專利名稱：乳液微流化和/或均化期間的組分循環(huán)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過微流化制備疫苗的水包油乳液佐劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
稱作‘MF59’ [1-3]的疫苗佐劑是一種鯊烯、聚山梨酯80 (也稱作吐溫80)和去水山梨糖醇三油酸酯(也稱作司盤85)的亞微米水包油乳液。它也可包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖劑。該乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0. 5%吐溫80和約0. 5%司盤85。參考文獻(xiàn)4的第10章、文獻(xiàn)5的第12章、文獻(xiàn)6的第19章更詳細(xì)地描述了該佐劑 及其制備。如參考文獻(xiàn)7中所述，MF59的商業(yè)規(guī)模的制備是通過將司盤85分散在鯊烯相中且吐溫80分散在水相中，然后高速混合得到粗乳液。然后將這種粗乳液重復(fù)通過微流化機(jī)，產(chǎn)生具有均一油滴尺寸的乳液。如文獻(xiàn)6所述，然后將微流化乳液濾過0. 22 y m膜，以除去任何大油滴，得到乳液的平均液滴尺寸在4°C下保持至少3年不變?？扇缥墨I(xiàn)8所述測定最終乳液中的鯊烯含量。水包油乳液含有油滴。這些乳液中含有的較大油滴可作為聚集的成核位置，引起儲(chǔ)存過程中的乳液降解。本發(fā)明的目的是提供制備微流化水包油乳液(例如MF59)的進(jìn)一步和改良方法，特別是適用于商業(yè)規(guī)模和提供改良的勻化和微流化以產(chǎn)生含較少大顆粒乳液的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)含有鯊烯的水包油乳液的方法，所述方法包括步驟(i)用勻漿器形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中第一乳液是通過使第一乳液組分循環(huán)通過勻漿器多次形成的。本發(fā)明還提供生產(chǎn)含鯊烯的水包油乳液的方法，該方法包括步驟(b)微流化具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中第二乳液是通過循環(huán)第二乳液組分形成的，所述循環(huán)通過將第二乳液組分從第一乳液容器經(jīng)第一微流化裝置轉(zhuǎn)移到第二乳液容器，然后通過第二微流化裝置，其中第一和第二微流化裝置相同。任選地，本發(fā)明方法包括早期步驟(a)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液。任選地，本發(fā)明方法包括步驟(C)過濾所述第二乳液。如下文詳述，第一乳液可具有5000nm或以下的平均油滴尺寸，例如平均尺寸在為300nm-800nm。如下所述，第一乳液中尺寸>1. 2 y m的油滴數(shù)量可為5xlOn/ml或以下。尺寸>1. 2 y m的油滴是不利的，因?yàn)樗鼈兛捎捎谝旱尉奂湍Y(jié)而導(dǎo)致乳液不穩(wěn)定[14]。
形成后，第一乳液可隨后至少通過一次微流化，形成平均油滴尺寸減小的第二乳液。如下所述，第二乳液中的平均油滴尺寸為500nm或以下。如下所述，第二乳液中尺寸>1. 2 的油滴數(shù)量可為SxIOltVml或以下。為了實(shí)現(xiàn)這些特征，必須將乳液組分通過微流化裝置多次，例如2、3、4、5、6、7次。然后第二乳液可濾過例如親水聚醚砜膜，得到可適用作疫苗佐劑的水包油乳液。過濾后產(chǎn)生的水包油乳液的平均油滴尺寸可為220nm或以下，例如135_175nm，145_165nm，或約155nm。過濾后產(chǎn)生的水包油乳液中存在的尺寸>1. 2 y m的油滴數(shù)量可以是5xl08/ml或更少，例如5xl07/ml或更少，5xl06/ml或更少，2xl06/ml或更少，或5xl05/ml或更少。過濾后形成的最終水包油乳液與第一乳液相比尺寸>1. 2 的油滴可少至少IO2倍，理想的是至少少IO3倍(例如少IO4倍)。在一些實(shí)施方式中，在步驟(iii)之間進(jìn)行一輪以上的步驟(i)和(ii)。類似地，可多次重復(fù)獨(dú)立步驟Q)和(ii)。

通常，在20-60° C，理想地在40+5° C進(jìn)行本方法。雖然第一和第二乳液組分可能在較高溫度下也相對(duì)穩(wěn)定，但一些組分的熱分解仍然會(huì)發(fā)生，因此優(yōu)選較低溫度。乳液組分可用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)，如參考文獻(xiàn)13所述測定平均油滴尺寸(即乳液油滴的平均直徑數(shù))。動(dòng)態(tài)光散射測量機(jī)的一個(gè)例子是Nicomp 380亞微米粒度分析儀(來自PSS公司(Particle Sizing Systems))?？捎妙w粒計(jì)數(shù)器，例如Accusizer 770(來自PSS公司)測定尺寸>1. 2 y m的顆粒數(shù)。本發(fā)明的方法用于制備水包油乳液。這些乳液包含三種核心成分油；水性組分；和表面活性劑。由于乳液要用于藥學(xué)應(yīng)用，油通常應(yīng)該是可生物降解的(可代謝的)和生物相容的。油優(yōu)選包含鯊烯，其是一種支鏈不飽和萜類鯊魚肝油(C3tlH5tl; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3) ]2=CHCH2-]2 ;2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯；CAS RN 7683-64-9)。鯊烯特別適用于本發(fā)明。本發(fā)明的油可包括油的混合物(或組合)，例如包含鯊烯和至少一種其他油。替代(或除了)使用鯊烯，乳液可含有來自例如動(dòng)物(如魚)或植物來源的油。植物油的來源包括堅(jiān)果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的示例。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。可從堅(jiān)果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質(zhì)制備甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是種籽油中天然產(chǎn)生。來自哺乳動(dòng)物乳液的脂肪和油可代謝并因而可以使用。獲得動(dòng)物來源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過程為本領(lǐng)域熟知。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和諸如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚油的示例。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。也可采用鯊烯的飽和類似物鯊?fù)?。包括角鯊烯和角鯊?fù)樵趦?nèi)的魚油，易于從商業(yè)來源獲得，或可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。其他有用的油為生育酚，特定是和鯊烯結(jié)合。當(dāng)乳液的油相包含生育酚時(shí)，可采用a、e、Y、S、e或€生育酚中的任何一種，但優(yōu)選a -生育酚?？赏瑫r(shí)采用D-a -生育酚和DL-a-生育酚。優(yōu)選的a-生育酚是DL-a-生育酚。生育酚可取多種形式，例如不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有機(jī)鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等。如果采用這種生育酚的鹽，那么優(yōu)選的鹽是琥珀酸鹽?？墒褂冒徬┖蜕?如DL-a-生育酚)的油組合。所述水性組分可為淡水(如I f. i.)或可包括其他組分如溶質(zhì)。例如，可包含鹽以形成緩沖液，例如檸檬酸或磷酸鹽，例如鈉鹽。常用緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸緩沖劑。包含的緩沖劑一般是 5-20mM。表面活性劑優(yōu)選是可生物降解(可代謝)和生物相容性的。可通過’ HLB’ (親水 /親脂平衡)對(duì)表面活性劑分類，其中1-10范圍內(nèi)的HLB表示表面活性劑比起水更易溶于油，而10-20范圍內(nèi)的HLB表示比起油更易溶于水。乳液優(yōu)選包含至少一種HLB為至少10，例如至少15或優(yōu)選至少16的表面活性劑?？梢耘c本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX 出售的環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈EP/P0嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通(Triton) X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常稱為司盤)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酯。乳液中包含的優(yōu)選表面活性劑是聚山梨酯80 (吐溫80 ;聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。所述乳液中可包括這些表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物或吐溫80/曲通-X100混合物。聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的組合也適用。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可包括HLB值為10-20的表面活性劑(如吐溫80，HLB為15. 0)和HLB值為1_10的表面活性劑(如司盤85，HLB為1.8)。第一乳液的形成微流化步驟前，可混合乳液組分形成第一乳液。第一乳液中油滴的平均尺寸可以是5000nm或以下，例如4000nm或以下，3000nm或以下，2000nm或以下，1200nm或以下，IOOOnm或以下，例如平均尺寸為800_1200nm或300nm-800nmo在第一乳液中，尺寸>1. 2um的油滴數(shù)可以是5xlOn/ml或更少，例如5xl01C)/ml或更少，或5xl09/ml或更少。
然后，微流化第一乳液形成平均油滴尺寸小于第一乳液和/或尺寸>1. 2 y m的油滴更少的第二乳液?？赏ㄟ^將第一乳液組分在勻漿器中混合得到第一乳液的平均油滴尺寸。例如圖I所示，可將其在混合容器(12)中混合，然后將混合組分引入(13)機(jī)械勻漿器，例如轉(zhuǎn)子-定子勻漿器(I)。可以垂直和/或水平方式操作勻漿器。為了方便在商業(yè)配置中使用，優(yōu)選直列式勻漿器。將組分引入轉(zhuǎn)子-定子勻漿器，并接觸含有槽或孔的迅速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子。組分以類似泵的方式向外離心甩出，通過槽/孔。在一些實(shí)施方式中，勻漿器包括多種轉(zhuǎn)子和定子的組合，例如梳齒環(huán)同心排列，如圖I的特征⑶和⑷；(5)和(6)以及(7)和⑶及圖2所示。用于大規(guī)模勻漿器的轉(zhuǎn)子可以在水平方向的多刃葉輪上具有梳齒環(huán)(例如圖I中的特征(9))，彼此精密排列，以配合靜態(tài)襯里中的齒。第一乳液通過轉(zhuǎn)子和定子之間空隙中發(fā)生的湍流、空化和機(jī)械剪切組合形成。以與轉(zhuǎn)子軸平行的方向有用地引入組分。 轉(zhuǎn)子-定子勻漿器中的重要性能參數(shù)是定子的葉尖速度(圓周速度)。該參數(shù)是轉(zhuǎn)速和轉(zhuǎn)子直徑的函數(shù)。至少lOms—1的葉尖速度是有用的，且理想上更快，例如> 20ms-\彡30ms'彡40msH等。可用小型勻衆(zhòng)器在10，OOOrpm輕易實(shí)現(xiàn)4( ^1的葉尖速度，或用較大的勻漿器在較低轉(zhuǎn)速(例如2，OOOrpm)實(shí)現(xiàn)。合適的高剪切勻漿器可市售獲得。對(duì)于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，勻漿器應(yīng)理想地具有至少300升/小時(shí)，例如彡400升/小時(shí)，彡500升/小時(shí)，彡600升/小時(shí)，彡700升/小時(shí)，彡800升/小時(shí)，彡900升/小時(shí)，彡1000升/小時(shí)，彡2000升/小時(shí)，彡5000升/小時(shí)，或甚至彡10000升/小時(shí)的流速。合適的高性能勻漿器可市售獲得。優(yōu)選的勻漿器提供3x105和IxIOV1的剪切速率，例如3xl05-7xl0V\4x105-6x105s 1J 如約 5x105s 1O雖然轉(zhuǎn)子定子勻漿器在操作過程中產(chǎn)熱較少，但在使用中也可冷卻勻漿器。理想的是，第一乳液的溫度在勻漿過程中維持于60°C以下，例如45°C以下。在一些實(shí)施方式中，可對(duì)第一乳液成分勻漿多次(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多次)。為了避免對(duì)一長串容器和勻漿器的需求，也可另外循環(huán)乳液成分(例如圖I中特征(11)所示)。具體說，可將第一乳液組分循環(huán)通過某一勻漿器多次(例如2、
3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100次等)來形成第一乳液。然而，太多次循環(huán)可能不利，因?yàn)榭赡苋鐓⒖嘉墨I(xiàn)14中所述產(chǎn)生重凝結(jié)。因此，如果使用勻漿器循環(huán)，可監(jiān)控油滴尺寸，以檢查是否達(dá)到所需液滴大小和/或不發(fā)生重凝結(jié)。循環(huán)通過勻漿器是有利的，因?yàn)榭梢詼p少第一乳液中的油滴平均尺寸。循環(huán)是有利的，還因?yàn)榭梢詼p少第一乳液中尺寸>1. 2 iim的油滴的數(shù)量。第一乳液中這些平均液滴尺寸和尺寸>1. 2 的液滴數(shù)量的減少可在下游過程中提供益處。具體說，第一乳液組分循環(huán)通過勻漿器可實(shí)現(xiàn)改良微流化過程，隨后引起第二乳液中即微流化后尺寸>1. 2pm的油滴數(shù)量減少。第二乳液參數(shù)的該改進(jìn)可提供改良的濾過性能。改善的濾過性能可使得過濾期間內(nèi)含物損失更少，例如當(dāng)水包油乳液是MF59時(shí)，鯊烯、吐溫80和司盤85的損失更少。本文中的兩種具體類型的循環(huán)稱作“I型”和“II型”。I型循環(huán)如圖5所示，II型循環(huán)如圖6所示。第一乳液組分的循環(huán)可包括在第一預(yù)混容器和勻漿器之間轉(zhuǎn)移第一乳液組分的I型循環(huán)。第一預(yù)混容器的尺寸可以是50-500L，例如100-400L、100-300L、200-300L、250L或280L?？捎貌讳P鋼制造第一預(yù)混容器。I型循環(huán)可持續(xù)10-60分鐘，例如10-40分鐘，或20分鐘。第一乳液組分的循環(huán)可以包含將第一乳液組分從第一預(yù)混容器通過第一勻漿器轉(zhuǎn)移到第二預(yù)混容器(可任選地具有與第一預(yù)混容器相同的性質(zhì))，然后通過第二勻漿器的II型循環(huán)。第二勻漿器通常與第一勻漿器相同，但在一些配置中第一和第二勻漿器不同。第一乳液組分通過第二勻漿器后，第一乳液組分可移回第一預(yù)混容器中，例如如果要重復(fù)II型循環(huán)過程。因此，乳液組分可以圖8的路徑在第一和第二預(yù)混容器之間通過一個(gè)勻漿器移動(dòng)(見圖6)。II型循環(huán)可以進(jìn)行一次或多次，例如2，3，4，5次等。與I型循環(huán)相比，II型循環(huán)是有利的，因?yàn)樗軒椭_保第一乳液中的所有組分 通過勻漿器。傾空第一預(yù)混容器意味著全部乳液內(nèi)含物通過勻漿器進(jìn)入第二預(yù)混容器。類似地，第二預(yù)混容器的內(nèi)容物也可傾空，再次確保其全部通過勻漿器。因此，II型配置可便于確保全部乳液組分至少勻漿兩次，可以減少第一乳液中的油滴平均尺寸和尺寸的油滴數(shù)量。因此理想的II型循環(huán)涉及傾空第一預(yù)混容器，將幾乎全部其內(nèi)含物通過勻漿器進(jìn)入第二預(yù)混容器，然后傾空第二預(yù)混容器，將幾乎全部其內(nèi)含物通過勻漿器重進(jìn)入第一(空)預(yù)混容器。因此全部顆粒通過勻漿器至少兩次，這是I型循環(huán)難于實(shí)現(xiàn)的。在一些實(shí)施方式中使用I型和II型循環(huán)的組合，該組合提供了具有良好特性的第一乳液。特定地，該組合可以減少第一乳液中尺寸的油滴的數(shù)量。該組合可包含任何順序的I型和II型循環(huán)，例如I型而后II型，II型而后I型，I型而后II型而后再I型等。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合包括20分鐘的I型循環(huán)然后是一輪II型循環(huán)，即將經(jīng)循環(huán)的第一乳液組分從第一預(yù)混容器通過第一勻漿器轉(zhuǎn)移到第二預(yù)混容器，然后再通過第二勻漿器一次。第一和第二預(yù)混容器可以置于惰性氣體，例如多至0. 5巴(bar)的氮?dú)庀?。這可以防止乳液成分氧化，如果乳液組分之一是鯊烯則特別有利。這可提高乳液穩(wěn)定性。如上所述，勻漿器中的最初輸入可以是未均質(zhì)化的第一乳液組分的混合物。制備該混合物可通過將各種第一乳液組分單獨(dú)混合，但在一些實(shí)施方式中，在該混合前可合并多種組分。例如，如果乳液包括HLB低于10的表面活性劑，那么該表面活性劑可與油在混合前先合并。類似地，如果乳液包括HLB高于10的表面活性劑，那么該表面活性劑可與水性組分在混合前先合并。緩沖鹽可與水性組分在混合前先合并，或單獨(dú)加入。本發(fā)明的方法可以更大規(guī)模使用。因此，該方法涉及制備第一乳液，其體積大于I升，例如> 5升，> 10升，> 20升，> 50升，> 100升，^ 250升等。第一乳液可在形成后進(jìn)行微流化，或可儲(chǔ)存等待微流化。在一些實(shí)施方式中，特定是使用多重循環(huán)的步驟⑴和(ii)時(shí)，勻漿器的輸入可以是微流化機(jī)的輸出，從而第一乳液進(jìn)行微流化，然后再進(jìn)行勻漿。微流化第一乳液在形成后進(jìn)行微流化，以降低其平均油滴尺寸和/或減少尺寸的油滴數(shù)量。微流化設(shè)備通過幾何學(xué)固定的通道以高壓和高速推動(dòng)輸入流組分來降低油滴平均尺寸。交互作用室入口處的壓力(也稱作“第一壓力”)可以在至少85%，例如至少87%、至少90%、至少95%,至少99%或100%的時(shí)間內(nèi)基本穩(wěn)定(即± 15% ;例如± 10%、±5%、±2%)，期間組分被加入微流化機(jī)器。在一個(gè)實(shí)施方式中，在乳液加入微流化機(jī)的85%的時(shí)間內(nèi)第一壓力為1300巴(bar) ±15%(18kPSI (磅 / 英寸 2) ±15%)，即 I, 100-1500 巴(15_21kPSI)。圖 3 顯示了兩種適合的壓力分布。圖3A中，壓力在至少85%的時(shí)間內(nèi)基本恒定，而在圖3B中壓力一直保持基本恒定。微流化裝置通常包括至少一個(gè)強(qiáng)化泵(優(yōu)選兩個(gè)泵，可同步)和交互作用室。強(qiáng)化泵理想上是電力-液壓驅(qū)動(dòng)的，提供高壓(即第一壓力)以迫使乳液進(jìn)入和通過交互作用室?？捎脧?qiáng)化泵的同步性質(zhì)提供上述乳液基本恒定的壓力，意味著乳液滴在微流化過程中都接觸基本相同水平的剪切力。使用基本恒定壓力的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可減少微流化裝置中的疲勞失效，從而延長裝置壽命。使用基本恒定壓力的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可改善第二乳液的參數(shù)。具體說，可減少存在于 第二乳液中尺寸的油滴數(shù)目。另外，當(dāng)使用相對(duì)恒定的壓力時(shí)，可減少第二乳液的平均油滴尺寸。第二乳液中平均油滴尺寸和尺寸>1. 2 iim的油滴數(shù)目的減少可提高濾過性能。改善的濾過性能可使得過濾期間內(nèi)含物損失更少，例如當(dāng)乳液是MF59時(shí),S烯、吐溫80和司盤85的損失更少。交互作用室可包含多個(gè)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)等通過乳液的固定幾何通道。乳液通過直徑為200-250 iim的輸入管線進(jìn)入交互作用室。在乳液進(jìn)入交互作用室時(shí)，分成液流，在高壓下加速到高速。當(dāng)通過管道時(shí)，高壓產(chǎn)生的力能夠減少乳液的油滴尺寸，并減少尺寸>1. 2 的油滴數(shù)目。這些力可包括剪切力，通過使乳液流接觸管道壁而變形；沖擊力，通過高速乳液流彼此撞擊時(shí)產(chǎn)生的碰撞；和空化力，通過液流內(nèi)空腔的形成和瓦解。交互作用室通常不包括運(yùn)動(dòng)部件。其可包括陶瓷(例如氧化鋁)或鉆石(例如多晶鉆石)管道表面。其它表面可用不銹鋼制成。交互作用室內(nèi)多條管道的固定幾何學(xué)可以是“Y”型幾何或“Z”型幾何。在Y型幾何交互作用室中，一條輸入乳液流分成第一和第二乳液流，然后重新組合成一條輸出乳液流。在重新混合前，第一和第二乳液流可以各自獨(dú)立分成多條第一和第二(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)子流。當(dāng)乳液流重新合并時(shí)，第一和第二乳液流(或其子流)理想地以基本相對(duì)的方向(例如第一和第二乳液流或其子流基本在同一平面(±20° )內(nèi)流動(dòng)，而第一乳液流的流動(dòng)方向與第二乳液流的流動(dòng)方向有180±20°的差異)。當(dāng)乳液流重新合并時(shí)產(chǎn)生的力能夠減少乳液的油滴尺寸，并減少尺寸>1. 2 ii m的油滴數(shù)目。在Z型幾何交互作用室中，乳液流通過多個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)幾乎成直角的角(即90° ±20° )。圖4顯示了具有Z型幾何的交互作用室，其在流動(dòng)方向中有兩個(gè)直角拐角。輸入的乳液流在繞過拐角流動(dòng)時(shí)可以分成多條(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)子流，然后重新合并成一條輸出乳液流(如圖4所示，有4條子液流(32))。分裂然后重新組合(31)可在輸入和輸出之間的任何點(diǎn)發(fā)生。當(dāng)乳液繞過拐角并接觸管道壁時(shí)產(chǎn)生的力能夠減少乳液的油滴尺寸，并減少尺寸的油滴數(shù)目。Z型交互作用室的一個(gè)例子是微流體公司(Microfluidics)的E230Z交互作用室。
在一個(gè)實(shí)施方式中，乳液流繞過至少兩個(gè)基本直角的拐角。在輸入乳液流繞過第一個(gè)基本直角的拐角時(shí)，其分成5條子流。當(dāng)子流繞過第二個(gè)基本直角的拐角時(shí)，其重新組合成一條輸出乳液流。在現(xiàn)有技術(shù)中,通常對(duì)類似本發(fā)明的水包油乳液使用Y-型交互作用室。然而,我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于水包油乳液使用Z型管道幾何交互作用室是有利的，因?yàn)檫@使得第二乳液中存在的尺寸>1. 2 ii m的油滴數(shù)目小于Y型幾何交互作用室。第二乳液中尺寸>1. 2 ii m的油滴數(shù)目減少可提供改善的濾過性能。改善的濾過性能可使得過濾期間內(nèi)含物損失更少，例如當(dāng)乳液是MF59時(shí)，鯊烯、吐溫80和司盤85的損失更少。優(yōu)選的微流化裝置在170-2750巴(大約2500psi-40000psi)，例如約345巴、690巴、1380巴、2070巴等的壓力下操作。優(yōu)選的微流化裝置在多至20升/分鐘，例如多至14升/分鐘，多至7升/分鐘，多至3. 5升/分鐘的流速下操作。 優(yōu)選的微流化裝置具有剪切速率超過IxlOfV1,例如彡2. SxlO6s-1,彡SxlO6s-1,彡IO7s-1等的交互作用室。微流化裝置可包括多個(gè)平行使用的交互作用室,例如包括2、3、4、5或更多個(gè),但有用的是包括一個(gè)交互作用室。微流化裝置可包括含至少一條管道的輔助處理模塊(APM)。APM也有助于通過微流化裝置的乳液中油滴的平均尺寸降低，雖然主要降低是在交互作用室中發(fā)生的。如上所述，乳液組分通過強(qiáng)化泵在第一壓力下引入交互作用室。乳液組分通?？梢缘诙毫﹄x開APM，其比第一壓力低(例如大氣壓)。一般通過交互作用室第一和第二壓力之間的壓力差下降了 80-95%(例如圖4中的P1-P2)，通過輔助處理模塊第一和第二壓力之間的壓力差下降了 5-20%，例如，交互作用室可提供約90%的壓降，而APM可提供約10%的壓降。如果通過交互作用室的壓降和通過輔助處理模塊的壓降不引起整個(gè)第一和第二壓力之間的壓力差，這可能是由于交互作用室和輔助處理模塊之間接頭的有限壓降。APM通常不包括運(yùn)動(dòng)部件。其可包括陶瓷(例如氧化鋁)或鉆石(例如多晶鉆石)管道表面。其它表面可用不銹鋼制成。APM通常位于交互作用室下游，還可與交互作用室依次排列。在現(xiàn)有技術(shù)中，APM通常位于包含Y型管道的交互作用室下游，以抑制空化并將Y型室中的流速提高達(dá)30%。另夕卜，在現(xiàn)有技術(shù)中APM通常位于包含Z型管道的交互作用室上游，以減少大聚集物的尺寸。在后一種情況下，APM僅使Z型室中的流速減少達(dá)3%。然而，已發(fā)現(xiàn)將APM置于包含多條Z型管道的交互作用室下游在本發(fā)明中是有利的，因?yàn)樗軐?dǎo)致第二乳液中平均油滴尺寸和尺寸>1. 2 y m的油滴數(shù)目下降更多。如上所述，第二乳液中尺寸的油滴數(shù)目減少可提供改善的濾過性能。改善的濾過性能可使得過濾期間內(nèi)含物損失更少,例如當(dāng)水包油乳液是MF59時(shí)，鯊烯、吐溫80和司盤85的損失更少。如此放置Z型交互作用室和下游APM的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠在交互作用室后產(chǎn)生較慢的壓力下降。較慢的壓力下降能使得產(chǎn)物穩(wěn)定性提聞，因?yàn)闇p少了包封在乳液中的氣體。APM含有至少一條通過乳液的固定幾何管道。APM可包含多個(gè)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)等通過乳液的固定幾何通道。APM的管道可以是線性或非線性。合適的非線性管道是“Z”型幾何或“Y”型幾何，其與上面就交互作用室所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方式中，APM的一條或多條管道是Z型幾何。當(dāng)乳液進(jìn)入APM時(shí)，多條Z型管道將其分成液流。與生產(chǎn)商的推薦相反，使用含有多條固定幾何管道的APM與含有一條固定幾何管道的APM相比是有利的，因?yàn)槠淠苁沟玫诙橐褐写嬖诘某叽?gt;1. 2 y m的油滴數(shù)目減少更多。如上所述，第二乳液中尺寸>1. 2iim的油滴數(shù)目減少可提供改善的濾過性能。改善的濾過性能可使得過濾期間內(nèi)含物損失更少，例如當(dāng)水包油乳液是MF59時(shí)，鯊烯、吐溫80和司盤85的損失更少。在操作過程中微流化裝置產(chǎn)熱，其可將乳液溫度與第一乳液相比提高15-20°C。因此，有利的是盡可能快地冷卻微流化乳液。第二乳液的溫度可維持在60° C以下，例如45° C下。因此，交互作用室的輸出和/或APM的輸出可加入冷卻機(jī)制，例如熱交換器或冷卻線圈。輸出和冷卻機(jī)制之間的距離可以保持盡可能短，以通過減少冷卻延遲而縮短總時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方式中，微流化機(jī)輸出和冷卻機(jī)制之間的距離為20-30cm。當(dāng)乳液進(jìn)行多次微流化步驟時(shí)，冷卻機(jī)制特別有用，用于防止乳液過熱。微流化的產(chǎn)物是水包油乳液，即第二乳液，其中油滴的平均尺寸為500nm或以下。 該平均尺寸特別有用，因?yàn)樗艽龠M(jìn)乳液過濾除菌。其中至少80%數(shù)量的油滴具有500nm或以下，例如400nm或以下，300nm或以下，200nm或以下或165nm或以下的乳液特別有用。另外，第二乳液中尺寸>1. 2 iim油滴數(shù)目為SxlOicVml或更少，例如5xl09/ml或更少，5xl08/ml或更少，或2xl08/ml或更少。微流化的初始輸入可以是第一乳液。然而在一些實(shí)施方式中，微流化的乳液再次微流化，從而發(fā)生多輪微流化。具體說，可將第二乳液組分循環(huán)通過某一微流化裝置多次，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10次等來形成第二乳液?？蓪⒌诙橐航M分通過微流化裝置循環(huán)4_7次，形成第二乳液。第二乳液組分的循環(huán)可包括將第二乳液組分在第一乳液容器(可任選地具有與第一預(yù)混容器相同的性質(zhì))和微流化裝置之間轉(zhuǎn)移的I型循環(huán)。第二乳液組分的循環(huán)可以包含將第二乳液組分從第一乳液容器通過第一微流化裝置轉(zhuǎn)移到第二乳液容器(可任選地具有與第一預(yù)混容器相同的性質(zhì))，然后通過第二微流化裝置的II型循環(huán)。 第二微流化裝置可與第一微流化裝置相同?；蛘叩诙⒘骰b置也可與第一微流化裝置不同。第一乳液容器可與第一預(yù)混容器相同。或者，第一乳液容器可與第二預(yù)混容器相同。第二乳液容器可與第一預(yù)混容器相同?；蛘?，第二乳液容器可與第二預(yù)混容器相同。第一乳液容器可與第一預(yù)混容器相同，第二乳液容器可與第二預(yù)混容器相同?；蛘?，第一乳液容器可與第二預(yù)混容器相同，第二乳液容器可與第一預(yù)混容器相同。或者，第一和第二乳液容器可以與第一和第二預(yù)混容器不同。第二乳液組分通過第二微流化裝置后，第二乳液組分可移回第一乳液容器中，例如如果要重復(fù)II型循環(huán)過程。II型循環(huán)可以進(jìn)行一次或多次，例如2，3，4，5次等。II型循環(huán)是有利的，因?yàn)樗_保所有第二乳液組分通過微流化裝置至少2次，減少了第二乳液中的平均油滴尺寸和尺寸>1. 2 y m的油滴數(shù)目。
微流化過程中可聯(lián)用I型循環(huán)和II型循環(huán)。該組合可包含任何順序的I型和II型循環(huán)，例如I型而后II型，II型而后I型，I型而后II型而后再I型等。第一和第二乳液容器可以置于惰性氣體，例如多至0. 5巴的氮?dú)庀?。這可以防止乳液成分氧化，如果乳液組分之一是鯊烯則特別有利。這使得乳液穩(wěn)定性提高。本發(fā)明的方法可以更大規(guī)模使用。因此，該方法涉及微流化，其體積大于I升，例如彡5升、彡10升、彡20升、彡50升、彡100升、彡250升等。過濾微流化后，過濾第二乳液。該過濾除去任何可能經(jīng)受勻化和微流化過程的大油滴。雖然數(shù)目很少，這些油滴體積可能較大且可用作聚集的成核位點(diǎn)，導(dǎo)致儲(chǔ)存過程中乳液降解。另外，該過濾步驟可實(shí)現(xiàn)過濾除菌。適用于過濾除菌的顆粒過濾膜視第二乳液的液體特性和所需過濾程度而定。濾器 的特征可影響其過濾微流化乳液的適用性。例如，其孔徑和表面特征是重要的，尤其在過濾基于鯊烯的乳液時(shí)。用于本發(fā)明的膜孔徑應(yīng)允許所需液滴通過，而保留不需要的液滴。例如，其應(yīng)當(dāng)保留尺寸彡I U m的液滴而允許<200nm的液滴通過。0. 2 y m或0. 22 y m的濾器是理想的,而且也能實(shí)現(xiàn)過濾除菌?？蓪⑷橐侯A(yù)先濾過例如0. 45 ii m濾器?？捎靡阎碾p層濾器一步實(shí)現(xiàn)預(yù)過濾和過濾，所述濾器包括具有較大孔的第一膜層和具有較小孔的第二膜層。雙層濾器對(duì)于本發(fā)明特別有用。第一層理想上孔徑>0. 3um,例如0. 3-2 ii m或0. 3-1 y m，或0. 4-0. 8 u m,或0. 5-0. 7iim。優(yōu)選第一層中的孔徑< 0.75 iim。因此，第一層的孔徑為例如0. 6 y m或
0.45 u m。第二層理想上孔徑小于第一層孔徑的75%(理想地小于一半)，例如為第一層孔徑的25-70%或25-49%，如30_45%，例如第一層孔徑的1/3或4/9。因此，第二層的孔徑為〈O. 3um,例如 0. 15-0. 28 ii m 或 0. 18-0. 24 y m，如 0. 2 y m 或 0. 22 y m 孔徑。在一個(gè)實(shí)施例中，具有較大孔的第一膜層提供0. 45 y m濾器，而具有較小孔的第二膜層提供0. 22 y m濾器。濾膜和/或預(yù)過濾膜可以是不對(duì)稱的。不對(duì)稱膜是濾膜一側(cè)與另一側(cè)尺寸不同，例如進(jìn)入面的孔徑大于離開面的孔徑。不對(duì)稱膜的一面可稱為“粗糙多孔表面”，而不對(duì)稱膜的另一面可稱為“精細(xì)多孔表面”。在雙層濾器中，兩層之一或(理想地)兩者可以是不對(duì)稱的。濾膜可以是多孔或均勻的。均勻膜通常是10-200 Pm的致密膜。多孔膜具有多孔結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方式中，濾膜是多孔的。在雙層濾器中，兩層都可以是多孔的，兩層都可以是均勻的，或可以是一層多孔一層均勻。優(yōu)選的雙層濾器是其中一層為多孔的。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二乳液預(yù)先濾過不對(duì)稱的親水多孔膜，然后濾過另一孔徑小于預(yù)過濾膜的不對(duì)稱親水多孔膜。這可用雙層濾器。濾膜可在使用前高壓滅菌，以確保其無菌。濾膜通常用聚合物支撐材料制成，例如PTFE(聚四氟乙烯)、PES(聚醚砜)、PVP(聚乙烯吡咯烷)、PVDF(聚偏二氟乙烯)、尼龍(聚酰胺)、PP(聚丙烯)、纖維素(包括纖維素酯)、PEEK(聚乙醚乙醚酮)、硝基纖維素等。這些具有不同特性，一些載體本身是疏水的(例如PTFE)，其它本身是親水的(例如乙酸纖維素)。然而，可通過處理膜表面來改變這些固有特性。例如，已知通過用其它材料(例如其它聚合物、石墨、硅等)涂覆膜表面處理來制備親水性或疏水性膜，例如見參考文獻(xiàn)15的2. I節(jié)。在雙層濾器中，兩層膜可用不同材料或(理想地)用相同材料制備。用于本發(fā)明的理想濾器具有親水表面，與參考文獻(xiàn)9-12應(yīng)使用疏水(聚砜)濾器的教導(dǎo)相反?？捎糜H水材料，或通過使疏水材料親水化形成具有親水表面的濾器，優(yōu)選用于本發(fā)明的濾器是親水聚醚砜膜。已知多種不同方法將疏水PES膜轉(zhuǎn)化成親水PES膜。這通常是通過在膜上涂覆親水聚合物實(shí)現(xiàn)。為了使得親水聚合物永久結(jié)合于PES，親水涂覆層通常進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)或接枝。參考文獻(xiàn)15公開了一種改變具有可官能化鏈末端的疏水聚合物表面性質(zhì)的方法，包括使聚合物接觸接頭部分溶液，形成共價(jià)連接，然后使反應(yīng)的疏水聚合物與改性劑溶液接觸。文獻(xiàn)16公開了一種通過直接膜涂覆使PES膜親水化的方法，包括預(yù)先用醇濕潤，然后浸入含有親水性單體、多官能單體(交聯(lián)劑)和聚合引發(fā)劑的水溶液中。用熱或UV引發(fā)單體和交聯(lián)劑的聚合，在膜表面形成交聯(lián)親水聚合物涂層。類似地，文獻(xiàn)17和18公開了 PES膜涂覆，將其浸入親水聚合物(聚環(huán)氧烷)和至少一種多官能單體(交聯(lián)齊U)的水溶液中，然后聚合單體以提供不能提取的親水涂層。文獻(xiàn)19描述了通過接枝反應(yīng)來親水化PES膜，其中PES膜經(jīng)歷低溫氦等離子體處理，然后將親水性單體N-乙烯-2-吡 咯烷(NVP)接枝到膜表面。其它的這種方法公開于參考文獻(xiàn)20-26。在不依賴于涂層的方法中，PES可溶于溶劑，與可溶性親水添加劑混合，然后用混合溶液鑄造親水膜，例如通過沉淀或引發(fā)共聚。這種方法公開于參考文獻(xiàn)27-33。例如，文獻(xiàn)33公開了一種制備親水荷電膜的方法，該膜可提取物少，能夠快速回復(fù)超純水抗性，具有交聯(lián)的相互滲透聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，制得混合PES、PVP、聚乙二亞胺和脂族二縮水甘油醚的聚合物溶液，形成溶液薄膜，并沉淀所述薄膜形成膜。類似的方法公開于參考文獻(xiàn)34?？墒褂秒s交方法，其中親水添加劑存在于膜形成過程中并還在隨后作為涂層添力口，例如見參考文獻(xiàn)35。也可通過低溫等離子體處理實(shí)現(xiàn)PES膜的親水化。參考文獻(xiàn)36描述了通過低溫CO2等離子體處理對(duì)PES膜進(jìn)行親水改性。還可通過氧化，如參考文獻(xiàn)37所述實(shí)現(xiàn)PES膜的親水化。該方法涉及用具有低表面張力的液體預(yù)潤濕疏水PES膜，使?jié)馪ES膜接觸氧化劑水溶液，然后加熱。還可使用相轉(zhuǎn)化法，如參考文獻(xiàn)38所述。可通過用PVP (親水性)處理PES (疏水性)獲得理想的親水PES膜。發(fā)現(xiàn)用PEG (親水性)代替PVP處理得到容易積垢的親水PES膜(特別是在用含鯊烯的乳液時(shí))，而且在高壓滅菌時(shí)不利地釋放甲醛。優(yōu)選雙層濾器具有第一親水PES膜和第二親水PES膜。已知的親水膜包括Bioassure (來自坤諾公司(Cuno)) ; EverLUX 聚醚砜；STy LUX 聚醚砜(都來自邁斯納公司(Meissner) ) ;Millex GV, MillexHP,Millipak60, Millipak 200 和 Durapore CVGL01TP3 膜(來自密理博(Millipore) ) ; FluorodyneTMEX EDF 膜，Supor EAV; Supor EBV, Sup or EKV(都來自頗爾公司(Pall)) ; Sartopore (來自賽多利斯(Sartorius)) ; Sterlitech 的親水 PES 膜；和Wolftechnik 的 WFPES PES 膜。過濾期間，乳液可維持在40°C或以下的溫度，例如30°C或以下，以促進(jìn)成功無菌過濾。一些乳液可能在40°C以上的溫度時(shí)不能通過無菌濾器。有利的是在產(chǎn)生第二乳液的24小時(shí)內(nèi)，例如在18小時(shí)內(nèi)，12小時(shí)內(nèi)，6小時(shí)內(nèi)，2小時(shí)內(nèi)，30分鐘內(nèi)進(jìn)行過濾步驟，因?yàn)檫@段時(shí)間以后第二乳液可能無法通過無菌濾膜而不使其堵塞，如參考文獻(xiàn)39中所述。本發(fā)明的方法可以更大規(guī)模使用。因此，該方法涉及過濾，其體積大于I升，例如彡5升，彡10升，彡20升，彡50升，^ 100升，^ 250升等。最終乳液微流化和過濾結(jié)果得到水包油乳液，其中油滴的平均尺寸可為220nm以下，例如155±20nm, 155± IOnm或155±5nm,其中尺寸>1. 2 y m的油滴數(shù)目可以為5xl08/ml或以下，例如5xl07/ml或以下，5xl06/ml或以下，2xl06/ml或以下，或5xl05/ml或以下。

本文所述乳液的平均油滴尺寸(包括第一和第二乳液)通常不小于50nm。本發(fā)明的方法可以更大規(guī)模使用。因此，該方法涉及制備最終乳液，其體積大于I升，例如> 5升，> 10升，> 20升，> 50升，> 100升，^ 250升等。一旦形成水包油乳液，其可轉(zhuǎn)移到無菌玻璃瓶內(nèi)。玻璃瓶的大小可以是5、8、或10升?；蛘撸涂梢赞D(zhuǎn)移到無菌柔性袋(柔性袋)內(nèi)。柔性袋的大小可以是50、100、或250升。另外，柔性袋可接上一個(gè)或多個(gè)無菌接頭，以連接柔性袋與系統(tǒng)。使用裝有無菌接頭的柔性袋與玻璃瓶相比是有利的，因?yàn)槿嵝源炔Ａ扛?，意味著不需要更換柔性袋來儲(chǔ)存一批中制備的全部乳液。這可為乳液制備提供無菌的密閉系統(tǒng)，其減少了存在于最終乳液中的雜質(zhì)幾率。如果最終乳液用于藥學(xué)目的，例如如果最終乳液是MF59佐劑，這就特別重要。最終乳液中油的含量(體積％)優(yōu)選為2-20%，例如約10%。約5%或約10%的鯊烯含量特別有用。30-50mg/ml的鯊烯含量(w/v)是有用的，例如35_45mg/ml，36_42mg/ml, 38-40mg/ml 等。最終乳液中表面活性劑的優(yōu)選量(重量％)為聚氧乙烯山梨醇酯(例如吐溫80) 0. 02-2%,特定是約0. 5%或約1%;去水山梨醇酯(例如司盤85) 0. 02-2%,特定是約0. 5%或約1%;辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100)0. 001-0. 1%,特定是0. 005-0. 02%;聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0. 1-20%,優(yōu)選0. 1-10%，特定是0. 1-1%或約0. 5%。4-6mg/ml的聚山梨醇酯80含量(w/v)有用，例如4. 1-5. 3mg/ml。4_6mg/ml的去水山梨糖醇三油酸酯含量(w/v)有用，例如4. 1-5. 3mg/mlo該方法對(duì)于制備任何下列水包油乳液特別有用 含有鯊烯、聚山梨酯80 (吐溫80)和去水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)的乳液。該乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0. 5%聚山梨酯80和約0. 5%去水山梨糖醇三油酸酯。以重量計(jì)，這些含量變?yōu)?. 3%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%去水山梨糖醇三油酸酯。這種佐劑稱為‘MF59’。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 包含鯊烯、a -生育酚(理想的是DL- a -生育酚)和聚山梨酯80的乳液。這些乳液可含有(重量計(jì))2-10%鯊烯，2-10% a生育酚和0. 3-3%聚山梨酯80，例如4. 3%鯊烯、
4.7% a -生育酚、I. 9%聚山梨酯80。鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選彡I (例如0. 90)，因?yàn)檫@提供了更穩(wěn)定的乳液。鯊烯和聚山梨酯80的體積比可以約為5:2，或者重量比約為11:5。可通過以下方法制備一種這類乳液將聚山梨酯80溶解于PBS產(chǎn)生2%溶液，然后將90ml該溶液與5g DL-a-生育酚和5ml鯊烯的混合物相混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有如尺寸為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。 鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可含有3-0-脫酰化單磷酰脂質(zhì)A( ‘3d-MPL’)。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖液。 含有鯊烯、聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75:11:10(如750 u g/ml聚山梨酯80、110 ii g/ml曲通X-100和100 u g/ml琥珀酸a -生育酚)，且這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。該乳液也可包含3d-MPL。該乳液也可包含皂苷，如QS21。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。 含有鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯
(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如 去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳液優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[40]。該乳液也可含有以下一種或多種物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。也可包含TLR4激動(dòng)劑，如化學(xué)結(jié)構(gòu)不含糖環(huán)的TLR4激動(dòng)劑[41]。這類乳液可凍干。如上以百分?jǐn)?shù)表示的這些乳液的組合物可通過稀釋或濃縮來改變(例如可以改變整數(shù)倍，如2或3倍，或改變部分，例如2/3或3/4)，其中其比例保持不變。例如，2倍濃縮的MF59可包含約10%鯊烯，約1%聚山梨酯80和約1%去水山梨糖醇三油酸酯?？上♂対饪s形式(例如用抗原溶液)，得到所需的乳液終濃度。本發(fā)明的乳液理想地儲(chǔ)存在2° C_8° C。其不應(yīng)冷凍。它們理想地應(yīng)避直射光保存。特別是本發(fā)明含鯊烯的乳液和疫苗應(yīng)當(dāng)受到保護(hù)避免鯊烯的光化學(xué)分解。如果儲(chǔ)存本發(fā)明的乳液，那么優(yōu)選在惰性氣體，例如氮?dú)饣驓鍤庵?。疫苗雖然可能將水包油乳液佐劑本身給予患者(如為單獨(dú)給予患者的抗原提供佐劑效應(yīng))，但更常見的是將佐劑與抗原混合形成免疫原性組合物例如疫苗，然后給予患者。可以在臨用前或者在疫苗生產(chǎn)過程中混合乳液和抗原，然后裝填。本發(fā)明的方法可用于兩種情況。因此，本發(fā)明方法還可包括將乳液與抗原組分混合的工藝步驟。或者，還可包括將佐劑與抗原組分一起包裝到藥盒中作為藥盒組分的步驟。因此，綜上所述，制備混合的疫苗時(shí)或制備包含用前混合的抗原和佐劑的藥盒時(shí)，可使用本發(fā)明。如果在生產(chǎn)過程中混合，那么混合的散裝抗原和乳液的體積一般大于I升，例如彡5升、彡10升、彡20升、彡50升、彡100升、彡250升等。如果在使用時(shí)混合，那么混合的體積一般小于I毫升，例如< 0. 6mK 0. 5mK 0. 4mK 0. 3mK 0. 2ml等。在這兩種情況下，通常混合的乳液和抗原溶液的體積基本相等，即基本上為1:1(例如I. 1:1-1:1. 1，優(yōu)選I. 05:1-1:1. 05，更優(yōu)選I. 025:1-1:1. 025) o然而，在一些實(shí)施方式中，可采用過量的乳液或過量的抗原[42]。當(dāng)一種組分的體積過量時(shí)，過量通常為至少I. 5:1，例如彡2:1、^ 2. 5:1、> 3:1、> 4:1、> 5:1 等?？乖妥魟┳鳛樗幒兄械膯为?dú)組分時(shí)，它們?cè)谒幒兄形锢砩舷嗷シ蛛x，這種分離可通過多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，組分可以裝在不同的容器，如藥瓶中。需要時(shí)，可通過(例如)取出一個(gè)藥瓶的內(nèi)容物并將其加入另一個(gè)藥瓶，或者分別取出兩個(gè)藥瓶的內(nèi)容物并在第三個(gè)容器中將它們混合在一起，來混合兩個(gè)藥瓶的內(nèi)容物。在另一種配置中，藥盒的一種組分在注射器中，另一種組分在容器如藥瓶中?？墒褂迷撟⑸淦?例如裝有針頭的注射器)將其內(nèi)含物注入藥瓶中混合，然后將該混合物抽回注射器中。然后，一般通過新的無菌針頭將該注射器中的混合內(nèi)容物給予患者。將一種組分包裝到注射器中無需用單獨(dú)注射器對(duì)患者給藥。在另一優(yōu)選配置中，這兩種藥盒組分在同一注射器中但分開保存，例如雙室注射器(如參考文獻(xiàn)43-50等所述)。當(dāng)操作注射器時(shí)(例如給予患者時(shí))，將這兩室中的內(nèi)容物混合。這種配置在使用時(shí)無需單獨(dú)的混合步驟。不同藥盒組成的內(nèi)容物通常均為液體形式。在一些配置中，組分(一般是抗原組分而非乳液組分)是干燥形式(例如凍干形式)，而另一組分是液體形式?？蓪⑦@兩種組分混合，以再次激活干燥組分并得到給予患者的液體組合物。凍干組分一般置于藥瓶中，而非注射器中。干燥組分可包含穩(wěn)定劑，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混 合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一種可能的配置使用預(yù)填裝注射器中的液態(tài)乳液組分和藥瓶中的凍干抗原組分。如果疫苗還含有乳液和抗原以外的組分，那么這些其它組分可包含于這兩種藥盒組分之一，或者可以是第三種藥盒組分的一部分。適用于本發(fā)明混合疫苗或單獨(dú)藥盒組分的容器包括藥瓶和一次性注射器。這些容器應(yīng)無菌。組合物/組分裝在藥瓶中時(shí)，藥瓶優(yōu)選由玻璃或塑料材料制成。在將組合物加入藥瓶之前，優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行滅菌。為了避免膠乳過敏患者可能產(chǎn)生的問題，藥瓶優(yōu)選用無膠乳塞子密封，且優(yōu)選所有包裝材料均不含膠乳。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥瓶具有丁基橡皮塞。藥瓶可包含單一劑量的疫苗/組分，或者可以包含一個(gè)以上劑量C多劑量’藥瓶)，如10個(gè)劑量。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥瓶包含10x0. 25ml劑量的乳液。優(yōu)選的藥瓶由無色玻璃制成。藥瓶可以有適合的帽(如魯爾(Luer)鎖)，以便將預(yù)填裝注射器插入該帽，可以將注射器的內(nèi)容物推入藥瓶(如在其中重建凍干物質(zhì))，可以將藥瓶的內(nèi)容物移回注射器中。從藥瓶中移出注射器后，可連上針頭并將該組合物給予患者。該帽優(yōu)選位于封口或蓋子內(nèi)偵牝以便在封口或蓋子打開后才能接觸到該帽。將組合物/組分包裝到注射器中時(shí)，注射器通常不會(huì)連接有針頭，但可提供注射器單獨(dú)的針頭以組裝和使用。優(yōu)選安全性針頭。一般是I-英寸23號(hào)、I-英寸25號(hào)和5/8-英寸25號(hào)針頭?？商峁┯袆冸x標(biāo)簽的注射器，該標(biāo)簽上可打印上內(nèi)含物的批號(hào)、流感季節(jié)和過期日期，以幫助記錄保存。注射器的活塞優(yōu)選帶有防脫裝置，以防止活塞在吸出時(shí)偶然脫出。注射器可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，所述頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，則針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩?？捎镁彌_液稀釋乳液，然后包裝入藥瓶或注射器。常用緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸緩沖劑。稀釋可降低佐劑組分的濃度，而維持其相對(duì)比例，例如提供“半強(qiáng)度”佐齊U。容器可標(biāo)注有半劑量體積，以例如利于遞送給兒童。例如，含有0. 5ml劑量的注射器可標(biāo)有0. 25ml體積的標(biāo)記。采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時(shí)，優(yōu)選采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉鈣玻璃制成的容器。各種抗原均可用于水包油乳液，包括但不限于病毒抗原，如病毒表面蛋白；細(xì)菌抗原，如蛋白質(zhì)和/或糖抗原；真菌抗原；寄生物抗原；和腫瘤抗原。本發(fā)明特別可用于針對(duì)以下的疫苗流感病毒、HIV、鉤蟲、乙肝病毒、單純皰疹病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、衣原體、SARS冠狀病毒、水痘-帶狀皰疫病毒、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、腦膜炎奈瑟氏菌(NeisseriaMeningitidis)、結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、EB病毒、人乳頭瘤病毒等。例如流感病毒抗原.抗原可以采取活病毒或者滅活病毒的形式。采用滅活病毒時(shí)，該疫苗可包含全病毒、裂解病毒顆?；蚣兓谋砻婵乖?包括血凝素，通常也包括神經(jīng)氨酸酶)。流感抗原也可以病毒體形式出現(xiàn)。所述抗原可具有選自下組的任何血凝素亞型H1、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 / 或 H16。疫苗可包括來自一種或多種(例如1、2、3、4或更多種)流感病毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原，例如單價(jià)A/H5N1或A/H1N1疫苗或三價(jià)A/H1N1+A/H3N2+B疫苗。流感病毒可以是重配毒株，并可通過逆向遺傳學(xué)技術(shù)獲得[如51-55]。因此，該病毒可包含來自A/PR/8/34病毒(一般是來自A/PR/8/34的6個(gè)節(jié)段，HA和N節(jié)段來自疫苗毒株，即6:2重配毒株)的一個(gè)或多個(gè)RNA節(jié)段?？梢栽陔u蛋(如含胚雞蛋)或細(xì)胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)用作抗原來源的病毒。使用細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，細(xì)胞底物一般是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如MDCK ；CH0 ；293T ；BHK ；Vero ；MRC-5 ；PER. C6 ;WI_38 ;等。用于培養(yǎng)流感病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系優(yōu)選包括MDCK細(xì)胞[56-59]，衍生自馬達(dá)二氏(Madin Darby)犬腎；Vero細(xì)胞[60-62]，衍生自非洲綠猴腎；或PER. C6細(xì)胞[63]，衍生自人胚視網(wǎng)膜母細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系上培養(yǎng)病毒時(shí)，該組合物宜不含雞蛋蛋白質(zhì)(如卵清蛋白和卵類粘蛋白)和雞DNA，從而降低變應(yīng)原性。通常參照血凝素(HA)含量(通常用SRID測定)標(biāo)準(zhǔn)化疫苗的單位劑量?，F(xiàn)有的疫苗一般含有約15i!gHA/毒株，但也可使用更低的劑量，特別是使用佐劑時(shí)。采用了分?jǐn)?shù)劑量如1/2(即7. 5 u gHA/毒株)、1/4和1/8 [64,65]，以及較高劑量(如3x或9x劑量[66、67])。因此，疫苗可包含 0. 1-150 ii gHA/流感毒株，優(yōu)選 0. l_50ii g，例如 0. 1-20 u g,0. 1-15 u g,0. 1-10 y g、
0.1-7. 5 ii g、0. 5-5 ii g等。具體劑量包括例如，約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約3. 75、約
1.9、約1.51^等/毒株。人免疫缺陷病毒,包括HIV-I和HIV-2。該抗原一般是包膜抗原。乙肝病毒表面抗原。該抗原優(yōu)選通過重組DNA方法獲得，例如在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)后獲得。與天然病毒JffisAg不同，重組酵母表達(dá)的抗原是非糖基化抗原。它可以是基本呈球形的顆粒形式(平均直徑約為20nm)，包括含有磷脂的脂質(zhì)基質(zhì)。不像天然HBsAg顆粒，酵母表達(dá)的顆?？赡馨字＜〈?。HBsAg可來自以下任何亞型aywl> ayw2> ayw3> ayw4> ayr、adw2> adw4> adrq-和 adrq+。鉤蟲,特別是犬中發(fā)現(xiàn)的鉤蟲(犬鉤蟲(Ancylostoma caninum))。這種抗原可以是重組Ac-MTP-1(蝦紅素樣金屬蛋白酶)和/或天冬氨酸血紅蛋白酶(Ac-APR—1)，它可以在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)為分泌蛋白[68,69]。
單純皰疹病毒抗原(HSV).用于本發(fā)明的優(yōu)選HSV抗原是膜糖蛋白gD。優(yōu)選使用HSV-2毒株的gD (，gD2’抗原)。該組合物可使用C-末端膜錨定區(qū)缺失的gD形式[70]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天冬酰胺和谷胺酰胺的截短型gD。這種蛋白質(zhì)形式包括信號(hào)肽，信號(hào)肽被切割后產(chǎn)生成熟的283個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。缺失錨定物可將該蛋白制備成可溶形式。人乳頭瘤病毒抗原(HPV).用于本發(fā)明的優(yōu)選HPV抗原是LI衣殼蛋白，該蛋白可組裝形成稱為病毒樣顆粒(VLP)的結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^在酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))或昆蟲細(xì)胞(例如夜蛾(Spodoptera)細(xì)胞，如草地貪夜蛾(S. frugiperda),或果蠅(Drosophila)細(xì)胞)中重組表達(dá)LI產(chǎn)生VLP。在酵母細(xì)胞中，質(zhì)粒載體可攜帶LI基因；在昆蟲細(xì)胞中，桿狀病毒載體可攜帶LI基因。更優(yōu)選地，該組合物包含來自HPV-16和HPV-18毒株的L1VLP。已證明這種二價(jià)組合非常有效[71]。除了 HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含來自HPV-6和HPV-II毒株的LlVLP。也可能采用致癌性HPV毒株。疫苗可包含 20-60 u g/ml (如約 40 u g/ml)的 LI/HPV 毒株。炭疽抗原。炭疽是由炭疽桿菌(Bacillus anthracis)引起的。合適的炭疽桿菌抗原包含A組分(致死因子(LF)和水腫因子(EF) )，二者共有稱為保護(hù)性抗原(PA)的B組分。任選地，可使抗原脫毒。其它詳情可參見參考文獻(xiàn)[72-74]。金黃色葡萄球菌(S. aureus)抗原已知各種金黃色葡萄球菌抗原。合適的抗原包括莢膜糖(例如5型和/或8型菌株)和蛋白(例如IsdB，Hla,等)。莢膜糖抗原理想地與載體蛋白偶聯(lián)。肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)抗原已知各種肺炎鏈球菌抗原。合適的抗原包括莢膜糖(例如來自血清型1、4、5、68、7 、叭、14、18(、19 、和/或23卩)和蛋白質(zhì)(例如肺炎球菌溶血素、脫毒的肺炎球菌溶血素、聚組氨酸三聚體蛋白D(PhtD)等)。莢膜糖抗原理想地與載體蛋白偶聯(lián)。癌抗原.已知各種腫瘤特異性抗原。本發(fā)明可使用引發(fā)針對(duì)肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌等的免疫治療性應(yīng)答的抗原?？乖芤和ǔＥc乳液，例如以1:1的體積比混合。該混合可以由疫苗生產(chǎn)商在裝填前進(jìn)行，或可在使用時(shí)由健康護(hù)理工作者進(jìn)行。藥物組合物用本發(fā)明方法制備的組合物是藥學(xué)上可接受的。它們可包含除了乳液和可任選抗原以外的組分。所述組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(即小于g/ml)含汞物質(zhì)，如不含硫柳汞[75，76]。更優(yōu)選無汞的疫苗和組分。組合物的pH通常為5. 0-8. I，更常為6. 0-8. 0，例如6. 5-7. 5。因此，本發(fā)明方法可包括在包裝前調(diào)整疫苗pH的步驟。該組合物優(yōu)選無菌。該組合物優(yōu)選無熱原，如每劑量含有<1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量〈O. IEU0該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。該組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即‘多劑量’藥盒)。多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。疫苗的給藥劑量體積一般為約0. 5ml，但可將一半劑量(即約0. 25ml)給予兒童。
治療方法和所述疫苗給予本發(fā)明提供用本發(fā)明方法制備的藥盒和組合物。根據(jù)本發(fā)明方法制備的組合物適合給予人類患者，本發(fā)明提供了在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括將這種組合物給予患者的步驟。本發(fā)明也提供用作藥品的這些藥盒和組合物。本發(fā)明也提供以下應(yīng)用⑴抗原的水性制劑；和(ii)按照本發(fā)明制備的水包油乳液在制備引起患者中免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。這些方法和應(yīng)用引起的免疫應(yīng)答通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答?？梢愿鞣N方式給予該組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[77-79]、口服[80]、皮內(nèi)[81，82]、經(jīng)皮、透 皮[83]等?？捎冒凑毡景l(fā)明制備的疫苗治療兒童和成年人?；颊呖梢孕∮贗歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。患者可以是老年人(如彡50歲，優(yōu)選彡65歲)、青少年(如彡5歲)、住院患者、健康護(hù)理人員、軍隊(duì)服役人員和軍人、懷孕婦女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者和去國外旅行的人。然而所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的群體?？稍谂c其它疫苗基本相同的時(shí)間(例如在向健康護(hù)理專業(yè)人員的同一次醫(yī)療咨詢或就診期間)，將本發(fā)明疫苗給予患者。中間過程本發(fā)明還提供了制備水包油乳液的方法，包括微流化第一乳液形成第二乳液，然后過濾第二乳液。第一乳液具有如上所述的特征。本發(fā)明還提供了制備水包油乳液的方法，包括過濾第二乳液，即微流化乳液。微流化乳液具有如上所述的特征。本發(fā)明還提供了制備疫苗的方法，包括組合乳液和抗原，其中乳液具有上述特征。特定實(shí)施方式本發(fā)明的特定實(shí)施方式包括 一種生產(chǎn)含鯊烯的水包油乳液的方法，包括步驟(i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用親水膜過濾第二乳液。
一種生產(chǎn)水包油乳液疫苗的方法，包括步驟(i)形成具有5000nm或以下的第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用親水膜過濾第二乳液。
一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，包括步驟(i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用親水聚醚砜膜過濾第二乳液。
一種生產(chǎn)含有鯊烯的水包油乳液的方法，所述方法包括步驟(i)用勻漿器形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中第一乳液通過使第一乳液組分循環(huán)通過勻漿器多次而形成。
一種生產(chǎn)含鯊烯的水包油乳液的方法，該方法包括步驟(b)微流化具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中第二乳液通過循環(huán)第二乳液組分形成，所述循環(huán)通過將第二乳液組分從第一乳液容器經(jīng)第一微流化裝置轉(zhuǎn)移到第二乳液容器，然后通過第二微流化裝置，其中第一和第二微流化裝置相同。
一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，包括使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通過微流化裝置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸小于的第二乳液；其中微流化裝置包括含多條Z型管道的交互作用室和含至少一根管道的輔助處理模塊；其中輔助處理模塊位于交互作用室下游。
一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，包含步驟使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通過微流化裝置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；其中微流化裝置包括含多條管道的交互作用室和輔助處理模塊。

一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，包括步驟使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通過微流化裝置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中微流化裝置包括交互作用室，其中交互作用室入口處的乳液組分壓力在乳液加入微流化機(jī)期間至少85%的時(shí)間內(nèi)基本恒定。
一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，包括步驟形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中在惰性氣體，例如氮?dú)?，如在多?. 5巴的壓力下形成第一乳液。
一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，包含步驟使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通過微流化裝置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；其中在惰性氣體，例如氮?dú)?，如在多?. 5巴的壓力下形成第二乳液。
一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，包括步驟(i)成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；(iii)過濾第二乳液；(iv)將水包油乳液轉(zhuǎn)移入無菌柔性袋中。概述術(shù)語“包含”涵蓋“含有”以及“由……組成”，例如“包含” X的組合物可僅由X組成或可含有其它物質(zhì)，例如X+Y。詞語“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。在必要時(shí)，詞語“基本上”可從本發(fā)明的定義中省略。與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語“約”是任選的，其表示(例如)x±10%。除非另有說明，包括混合兩種或多種組分的步驟的過程不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何順序混合。有三種組分時(shí)，可將兩種組分相互合并，然后可將合并物再與第三種組分混合等。將動(dòng)物(且具體是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，其應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，具體是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源?？傊?，優(yōu)選在完全不含動(dòng)物來源材料的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。附圖
簡要說明圖I顯示了能用于形成第一乳液的勻漿器的具體例子。圖2顯示了可用于這種勻漿器的轉(zhuǎn)子和定子的細(xì)節(jié)。圖3顯示了同步強(qiáng)化泵模式的兩種壓力分布。圖4顯示了 Z型管道交互作用室。
圖5顯示了 I型循環(huán)，而圖6顯示了 II型循環(huán)。容器標(biāo)為“C”，勻漿器標(biāo)為“H”。顯示了流體運(yùn)動(dòng)的方向和順序。在圖6中，勻漿器具有兩個(gè)輸入箭頭和兩個(gè)輸出箭頭，但是實(shí)際上勻漿器只有一條輸入管道和一條輸出管道。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :將乳液組分角鯊烯、聚山梨酯80、去水山梨糖醇三油酸酯和檸檬酸鈉緩沖液引入直列式、高速、轉(zhuǎn)子/定子勻漿器(IKA超級(jí)Dispax反應(yīng)器DRS 2000/5)。使用280L和250L的乳液起始體積，勻漿器速度設(shè)置為5000±1000rpm。勻化期間的乳液溫度維持在低于 60° C。進(jìn)行三次檢測運(yùn)行。在第一測試運(yùn)行中，280L的乳液組分進(jìn)入勻漿器和第一預(yù)混容器之間的I型循環(huán)運(yùn)行20分鐘，然后是單一 II型循環(huán)，將來自第一預(yù)混不銹鋼容器的所述第一乳液組分通過勻漿器轉(zhuǎn)移到第二預(yù)混不銹鋼容器中，然后通過勻漿器返回。在第二測試運(yùn)行中，280L的乳液組分進(jìn)入勻漿器和第一預(yù)混不銹鋼容器之間的I型循環(huán)運(yùn)行5分鐘，然后是5次II型循環(huán)，將來自第一預(yù)混不銹鋼容器的所述第一乳液組分通過勻漿器轉(zhuǎn)移到第二預(yù)混不銹鋼容器中，然后通過勻漿器返回所述第一預(yù)混不銹鋼容器。在第三測試運(yùn)行中，250L的乳液組分進(jìn)入勻漿器和第一預(yù)混不銹鋼容器之間的I型循環(huán)運(yùn)行20分鐘，然后是單一 II型循環(huán)，將來自第一預(yù)混不銹鋼容器的所述第一乳液組分通過勻漿器轉(zhuǎn)移到第二預(yù)混不銹鋼容器中，然后通過勻漿器返回所述第一預(yù)混不銹鋼容器。均質(zhì)化所述第一乳液直到其平均油滴尺寸為1200nm或更小，且尺寸>1. 2iim的油滴數(shù)目為5xl09/ml或更少。然后所述第一乳液進(jìn)行微流化以形成第二乳液。所述乳液通過微流化裝置5次。在約600-800巴(即約9000-12000psi)操作所述微流化裝置，且微流化期間使用冷卻機(jī)制將所述乳液維持在40 ± 5 ° C的溫度中。然后無菌過濾所述第二乳液。各測試運(yùn)行中濾出乳液的油滴平均尺寸滿足MF59乳液的規(guī)格。表I示出所述第一、第二和第三測試運(yùn)行中的其他乳液參數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)含有鯊烯的疫苗佐劑水包油乳液的方法，所述方法包括步驟(b)微流化具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，形成具有比所述第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中第二乳液通過循環(huán)所述第二乳液組分而形成，所述循環(huán)通過將所述第二乳液組分從第一乳液容器經(jīng)第一微流化裝置轉(zhuǎn)移到第二乳液容器，然后再次通過相同的微流化裝置。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法在步驟(b)前包括(a)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，所述方法在步驟(b)后包括(c)過濾所述第二乳液。
4.如前述權(quán)利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第一容器中基本所有的乳液組分通過微流化裝置進(jìn)入所述第二容器，然后所述第二容器中基本所有的乳液組分通過微流化裝置返回所述第一容器。
5.一種生產(chǎn)含有鯊烯的水包油乳液疫苗佐劑的方法，所述方法包括步驟(i)用勻漿器形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中所述第一乳液通過下述過程形成通過勻漿器將其組分從第一容器轉(zhuǎn)移到第二容器中，然后通過同一勻漿器將它們從所述第二容器返回所述第一容器。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一容器中基本所有的乳液組分通過所述勻漿器進(jìn)入所述第二容器，然后所述第二容器中基本所有的乳液組分通過所述勻漿器返回所述第一容器。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，所述方法包括(ii)微流化所述第一乳液以形成具有小于所述第一平均油滴尺寸的第二平均油滴尺寸的第二乳液。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述勻漿器提供多至IxlO6s-1的剪切速率，且其中所述微流化在提供>2. SxlOfV1的剪切速率的交互作用室中發(fā)生。
9.如前述權(quán)利要求中任一所述的方法，所述方法包括過濾所述第二乳液。
10.如前述權(quán)利要求中任一所述的方法，其特征在于，步驟(i)包括將所述第一乳液組分從所述第一容器轉(zhuǎn)移到所述第二容器并再返回的兩次或更多的循環(huán)。
11.如權(quán)利要求7-10中任一所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中所述第二乳液通過將所述第二乳液組分多次循環(huán)通過微流化裝置來形成。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述第二乳液組分的循環(huán)包括在第一乳液容器和微流體裝置之間轉(zhuǎn)移第二乳液組分。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述第二乳液組分的循環(huán)包括將第一乳液容器中的第二乳液組分通過第一微流化裝置轉(zhuǎn)移到第二乳液容器中，然后通過第二微流化裝置，其中所述第一和第二微流化裝置相同。
14.如權(quán)利要求10-13中任一所述的方法，其特征在于，所述第二乳液組分通過所述第二微流化裝置后返回所述第一乳液容器，并且權(quán)利要求10或11所述循環(huán)重復(fù)一次或多次。
15.如前述權(quán)利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第一平均油滴尺寸是5000nm或更小。
16.如前述權(quán)利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第一乳液中尺寸>1.2 的油滴數(shù)量為5xlOn/ml或更少。
17.如前述權(quán)利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第二平均油滴尺寸是500nm或更小。
18.如前述權(quán)利要求中任一所述的方法，其特征在于，所述第二乳液中尺寸>1.2的油滴數(shù)量為SxlOicVml或更少。
19.一種制備疫苗組合物的方法，其特征在于，所述方法包括按照權(quán)利要求1-18中任一所述制備乳液，并將所述乳液與抗原混合。
20.一種制備疫苗藥盒的方法，所述藥盒包括按照權(quán)利要求1-18任一所述制備乳液，并將所述乳液作為藥盒組分與抗原組分一起包裝入藥盒。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述藥盒組分在獨(dú)立的藥瓶中。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述藥瓶用硼硅酸鹽玻璃制成。
23.如權(quán)利要求20-22中任一所述的方法，其特征在于，所述佐劑是散裝佐劑，且所述方法包括從所述散裝佐劑提取單位劑量作為藥盒組分包裝。
24.如權(quán)利要求19-23中任一所述的方法，其特征在于，所述抗原是流感病毒抗原。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述乳液與所述抗原的組合形成疫苗組合物且其中所述疫苗組合物包括每流感病毒株約15ii g、約IOii g、約7. g、約g、約3.8 ii g、約 I. 9 ii g 或約 I. 5 ii g 血凝素。
26.如權(quán)利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述乳液和所述抗原組合形成疫苗組合物，且其中所述疫苗組合物包含硫柳汞或2-苯氧基乙醇防腐劑。
全文摘要
生產(chǎn)水包油乳液的改良方法涉及通過勻漿器和/或通過微流化裝置在第一容器和第二容器之間進(jìn)行乳液組分的循環(huán)。有用的是，來自第一容器的所有乳液組分在返回前傾空。
文檔編號(hào)A61K39/39GK102753149SQ201080062766
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者B·桑特里, H·呂克利克, H·舍弗茲克 申請(qǐng)人:諾華有限公司