專利名稱：抗癌劑感受性判定標記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于判定作為對象的患者的癌對于欲使用的抗癌劑是否具有治療反應(yīng)性的抗癌劑感受性判定標記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗癌劑，有烷基化劑、鉬制劑、代謝拮抗劑、抗癌性抗生素、抗癌性植物生物堿等種類。這些抗癌劑中，根據(jù)癌的種類不同，有時顯示效果，有時不顯示效果。但是，已知即使是認為有效的種類的癌，也因各個患者而異有時顯示效果，有時不顯示效果。這種抗癌劑對于各個患者的癌是否顯示效果稱為抗癌劑感受性。鹽酸伊立替康(CPT-Il)是日本開發(fā)的具有I型拓撲異構(gòu)酶(Topoisomerase I)抑制作用機理的抗癌劑。在日本，CPT-11作為對非小細胞肺癌、小細胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌的有效藥劑而在1994年1月得到認可，并在1995年7月認可其適用于胃癌、結(jié)腸-直腸癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌、惡性淋巴瘤。CPT-Il特別是在大腸癌領(lǐng)域作為多劑并用療法的一線藥物(First line drug)或者二線藥物(second line drug)占據(jù)了世界標準治療用藥的位置，其有用性得到認可(非專利文獻1 6)。對晚期-轉(zhuǎn)移大腸癌的化學療法，通過并用二十世紀90年代登場的CPT-11、奧沙利鉬等關(guān)鍵藥物(key drug)和當時作為大腸癌治療的中心藥劑的氟尿嘧啶(5-FU)為中心的氟化嘧啶制劑，能夠戲劇般的改善以生存率為基礎(chǔ)的臨床成績，但是現(xiàn)狀是奏效率大約只有50%左右，冒著很重的副作用這樣的高風險投與抗癌劑的患者，有一半是無效的，確立判別個體的治療反應(yīng)性(反應(yīng)-無反應(yīng))的抗癌劑感受性預(yù)測標記是當務(wù)之急。通常，癌化學療法的治療療程是長期進行的，事實上，只有在觀察副作用的出現(xiàn)而進行了幾個療程的治療之后才能判斷是否取得效果以及是否應(yīng)該繼續(xù)給藥，但是到了這樣的時候，則需要花費長期的時間和高額的醫(yī)藥費，也出現(xiàn)了副作用。因此，如果有對于各個患者在治療前或者治療早期就能夠預(yù)測是否能夠得到效果的方法，就能夠減輕患者的負擔和副作用表現(xiàn)，削減醫(yī)藥費。CPT-Il雖然自身具有抗腫瘤活性，但在體內(nèi)通過羧酸酯酶(Carboxyl esterase)活化，轉(zhuǎn)換為抗腫瘤活性比CPT-Il強大約100 數(shù)千倍的7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin,SN-38)。據(jù)認為 CPT-Il 和 SN-38 同時在體內(nèi)存在，呈現(xiàn)抗腫瘤效果。SN-38在肝細胞內(nèi)通過UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT :UDP-glucuronosyltransferase)接受葡萄糖醛酸化，成為沒有細胞毒性的葡萄糖醛酸化的SN-38 (SN-38G)，主要排泄至膽汁中而向腸道移動，其后，排泄到糞便中。排泄到腸道的一部分SN-38G通過腸內(nèi)細菌所具有的β -葡萄醣醛酸酶脫去葡萄糖醛酸，再次成為活性型SN-38，并經(jīng)由通過腸道上皮的轉(zhuǎn)運蛋白再吸收而進行腸肝循環(huán)、通過腸上皮細胞內(nèi)的UGT進行葡萄糖醛酸化等步驟而被代謝、排泄(非專利文獻7)。此時，認為SN-38損害腸道粘膜，誘發(fā)腹瀉。此外，還會對細胞分裂活躍的骨髓產(chǎn)生影響，引起紅細胞減少、白細胞減少、血小板減少。嚴重的腹瀉、嗜中性粒細胞減少癥等副作用，UGTlAl遺傳多態(tài)性所帶來的SN-38體內(nèi)暴露量的變化顯示為一個原因。但是，涉及治療效果，由于從作為前藥的CPT-Il向活性代謝物SN-38的轉(zhuǎn)換和其解毒、在腸道循環(huán)過程中SN-38的再生成、CPT-Il自身的代謝和從代謝物生成SN-38的所謂體內(nèi)動態(tài)的復(fù)雜性，此外，由于抗腫瘤效果多受腫瘤方面的主要原因所決定，因此，還沒有通過藥物動態(tài)能夠預(yù)測治療效果的報告。還有報告，末梢血單核球細胞的羧酸酯酶mRNA表達量與SN-38和SN-38G的AUC比相關(guān)，但是與腫瘤縮小效果不相關(guān)(非專利文獻8)。作為CPT-Il感受性或耐性相關(guān)的腫瘤方面的因子，報告有作為SN-38的標的的I型拓撲異構(gòu)酶(Topoisomerase I)有無突變及表達量、參與從CPT-11向SN-38轉(zhuǎn)換的羧酸酯酶活性(非專利文獻9)、影響CPT-11、SN-38的細胞內(nèi)蓄積量的轉(zhuǎn)運蛋白(multidrugresistance protein(MRP)_1、MRP-2、Breast cancerresistant protein(BCRP)/ABCG2)的參與，此外，有關(guān)于細胞增殖抗原Ki-67、癌抑制基因p53等與使用CPT-Il治療的反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)的研究。最近，在體外(in vitro)，試著通過組合抗癌劑感受性數(shù)據(jù)和微陣列數(shù)據(jù)來系統(tǒng)地預(yù)測抗癌劑感受性，研究了喜樹堿類的托泊替康(非專利文獻10)。在臨床研究中，最近報告了具有抗細胞凋亡作用的金屬蛋白酶1組織抑制劑(Tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1, TIMP-1)的血漿中水平，與對轉(zhuǎn)移結(jié)腸_直腸癌的CPT-11+5-FU并用療法的臨床預(yù)后的相關(guān)有顯著性(非專利文獻11)。雖然認識到對CPT-Il的感受性預(yù)測生物標記的必要性而做了很多研究，但是也有報告等指出，對于作為標的的I型拓撲異構(gòu)酶(Topoisomerase I)而言，與作為5-FU感受性預(yù)測因子的胸苷酸合酶，均沒有發(fā)現(xiàn)與5-FU+CPT-11并用療法的治療反應(yīng)性之間有明確的關(guān)聯(lián)性(非專利文獻12)，并未確立預(yù)測治療反應(yīng)性的明確的生物標記?，F(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻非專利文獻1 J Clin Oncol 1993 ；11 :909-913非專利文獻2:Semin Oncol 1999 ；26(1 Supp 15) :6_12非專利文獻3 =Lancet 1998 ；352 :1407-1412非專利文獻4 :Pro ASCO 2005 ；Abstract #3506非專利文獻5 :N Engl J Med 2000 ；343 :905-914非專利文獻6 :Lancet 2000 ；355 :1041-1047非專利文獻7 =Cancer Res 1991 ；51 :4187-4191非專利文獻8 =Clin Cancer Res 2005 ；11 :6901-6907非專利文獻 9 =Pharmacogenet Genomics 2007 ；17 :1_10非專利文獻10 :Nat Med 2006 ；12 :1294-1300非專利文獻11 =Clin Cancer Res 2007 ；13 :4117-4122非專利文獻12 :Int J Cancer 2004 ；111 :252-258

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供一種能夠判別各個患者的治療反應(yīng)性的抗癌劑感受性判定標記和利用其的新的癌癥治療方法。
用于解決課題的方法為此，本發(fā)明的發(fā)明人培養(yǎng)人癌細胞株，使用毛細管電泳-飛行時間型質(zhì)量分析儀(CE-TOFMQ對SN-38暴露后的細胞內(nèi)代謝改變進行網(wǎng)羅式分析，進行抗癌劑感受性判定標記的探索，發(fā)現(xiàn)在SN-38低感受性細胞中確認SN-38暴露后細胞內(nèi)水平顯著上升的峰，或在SN-38高感受性細胞中確認SN-38暴露后細胞內(nèi)水平顯著上升的峰，并發(fā)現(xiàn)該峰是在質(zhì)量分析儀中，本體或其片段是作為m/z = 149. 05 149. 06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 152. 99 153. 00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 724. 34 724. 35的陽離子被檢測出的分子、甘油三磷酸、二氫生物蝶呤(Dihydrobiopterin :BH2)、Y -氨基丁酸(GABA)、乳酸、2-甲基丁酰肉毒堿。此外，發(fā)現(xiàn)SN-38高感受性細胞或SN-38低感受性細胞中，在SN-38暴露后，天冬酰胺、天冬氨酸表現(xiàn)出與對照組不同的細胞內(nèi)水平的變動，并發(fā)現(xiàn)通過將SN-38暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以SN-38非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所算出的值是抗癌劑的感受性判定標記。此外，本發(fā)明的發(fā)明人培養(yǎng)8種人癌細胞株，對于這些人癌細胞株的細胞內(nèi)代謝物，使用CE-TOFMS進行抗癌劑感受性判定標記的探索，發(fā)現(xiàn)伴隨著對抗癌劑感受性的降低而細胞內(nèi)水平上升的代謝物，發(fā)現(xiàn)該代謝物是GABAU-甲基腺苷、谷胱甘肽(GSH)所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)?；谏鲜鲆娊膺M一步進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果將來自癌癥患者機體的試樣中的這些代謝物的濃度、上述代謝物濃度的比作為指標，就能夠判定該癌癥患者的癌對于抗癌劑是否有感受性，此外，如果將這些代謝物的濃度、改變、上述代謝物濃度的比作為指標，就能夠進行抗癌劑感受性增強劑的篩選，如果并用該抗癌劑感受性增強劑和作為感受性興奮對象的抗癌劑，就能夠大幅提高該抗癌劑的治療效果，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供一種抗癌劑感受性判定標記，其包含選自在質(zhì)量分析儀中，本體或其片段是作為m/z = 149. 05 149. 06的陰離子被檢測出的分子(以下，稱為代謝物A)、作為m/z = 152. 99 153.00的陰離子被檢測出的分子(以下，稱為代謝物B)、作為m/z =724. 34 724. 35的陽離子被檢測出的分子(以下，稱為代謝物D)、甘油三磷酸、二氫生物蝶呤、GABA、乳酸、天冬酰胺、天冬氨酸、2-甲基丁酰肉毒堿、1-甲基腺苷、谷胱甘肽和這些分子所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)中的一種以上的分子。此外，本發(fā)明提供一種抗癌劑感受性的判定方法，其特征在于，測定檢測體中的上述物質(zhì)。此外，本發(fā)明提供一種用于實施抗癌劑感受性的判定方法的試劑盒，其特征在于，包括用于測定上述物質(zhì)的方案。此外，本發(fā)明提供一種以上述物質(zhì)的表達改變?yōu)橹笜说目拱﹦└惺苄栽鰪妱┑暮Y選方法。此外，本發(fā)明提供一種由上述篩選方法得到的抗癌劑感受性增強劑。此外，本發(fā)明提供一種含有上述抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的組合的癌治療用組合物。此外，本發(fā)明提供用于判定抗癌劑感受性的上述物質(zhì)。發(fā)明的效果使用本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記，就能夠在抗癌劑給藥前或抗癌劑給藥開始后早期適宜判定各個患者的抗癌劑治療反應(yīng)性，結(jié)果，能夠選擇具有更高治療效果的抗癌劑，作為其結(jié)果，能夠防止不能期待治療效果的抗癌劑的繼續(xù)給藥所帶來的癌癥進展、副作用的增大，并且還能夠期待減少患者的負擔，削減醫(yī)療費。此外，使用該標記，就能夠篩選增強抗癌劑感受性的藥劑，如果并用作為其對象的抗癌劑和抗癌劑感受性增強劑，就能夠大幅提高癌治療效果。本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記的測定試劑，作為抗癌劑感受性判定試劑是有用的。


圖1為表示50nmol/L SN-38暴露時，HT-29、HCT_116細胞的平均生存率隨時間變化的圖。圖2為表示HT-29、HCT_116中SN-38暴露后的代謝物A的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖3為表示HT-29、HCT_116中SN-38暴露后的代謝物B的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖4為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的2_甲基丁酰肉毒堿的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖5為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的BH2的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖6為表示HT-29、HCT_116中SN-38暴露后的代謝物D的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖7為表示HT-29、HCT_116中SN-38暴露后的甘油三磷酸的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖8為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的GABA的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖9為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的乳酸的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖10為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的天冬酰胺的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖11為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的天冬氨酸的細胞內(nèi)水平隨時間變化的圖。圖12為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以SN-38非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所計算出的值([天冬酰胺/天冬氨酸]SN_38/[天冬酰胺/天冬氨酸]隨時間變化的圖。圖13為表示穩(wěn)定狀態(tài)中的GABA的細胞內(nèi)水平和各癌細胞株中的SN-38感受性的關(guān)系的圖。圖14為表示對8種人大腸癌細胞株的SN-38感受性的圖。圖15為表示穩(wěn)定狀態(tài)下的1-甲基腺苷、GABA、亞?；撬?、谷胱甘肽、1-甲基煙酰胺的細胞內(nèi)水平與各癌細胞株中的SN-38感受性的關(guān)系的圖。圖16為表示穩(wěn)定狀態(tài)下的谷胱甘肽代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)的細胞內(nèi)水平與各癌細胞株中的SN-38感受性的關(guān)系的圖。
具體實施例方式本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記，是選自代謝物A、B、D、甘油三磷酸、二氫生物蝶呤、GABA、乳酸、天冬酰胺、天冬氨酸、2-甲基丁酰肉毒堿、1-甲基煙酰胺、谷胱甘肽和這些分子所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)的分子(以下，也稱為“代謝系統(tǒng)物質(zhì)”)。其中，作為代謝物A、B、D，是在毛細管電泳-飛行時間型質(zhì)量分析儀(CE-TOFMS)中，本體或其片段是作為m/z = 149. 05 149. 06的陰離子被檢測出的分子、本體或其片段是作為m/z = 152. 99 153. 00的陰離子被檢測出的分子、本體或其片段是作為m/z = 724. 34 724. 35的陽離子被檢測出的分子。此外，包括使得這些分子的濃度改變的代謝系統(tǒng)上的全部的物質(zhì)，作為該物質(zhì)，可以舉出增強代謝為這些分子的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)、促進從這些分子代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記之一，是甘油三磷酸或其所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)(也稱為甘油三磷酸代謝系統(tǒng)物質(zhì))，作為該物質(zhì)，除了甘油三磷酸之外，還包括代謝系統(tǒng)中使得甘油三磷酸的濃度改變的所有的物質(zhì)，可以舉出增強向甘油三磷酸代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)，促進從甘油三磷酸代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。這些中，特別優(yōu)選甘油三磷酸。本發(fā)明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是二氫生物蝶呤(BH2)或其所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)(也稱為BH2代謝系統(tǒng)物質(zhì))，作為該物質(zhì)，除了 BH2,還包括代謝系統(tǒng)中使得BH2的濃度改變的全部的物質(zhì)，可以舉出增強向BH2代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)、促進從BH2代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。這些中，特別優(yōu)選BH2。本發(fā)明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是GABA或其所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)(也稱為GABA代謝系統(tǒng)物質(zhì))，作為該物質(zhì)，除了 GABA，還包括代謝系統(tǒng)中使得GABA濃度改變的全部的物質(zhì)，可以舉出增強向GABA代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)、促進從GABA代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。這些中，特別優(yōu)選GABA。本發(fā)明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是乳酸或其所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)(也稱為乳酸代謝系統(tǒng)物質(zhì))，作為該物質(zhì)，除了乳酸，還包括代謝系統(tǒng)中使得乳酸濃度改變的全部的物質(zhì)，可以舉出增強向乳酸代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)、促進從乳酸代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。這些中，特別優(yōu)選乳酸。本發(fā)明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是天冬酰胺、天冬氨酸或它們所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)。在為天冬酰胺和天冬氨酸的情況下，它們的比很重要，具體而言，可以舉出根據(jù)天冬酰胺和天冬氨酸的濃度算出的天冬酰胺對天冬氨酸的比，更具體而言，抗癌劑暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以抗癌劑非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所算出的值([天冬酰胺/天冬氨酸][天冬酰胺/天冬氨酸]。作為計算該比時所使用的物質(zhì)，除了天冬酰胺、天冬氨酸，能夠使用天冬酰胺、天冬氨酸所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)(也稱為天冬酰胺代謝系統(tǒng)物質(zhì)、天冬氨酸代謝系統(tǒng)物質(zhì))，還包括代謝系統(tǒng)中使得天冬酰胺、天冬氨酸濃度改變的全部的物質(zhì)，可以舉出增強向天冬酰胺、天冬氨酸代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)、促進從天冬酰胺、天冬氨酸代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。這些中，特別優(yōu)選天冬酰胺、天冬氨酸。本發(fā)明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是2-甲基丁酰肉毒堿或其所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)(也稱為2-甲基丁酰肉毒堿代謝系統(tǒng)物質(zhì))，作為該物質(zhì)，除了 2-甲基丁酰肉毒堿，還包括代謝系統(tǒng)中使得2-甲基丁酰肉毒堿濃度改變的全部的物質(zhì)，可以舉出增強向2-甲基丁酰肉毒堿代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)、促進從2-甲基丁酰肉毒堿代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。這些中，特別優(yōu)選2-甲基丁酰肉毒堿。本發(fā)明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是1-甲基腺苷或其所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)(也稱為1-甲基腺苷代謝系統(tǒng)物質(zhì))，作為該物質(zhì)，除了 1-甲基腺苷，還包括代謝系統(tǒng)中使得1-甲基腺苷濃度改變的全部的物質(zhì)，可以舉出增強向1-甲基腺苷的代謝興奮的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)、促進從1-甲基腺苷代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。這些中，特別優(yōu)選1-甲基腺苷。本發(fā)明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是谷胱甘肽或其所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)(也稱為谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì))，作為該物質(zhì)，除了谷胱甘肽，還包括代謝系統(tǒng)中使得谷胱甘肽濃度改變的全部的物質(zhì)，可以舉出增強向谷胱甘肽代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)、促進從谷胱甘肽代謝的物質(zhì)、抑制的物質(zhì)等。這些中，優(yōu)選谷胱甘肽、亞?；撬帷?-甲基煙酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物(GSSG)、S-腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸(Y-Glu-Cys)、精胺，特別優(yōu)選谷胱甘肽、亞?；撬?、1-甲基煙酰胺。代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿，如后述的實施例所示，在SN-38暴露后，在作為SN-38低感受性的HT-29中，觀察到細胞內(nèi)水平顯著上升。另一方面，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，沒有觀察到細胞內(nèi)水平的顯著改變。因此，這些物質(zhì)，特別是作為CPT-11、SN-38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸，如后述的實施例所示，在SN-38暴露后，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，觀察到細胞內(nèi)水平顯著上升。另一方面，在作為SN-38低感受性的HT-四中，沒有觀察到細胞內(nèi)水平的顯著變化。因此，這些物質(zhì)，特別是作為CPT-11、SN-38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。GABA，如后述的實施例所示，在SN-38暴露后，在作為SN-38低感受性的HT-四中，觀察到細胞內(nèi)水平顯著上升。另一方面，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，沒有觀察到細胞內(nèi)水平的顯著改變。此外，作為原先的代謝物水平，在SN-38低感受性的HT-29中，細胞內(nèi)水平高，在SN-38高感受性的HCT-116中，細胞內(nèi)水平低。再者，使用8種人癌細胞株進行研究，隨著對SN-38感受性的降低，細胞內(nèi)GABA水平上升。因此，GABA，特別是作為CPT-IU SN38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。天冬酰胺，如后述的實施例所示，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，在SN-38暴露后表現(xiàn)出與對照組不同的細胞內(nèi)水平的改變，但是，在作為SN-38低感受性的HT-29中，沒有觀察到SN-38暴露組與對照組存在細胞內(nèi)水平的差異。此外，天冬氨酸，如后述的實施例所示，在作為SN-38低感受性的HT-29中，在SN-38暴露后，表現(xiàn)出與對照組不同的細胞內(nèi)水平的改變，但是在作為SN-38高感受性的HCT-116中，沒有觀察到SN-38暴露組與對照組存在細胞內(nèi)水平的差異。SN-38暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以SN-38非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比而算出的值([天冬酰胺/天冬氨酸]SN_38/[天冬酰胺/天冬氨酸] Μ)，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，觀察到其顯著上升，另一方面，在作為SN-38低感受性的HT-四中，觀察到其顯著減少。因此，該天冬酰胺與天冬氨酸濃度的比，特別是作為CPT-11、SN-38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。
1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系類物質(zhì)，如后述的實施例所示，使用8種人癌細胞株進行研究，隨著對SN-38感受性的降低，細胞內(nèi)的這些物質(zhì)的水平上升。因此，1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)，特別是作為CPT-11、SN-38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。作為本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記的對象的抗癌劑，沒有特別限定，例如，可以舉出 CPT-IU SN-38、奧沙利鉬、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(thiot 印 a)、美法倉(melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴餅(procarbazine)、替莫P坐月安(temozolomide)、Jl質(zhì) 白(cisplatin)、卡 白(carboplatin)、奈達 白(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(f luorouracil)、替加氟/尿嘧啶(tegaful/uracil)、脫氧氟尿苷(doxif luridine)、替加氟/吉美拉M / # ii M (tegaful/gimeracil/oteracil) > -f^ J^ ftk (capecitabine) > H H Ifi苷(cytarabine)、依諾他濱(enocitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、6_ 巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、氟達拉濱(fludarabin)、噴司他汀(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、尹圣基月尿(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin) >佐柔比星(daunorubicin)、依達比星(idarubicine)、口比柔比星(pirarubicin)、米托惠酉昆(mitoxantrone)、M1 柔比星(amurubicin)、方文線菌素 D (actinomycin D)、f専來霉素(bleomycine)、派來霉素(ρ印leomycin)、絲裂霉素C(mytomycin C)、阿柔比星(aclarubicin)、凈司他丁 (zinostatin)、長春新堿(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、紫杉酉享(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、托泊替康(nogitecan, topotecan)、依托泊苷(etoposide)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲輕孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、來曲唑(Ietrozole)、利妥昔(rituximab)、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非/B (sorafenib)、達沙替/B (dasatinib)、中白尼單抗(panitumumab) > Π冬酉先胺Bl (asparaginase)、維甲酸(tretinoin)、三氧化二石串(arsenic trioxide)、或它們的鹽、或它們的活性代謝物等。其中，優(yōu)選植物生物堿類抗癌劑，特別優(yōu)選CPT-ll、SN-38或者它們的鹽。在使用本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記判定抗癌劑感受性時，測定檢測體中的這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)即可。在此，作為檢測體，可以列舉來自患有癌的被檢驗者(癌患者)機體的試樣，例如，可以列舉血液、血清、血漿、尿、癌組織-細胞、腹水、胸水、腦脊液、便、痰等，但特別優(yōu)選血清。另外，作為本發(fā)明對象的癌，可以列舉以喉癌為代表的唇、口腔和喉癌、以食道癌、胃癌、結(jié)腸-直腸癌等為代表的消化器官癌、以肺癌為代表的呼吸器官和胸腔內(nèi)臟器官癌、骨及關(guān)節(jié)軟骨癌、皮膚的惡性黑色素瘤、鱗狀細胞癌及其它皮膚癌、以間皮瘤為代表的間皮和軟組織癌、以乳腺癌、子宮癌、卵巢癌為代表的女性性器官癌、以前列腺癌為代表的男性性器官癌、以膀胱癌為代表的尿路癌、以腦腫瘤為代表的眼、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、甲狀腺和其它內(nèi)分泌腺癌，以非何杰金氏淋巴瘤和淋巴細胞性白血病為代表的淋巴組織、造血組織和關(guān)聯(lián)組織癌、以及以這些癌為原發(fā)病灶的轉(zhuǎn)移組織的癌等，但特別是能夠?qū)Ψ切〖毎伟?、小細胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸-直腸癌、鱗狀細胞癌、惡性淋巴瘤適合地利用。檢測體中這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的測定方法，可以根據(jù)被測定對象物來適宜決定，例如,可以通過CE-TOFMS、Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)等各種質(zhì)量分析裝置、HPLC、免疫學測定方法、生化學測定方法等測定。對于代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿而言，在判定作為對象的抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)濃度，如果與抗癌劑給藥前相比，給藥后這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度上升，則能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性，如果在抗癌劑給藥前后這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度沒有變化，則能夠判定該癌具有抗癌劑感受性。此外，在抗癌劑給藥后的初期階段，當這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度高時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效，在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續(xù)給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應(yīng)性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。對于代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸而言，在判定對作為對象的抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)濃度，如果與抗癌劑給藥前相比，給藥后這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度上升，則能夠判定該癌具有抗癌劑感受性，如果在抗癌劑給藥前后這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度沒有變化，則能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性。此外，在抗癌劑給藥后初期階段，當這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度低時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效。在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續(xù)給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應(yīng)性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。對于GABA而言，在判定對作為對象的抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)濃度，如果與抗癌劑給藥前相比，給藥后這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度上升，則能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性，如果在抗癌劑給藥前后這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度沒有變化，則能夠判定該癌具有抗癌劑感受性。此外，在抗癌劑給藥前或給藥后初期階段，當這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度高時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效。在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續(xù)給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應(yīng)性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。對于天冬酰胺、天冬氨酸的濃度之比而言，在判定對作為對象的抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后來自癌癥患者機體的試樣中的天冬酰胺和天冬氨酸的濃度，如果與抗癌劑給藥前相比，給藥后天冬酰胺對天冬氨酸的比上升，則能夠判定該癌具有抗癌劑感受性，如果在抗癌劑給藥前后天冬酰胺對天冬氨酸的比減少，則能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性。此外，在抗癌劑給藥后初期階段，當天冬酰胺對天冬氨酸的比判斷為比規(guī)定的標準低時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效。在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續(xù)給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應(yīng)性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。對于1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)而言，在判定對作為對象的抗癌劑的感受性時，在抗癌劑給藥前階段，當這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度高時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效。在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續(xù)給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應(yīng)性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。在實施本發(fā)明的抗癌劑感受性的判定方法時，優(yōu)選使用含有用于測定檢測體中的這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的方案的試劑盒。該試劑盒中，包含這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的測定試劑、測定試劑的使用方法、以及用于判定抗癌劑感受性有無的基準等。該基準包括這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的標準濃度或標準比、判定為高的濃度或比、判斷為低的濃度或比、對測定結(jié)果產(chǎn)生影響的主要原因和其影響程度等，這些濃度能夠針對每個作為對象的抗癌劑進行設(shè)定。使用該基準，能夠如前所述進行判定。如果以抗癌劑暴露后的代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿、GABAU-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)的表達改變，具體而言，以改變的抑制或濃度的降低為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(in vitro)或體內(nèi)(in vivo)，使得代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿、GABAU-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)的抗癌劑暴露前的濃度降低的物質(zhì)、抑制抗癌劑暴露后的改變或使得濃度降低的物質(zhì)，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(in vitro)，用某種物質(zhì)處理抗癌劑暴露前的各種癌細胞株時，使得細胞內(nèi)的代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABAU-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度降低的物質(zhì)，是增強該抗癌劑感受性的物質(zhì)(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體外(in vitro)，抑制各種癌細胞株中抗癌劑暴露后的細胞內(nèi)的代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABAU-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)的改變的物質(zhì)，是增強該抗癌劑感受性的物質(zhì)(抗癌劑感受性興奮及)。此外，在體內(nèi)(in vivo)，使得荷癌動物中抗癌劑暴露前的代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度降低的物質(zhì)，抑制抗癌劑暴露后的代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABAU-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)的改變或使得濃度降低的物質(zhì)，是增強該抗癌劑感受性的物質(zhì)(抗癌劑感受性增強劑)。此外，如果以抗癌劑暴露后的代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的表達改變，具體而言，以改變的促進或濃度的上升為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(invitro)或體內(nèi)(in vivo)，促進代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸在抗癌劑暴露后的改變或使?jié)舛壬仙奈镔|(zhì)，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(in vitro)，促進各種癌細胞株中的抗癌劑暴露后的細胞內(nèi)的代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的改變的物質(zhì)，是增強該抗癌劑感受性的物質(zhì)(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體內(nèi)(in vivo)，促進荷癌動物中的抗癌劑暴露后的代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的改變或使?jié)舛壬仙奈镔|(zhì)，是增強該抗癌劑感受性的物質(zhì)(抗癌劑感受性增強劑)。此外，如果以抗癌劑暴露后的天冬酰胺對天冬氨酸的比的改變、具體而言，以比的上升為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(in vitro)或體內(nèi)(in vivo),使得抗癌劑暴露后的天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升的物質(zhì)，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(in vitro)，使得各種癌細胞株中抗癌劑暴露后的細胞內(nèi)天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升的物質(zhì)，是增強該抗癌劑感受性的物質(zhì)(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體內(nèi)(invivo)，使得荷癌動物中的抗癌劑暴露后的天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升的物質(zhì)，是增強該抗癌劑感受性的物質(zhì)(抗癌劑感受性增強劑)。其中，作為這些濃度的比，可以使用抗癌劑暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以抗癌劑非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所算出的值，當使用該值時，能夠以敏銳的靈敏度篩選抗癌劑感受性增強劑。此外，如果以代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)為指標，就能夠篩選抗癌劑。即，在體外(in vitro)或體內(nèi)(in vivo)，如果某種物質(zhì)使得這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度改變，則該物質(zhì)為抗癌劑。例如，在體外(in vitro)，如果將某種物質(zhì)暴露于各種癌細胞株后，與暴露前相比，代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度改變，則該物質(zhì)為抗癌劑。此外，如果向荷癌動物投與某種物質(zhì)后，這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度發(fā)生改變，則該物質(zhì)為抗癌劑。如果是能夠期待藥效的抗癌劑，則這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度改變比腫瘤的縮小或殺死細胞效果更早出現(xiàn)，因此，通過以這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)為指標進行篩選，就能夠以更短時間的研究判定該物質(zhì)作為抗癌劑是否是有用的。在削減抗癌劑開發(fā)所需的勞力和費用方面，能夠期待很好的效^ ο此外，如果以代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸為指標，就能夠篩選抗癌劑。S卩，在體外(in vitro)或體內(nèi)(in vivo)，如果某種物質(zhì)使得這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度上升，則該物質(zhì)為抗癌劑。例如，在體外(in vitro)，如果將某種物質(zhì)暴露于各種癌細胞株后，與暴露前相比，代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的濃度上升，則該物質(zhì)為抗癌劑。此外，如果向荷癌動物投與某種物質(zhì)后，這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度上升，則該物質(zhì)為抗癌劑。如果是能夠期待藥效的抗癌劑，則這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)的濃度上升比腫瘤的縮小或殺死細胞效果更早出現(xiàn)，因此，通過以這些代謝系統(tǒng)物質(zhì)為指標進行篩選，就能夠以更短時間的研究判定該物質(zhì)作為抗癌劑是否是有用的。在削減抗癌劑開發(fā)所需的勞力和費用方面，能夠期待很好的效此外，如果以天冬酰胺對天冬氨酸的比為指標，就能夠篩選抗癌劑。即，在體外(invitro)或體內(nèi)(in vivo)，如果某種物質(zhì)使得天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升，則該物質(zhì)為抗癌劑。例如，在體外(invitro)，如果某種物質(zhì)暴露于各種癌細胞株后，與暴露前相比，天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升，則該物質(zhì)為抗癌劑。此外，如果向荷癌動物投與某種物質(zhì)后，天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升，則該物質(zhì)為抗癌劑。如果是能夠期待藥效的抗癌劑，天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比的上升比腫瘤的縮小或殺死細胞效果更早出現(xiàn)，因此，通過以天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比為指標進行篩選，就能夠以更短時間的研究判定該物質(zhì)作為抗癌劑是否是有用的。在削減抗癌劑開發(fā)所需的勞力和費用方面，能夠期待很好的效果。
其中，作為天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比，可以使用抗癌劑暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以抗癌劑非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所算出的值，當使用該值時，能夠以敏銳的靈敏度篩選抗癌劑。如果并用這樣得到的抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑，就能夠大幅提高該抗癌劑的治療效果。作為組合抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的方式，可以是包含這些成分兩者的一種組合物，也可以是各自分別的制劑的組合。此外，也可以將這些成分分別以各自的給藥方式給藥。作為在此使用的作為對象的抗癌劑，與前述同樣，可以舉出CPT-11、SN-38、奧沙利鉬、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(thiot印a)、美法侖(melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴胼(procarbazine)、替莫 P坐月安(temozolomide)、順 白(cisplatin)、卡 白(carboplatin)、奈達鉬(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、替加氟 / 尿嘧啶(tegaful/uracil)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟 / 吉美拉西 / 奧替拉西(tegaful/gimeracil/oteracil)、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、依諾他濱(enocitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、6_巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、氟達拉濱(fludarabin)、噴司他汀(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、尹圣基月尿(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin) >佐柔比星(daunorubicin)、依達比星(idarubicine)、口比柔比星(pirarubicin)、米托惠酉昆(mitoxantrone)、M1 柔比星(amurubicin)、方文線菌素 D (actinomycin D)、f専來霉素(bleomycine)、派來霉素(ρ印leomycin)、絲裂霉素C(mytomycin C)、阿柔比星(aclarubicin)、凈司他丁 (zinostatin)、長春新堿(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、紫杉酉享(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、托泊替康(nogitecan, topotecan)、依托泊苷(etoposide)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲輕孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、來曲唑(Ietrozole)、利妥昔(rituximab)、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非/B (sorafenib)、達沙替/B (dasatinib)、中白尼單抗(panitumumab) > Π冬酉先胺Bl (asparaginase)、維甲酸(tretinoin)、三氧化二石串(arsenic trioxide)、或它們的鹽、或它們的活性代謝物等。其中，優(yōu)選植物生物堿類抗癌劑，特別優(yōu)選CPT-ll、SN-38或者它們的鹽。實施例 接著，舉出實施例，進一步詳細說明本發(fā)明。實施例1(1)方法(a)使用細胞使用2種人大腸癌細胞株(HCT-116、HT-29)，這些細胞從株式會社益力多本社獲得。培養(yǎng)在以下條件下進行，即，OlOOmm/Tissue Culture Dish(IWAKI)，培養(yǎng)基(Doulbecco' s modified Eagle' s Medium, 10% Fetal Bovine Serum), 37°C, 5% C02。(b)藥劑SN-38散裝粉末從株式會社益力多本社獲得。SN-38溶解在DMSO中，以使在各實驗中培養(yǎng)基中的DMSO的濃度稀釋到0. 以下的方式使用。(c)對SN-38的感受性評價對兩株細胞，通過MTS assay (CellTiter96 AQueous One Solution CellProliferation Assay, Promega)評價在 50nmol/L 的 SN-38 暴露 24、48、72 小時后的細胞生存率。在感受性評價中，用不同培養(yǎng)代數(shù)的細胞實施3次，每次進行3個樣品的測定，計算其平均值和標準偏差。(d) SN-38的暴露和細胞內(nèi)代謝物的采取對兩株細胞，通過更換為含有50nmol/L的SN-38的培養(yǎng)基而開始抗癌劑的暴露(使用僅除去SN-38的培養(yǎng)基作為對照組)。在0hr、;3hr、air、Mhr暴露后，在冰上，用5%的甘露醇清洗細胞后，迅速添加甲醇G°C，含有內(nèi)部標準物質(zhì))，使酶失活，保存在-80°C。其中，分別準備用于細胞計數(shù)的細胞和用于提取代謝物的細胞，進行同樣的處理后，進行細胞計數(shù)，用于細胞數(shù)補正。(e)代謝組樣品的制備向-80°C保存的甲醇溶液中加入氯仿和Mili-Q水，進行液-液萃取，除去雜質(zhì)成分。采取包含代謝物的水-甲醇層，使用分子量篩截5000Da的離心超濾膜進行除蛋白，之后，減壓干燥濾液，在_80°C保存。臨測定前在Mili-Q水中溶解，供給代謝組測定。(f)代謝組測定細胞內(nèi)代謝物的網(wǎng)羅式測定由Agilent Technologies公司的毛細管電泳-飛行時間型質(zhì)量分析儀(CE-TOFMQ進行。在陽離子性代謝物的網(wǎng)羅式測定中，以使毛細管的出口為陰極的方式施加電壓，此外，在陰離子性代謝物的網(wǎng)羅式測定中，以使毛細管的出口為陽極的方式施加電壓，一齊定量分析m/z = 50 1000的代謝物。(2)結(jié)果通過MTS assay對50nmol/L的SN-38暴露后隨時間變化的細胞生存率進行研究，各細胞的生存率在Mhr暴露后幾乎沒有差異。但是，隨著暴露時間的延長，各細胞的生存率降低，其差異隨時間而擴大。72hr暴露后的細胞生存率，HT-29為大約85%，HCT-116為大約35%，與HCT-Il相比，HT-29確認為SN-38低感受性(圖1)。通過使用CE-TOFMS進行的網(wǎng)羅式代謝組分析方法，對SN-38暴露所伴有的細胞內(nèi)代謝組改變進行網(wǎng)羅式分析。對兩株細胞，比較SN-38暴露M小時的組和對照組，提取兩組中差異大的峰。對這些峰，將SN-38暴露后隨時間的改變繪成圖表，發(fā)現(xiàn)顯示出特征性改變的以下的代謝物(圖2 7、9 11)。(l)SN-38暴露后，在HT-29中觀察到細胞內(nèi)水平顯著上升的代謝物· m/z =149. 05 149. 06 (陰離子)· m/z = 152. 99 153. 00 (陰離子)· m/z = 246. 16 246. 17 (陽離子)
(2) SN-38暴露后，在HCT-116中觀察到細胞內(nèi)水平顯著上升的代謝物m/z = 171. 00(陰離子)m/z = 240. 10 240. 11 (陽離子)m/z = 724. 34 724.；35(陽離子)m/z = 89. 02 (陰離子)(3)在HCT116中，觀察到SN-38暴露后表現(xiàn)出與對照組不同的細胞內(nèi)水平改變的峰m/z = 133. 06 (陽離子)(4)在HT-四中，觀察到SN-38暴露后表現(xiàn)出與對照組不同的細胞內(nèi)水平改變的峰m/z = 134. 04 (陽離子)關(guān)于m/z = 171.00 的峰，使用分析軟件 Analyst QS(Applied Biosystems,he.)，進行組成的推定。根據(jù)相對于母峰的同位素的比例、精密質(zhì)量等信息推定組成，結(jié)果，作為候補峰的m/z = 171. 00的離子組成為C3H8O6P15使用京都大學制作的KEGG 生命系統(tǒng)信息統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/)的代謝數(shù)據(jù)庫，檢索由該離子組成所推定的物質(zhì)，判定該峰為甘油三磷酸。通過使用甘油三磷酸標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。關(guān)于m/z = 149.05 149.06(陰離子)的峰，使用 Capillaryelectrophoresis-quadrupole time—of—flight mass spectrometry(CE-QT0FMS) iH^T^IL成的推定。其結(jié)果，認為m/z = 149. 05 149. 06的離子組成為C5H9O50此外，關(guān)于m/z = 152. 99 153. 00 (陰離子)的峰，使用CE-QT0FMS進行組成的推定。其結(jié)果，認為m/z = 152. 99 153. 00的離子組成為C3H6O5P0此外，關(guān)于m/z = 246. 16 246. 17 (陽離子)的峰，使用CE-QT0FMS進行組成的推定。其結(jié)果，m/z = 246. 16 246. 17 的離子組成為 C12H24NO40 使用 Human MetabolomeDatabase (http://www.hmdb. ca)檢索由該離子組成所推定的物質(zhì)，判定該峰為2_甲基丁酰肉毒堿。通過使用2-甲基丁酰肉毒堿標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。此外，關(guān)于m/z = 240. 10 240. 11 (陽離子)的峰，使用CE-QT0FMS進行組成的推定。其結(jié)果，m/z = 240. 10 240. 11 的離子組成為 C9H14N5O30 使用 Human MetabolomeDatabase (http://www. hmdb. ca)檢索由該離子組成所推定的物質(zhì)，判定該峰為二氫生物蝶呤。通過使用二氫生物蝶呤標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。關(guān)于m/z= 89. 02 的峰，使用分析軟件Analyst TMQS (Applied biosystems, Inc.)進行組成的推定。根據(jù)相對于母峰的同位素的比例、精密質(zhì)量等信息推定組成，結(jié)果，作為候補峰的m/z = 89. 02的離子組成為C3H503。使用京都大學制作的KEGG 生命系統(tǒng)信息統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/)的代謝數(shù)據(jù)庫，檢索由該離子組成所推定的物質(zhì)，判定該峰為乳酸。通過使用乳酸標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。此外，對于對照組，比較兩株細胞，提取差異大的峰。其中，對于m/z = 104. 070的峰，在SN-38低感受性的HT-四中，其細胞內(nèi)水平高，在SN-38高感受性的HCT-116中，其細胞內(nèi)水平低。此外，將SN-38暴露后隨時間的改變繪成圖表，顯示特征性的改變，由此認為是與SN-38感受性關(guān)聯(lián)的代謝物(圖8)。關(guān)于該峰，使用分析軟件AnalyStTMQS (Applied
16Biosystemsdnc.)進行組成的推定。根據(jù)相對于母峰的同位素的比例、精密質(zhì)量等信息推定組成，結(jié)果，作為候補峰的m/z = 104. 070的離子組成為C4H1(l02。使用京都大學制作的KEGG 生命系統(tǒng)信息統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/)的代謝數(shù)據(jù)庫，檢索由該離子組成所推定的物質(zhì)，判定該峰為Y-氨基丁酸(Y-amin0butyricacid，GABA)。通過使用GABA標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。關(guān)于m/z= 133. 06，使用分析軟件 Analyst TM QS (Applied Biosystems, Inc.)進行組成的推定。根據(jù)相對于母峰的同位素的比例、精密質(zhì)量等信息推定組成，結(jié)果，作為候補峰的m/z = 133. 06的離子組成為C4H9N203。使用京都大學制作的KEGG 生命系統(tǒng)信息統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/)的代謝數(shù)據(jù)庫，檢索由該離子組成所推定的物質(zhì)，判定該峰為天冬酰胺。通過使用天冬酰胺標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。關(guān)于m/z = 134. 04 的峰，使用分析軟件 Analyst TM QS(Applied Biosystems,Inc.)進行組成的推定。根據(jù)相對于母峰的同位素的比例、精密質(zhì)量等信息推定組成，結(jié)果，作為候補峰的m/z = 134. 04的離子組成為C4H8N04。使用京都大學制作的KEGG 生命系統(tǒng)信息統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/)的代謝數(shù)據(jù)庫，檢索由該離子組成所推定的物質(zhì)，判定該峰為天冬氨酸。通過使用天冬氨酸標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。接著，計算天冬酰胺對天冬氨酸的比([天冬酰胺/天冬氨酸])，將SN-38暴露時的[天冬酰胺/天冬氨酸]除以SN-38非暴露時的[天冬酰胺/天冬氨酸]([天冬酰胺/天冬氨酸]SN-38/[天冬酰胺/天冬氨酸] μ)。其結(jié)果，確認SN-38高感受性的HCT-116中，上述值顯著上升。另一方面，確認SN-38低感受性的HT-29中，上述值顯著減少(圖12)。實施例2(1)方法(a)使用細胞使用8 種人大腸癌細胞株(HCT-116、HT-29、HCT-15、Lovo、LS174T、SW480、SW620、WiDr)。HCT-116,HT-29由株式會社益力多本社獲得，Lovo、SW480、WiDr由大日本住友制藥株式會社獲得，HCT-15、LS174T由東北大學加齡醫(yī)學研究所醫(yī)用細胞資源中心獲得，SW620由住商醫(yī)藥株式會社獲得。(b)藥齊IJSN-38散裝粉末從株式會社益力多本社獲得。SN-38溶解在DMSO中，以使在各實驗中培養(yǎng)基中的DMSO的濃度稀釋到0. 以下的方式使用。(c)對SN-38的感受性評價對各株細胞，通過MTS assay (CellTiter96 AQueous One Solution CellProliferation Assay, Promega) if^^ Onmo 1/L 5 μ mol/L 的 SN-38 BM 72 /]、Β Μ的細胞生存率，計算IC5tl值(相對于SN-38未處理的孔細胞數(shù)抑制50 %的濃度)，作為各細胞中的SN-38感受性。實驗進行2次，每次3個樣品。(d)細胞內(nèi)代謝物的采取對于穩(wěn)態(tài)的各細胞，除去培養(yǎng)基，在冰上，用5%的甘露醇清洗細胞后，迅速添加甲醇G°C，含有內(nèi)部標準物質(zhì))，使酶失活，保存在-80°C。其中，分別準備用于細胞計數(shù)的細胞和用于提取代謝物的細胞，進行同樣的處理后，進行細胞計數(shù)，用于細胞數(shù)補正。實驗進行2次，每次3個樣品。(e)代謝組樣品的制備向-80°C保存的甲醇溶液中加入氯仿和Mili-Q水，進行液-液萃取，除去雜質(zhì)成分。采取包含代謝物的水-甲醇層，使用分子量篩截5000Da的離心超濾膜進行除蛋白，之后，減壓干燥濾液，在_80°C保存。臨測定前在Mili-Q水中溶解，供給代謝組測定。(f)代謝組測定細胞內(nèi)代謝物的網(wǎng)羅式測定由Agilent Technologies公司的毛細管電泳-飛行時間型質(zhì)量分析儀(CE-TOFMQ進行。在陽離子性代謝物的網(wǎng)羅式測定中，以使毛細管的出口為陰極的方式施加電壓，此外，在陰離子性代謝物的網(wǎng)羅式測定中，以使毛細管的出口為陽極的方式施加電壓，一齊定量分析m/z = 50 1000的代謝物。(g) GABA與SN-38感受性的相關(guān)分析對于通過CE-TOFMS從各細胞樣品檢測出的表示GABA的峰，對峰面積與各細胞的IC5tl值(50%細胞增殖抑制濃度)的關(guān)系進行相關(guān)分析。(2)結(jié)果(a) 8種人大腸癌細胞株的SN-38感受性評價各細胞中的IC5tl值為0. 74士0. 23 68. 94士6. 83nmol/L，確認其感受性具有大幅度(圖Π)。 (b) GABA與SN-38感受性的相關(guān)分析對于通過CE-TOFMS檢測出的表示GABA的峰，對峰面積與各細胞的IC5tl值的關(guān)系進行相關(guān)分析，確認高的正相關(guān)(圖13)。實施例3(1)方法一次次重復(fù)進行與實施例2同樣的實驗，對分別合計3次的實驗得到的數(shù)據(jù)進行詳細的分析。對于通過CE-TOFMS從各細胞樣品檢測出的峰，與m/z和移動時間已知的278個標品數(shù)據(jù)進行對照，由此識別確認在任一株細胞中檢測的146種代謝物。對該146種代謝物，通過簡單回歸分析研究了 8種人大腸癌細胞中的細胞內(nèi)量與各個的細胞的Log[IC5(1]的關(guān)系。(2)結(jié)果(a) 8種人大腸癌細胞株中的SN-38感受性評價8 種人大腸癌細胞株(HCT-116、HTH HCT-15、Lovo、LS174T、SW480、SW620、WiDr)的感受性以通過MTS assay計算的IC5tl為指標進行評價。其結(jié)果，WiDr的IC5tl(63. 27士 10. 95nM)最高，表現(xiàn)出SN-38低感受性。另一方面，LS174T的IC50(0. 71 士0. 18nM)最低，表現(xiàn)出SN-38高感受性(圖14)。(b)細胞內(nèi)代謝量和SN-38感受性的關(guān)系從8種人大腸癌細胞中提取細胞內(nèi)代謝物，通過CE-TOFMS —齊分析。對于得到的數(shù)據(jù)，與該研究室所有的278種標品數(shù)據(jù)進行對照，確認在任一種細胞中的檢測，對能夠識別的146種代謝物，通過簡單回歸分析研究8種人大腸癌細胞中的細胞內(nèi)量與各個的細胞的Log[IC5(l]的關(guān)系。其結(jié)果，作為細胞內(nèi)量與Log[IC5(l]之間確認有關(guān)聯(lián)的代謝物(ρ< 0. OUR2≥0. 7)，得到1-甲基腺苷、GABA、亞牛磺酸、谷胱甘肽(GSH)、1_甲基煙酰胺(圖 15)。這些代謝物均在SN-38高感受性細胞中的細胞內(nèi)水平低，在SN-38低感受性細胞中的細胞內(nèi)水平高。 而且，確認了亞?；撬帷⒐入赘孰?、1-甲基煙酰胺這樣的谷胱甘肽代謝系統(tǒng)的物質(zhì)的細胞內(nèi)量與SN-38感受性之間相關(guān)，因此，嘗試研究屬于谷胱甘肽代謝系統(tǒng)的其他的物質(zhì)的細胞內(nèi)水平與SN-38感受性的關(guān)系，除了亞?；撬?、谷胱甘肽、1-甲基煙酰胺外，確認了?；撬?R2 = 0. 688)、谷胱甘肽二硫化物(GSSG，R2 = 0. 634), S-腺苷高半胱氨酸(R2 = 0. 496)、煙酰胺(R2 = 0. 357)、γ -谷氨酰半胱氨酸(Y -Glu-Cys, R2 = 0. 319)、精胺(R2 = 0. 295)的細胞內(nèi)代謝物水平與對SN-38感受性之間的關(guān)聯(lián)(圖16)。
權(quán)利要求
1.一種抗癌劑感受性判定標記，其特征在于包含選自在質(zhì)量分析儀中，本體或其片段是作為m/z = 149. 05 149. 06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 152. 99 153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z =724. 34 724. 35的陽離子被檢測出的分子、甘油三磷酸、二氫生物蝶呤、GABA、乳酸、天冬酰胺、天冬氨酸、2-甲基丁酰肉毒堿、1-甲基腺苷、谷胱甘肽和這些分子所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)中的一種以上的分子。
2.如權(quán)利要求1所述的抗癌劑感受性判定標記，其特征在于測定天冬酰胺和天冬氨酸的比。
3.如權(quán)利要求1所述的抗癌劑感受性判定標記，其特征在于谷胱甘肽參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)是選自谷胱甘肽、亞牛磺酸、1-甲基煙酰胺、?；撬帷⒐入赘孰亩蚧?、S-腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、Y -谷氨酰半胱氨酸和精胺中的1種以上的分子。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的抗癌劑感受性判定標記，其特征在于抗癌劑是植物生物堿類抗癌劑。
5.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的抗癌劑感受性判定標記，其特征在于抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。
6.一種抗癌劑感受性的判定方法，其特征在于測定檢測體中的權(quán)利要求1 3中任一項所述的物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的判定方法，其特征在于檢測體是來自患有癌的被檢驗者機體的試樣。
8.如權(quán)利要求6或7所述的判定方法，其特征在于檢測體是來自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗者機體的試樣。
9.如權(quán)利要求6 8中任一項所述的判定方法，其特征在于抗癌劑是植物生物堿類抗癌劑。
10.如權(quán)利要求6 8中任一項所述的判定方法，其特征在于抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。
11.一種試劑盒，用于實施權(quán)利要求6 10中任一項所述的判定方法，其特征在于包含用于測定檢測體中的權(quán)利要求1 3中任一項所述的物質(zhì)的方案。
12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于檢測體是來自患有癌的被檢驗者機體的試樣。
13.如權(quán)利要求11或12所述的試劑盒，其特征在于檢測體是來自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗者機體的試樣。
14.如權(quán)利要求11 13中任一項所述的試劑盒，其特征在于抗癌劑是植物生物堿類抗癌劑。
15.如權(quán)利要求11 13中任一項所述的試劑盒，其特征在于抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。
16.一種抗癌劑感受性增強劑的篩選方法，其特征在于以權(quán)利要求1 3中任一項所述的物質(zhì)的表達改變作為指標。
17.如權(quán)利要求16所述的篩選方法，其特征在于抗癌劑是植物生物堿類抗癌劑。
18.如權(quán)利要求16所述的篩選方法，其特征在于抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。
19.一種由權(quán)利要求16 18中任一項所述的方法得到的抗癌劑感受性增強劑。
20.一種癌治療用組合物，其特征在于含有權(quán)利要求19所述的抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的組I=I O
21.如權(quán)利要求20所述的癌治療用組合物，其特征在于抗癌劑是植物生物堿類抗癌劑。
22.如權(quán)利要求20所述的癌治療用組合物，其特征在于抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠判別各個患者的治療反應(yīng)性的抗癌劑感受性判定標記和利用其的新的癌癥治療方法。一種抗癌劑感受性判定標記，其包含選自在質(zhì)量分析儀中，本體或其片段是作為m/z＝149.05～149.06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z＝152.99～153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z＝724.34～724.35的陽離子被檢測出的分子、甘油三磷酸、二氫生物蝶呤、GABA、乳酸、天冬酰胺、天冬氨酸、2-甲基丁酰肉毒堿、1-甲基腺苷、谷胱甘肽中的一種以上的分子，和/或這些分子所參與的代謝系統(tǒng)上的物質(zhì)。
文檔編號A61P35/02GK102597762SQ201080049509
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者五十嵐義晃, 杉本伸二, 西牟田章戶, 谷川原祐介, 鈴木哲也 申請人:學校法人慶應(yīng)義塾, 株式會社益力多本社