對產(chǎn)蛋禽類進(jìn)行高免疫注射，檢取免疫禽類所產(chǎn)的免疫蛋，制備抗阪歧腸桿菌特異性IgY或抗阪歧腸桿菌特異性復(fù)合IgY；再經(jīng)純化、過濾處理，即得抗阪歧腸桿菌特異性IgY或復(fù)合IgY成品；取該抗阪歧腸桿菌特異性IgY或復(fù)合IgY與適當(dāng)比例的奶粉原料進(jìn)行混合，即可制成抗阪歧腸桿菌的免疫奶制品。本發(fā)明提供的抗阪歧腸桿菌特異性免疫奶制品及其制備方法，有效解決了困擾全球奶業(yè)的嬰兒奶粉受阪歧腸桿菌、沙門氏菌等污染的難題。
文檔編號A61K35/20GK101040632SQ20061006540
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月23日
發(fā)明者包晟, 王長安, 蔡婷英 申請人:雅臣藥業(yè)集團(tuán)(遠(yuǎn)東)有限公司