專利名稱：制備紫杉醇和白蛋白的納米顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備紫杉醇和白蛋白的納米顆粒的方法，能用于獲得抗腫瘤組合物。
背景技術(shù)：
紫杉醇是在文獻(xiàn)中已知的天然物質(zhì)，具有重要的抗腫瘤活性它的弱水溶性使其難于對(duì)人給藥，由于此原因，已開發(fā)了多種能使其可注射的系統(tǒng)。
根據(jù)這些系統(tǒng)中的一個(gè)，紫杉醇與生物相容性且有很強(qiáng)的與紫杉醇結(jié)合能力的人血清白蛋白(HSA)聯(lián)合，并通過已知的超聲波、高壓勻質(zhì)化和微流化技術(shù)形成可注射乳劑(Allemann等，Eur.J.Pharm.Biopharm.39(5)，173-191(1993))。
基于這些要素，并通過使用上述超聲波、高壓勻化技術(shù)，美國VivoRx藥物公司已開發(fā)了含有紫杉醇和HSA的制劑CAPXOL(R)。
在US 5439686、US 5498421、US 5560933和相應(yīng)的WO94/18954中，VivoRx要求保護(hù)用超聲波技術(shù)制備的紫杉醇和HSA的微粒，得到平均粒徑(MPS)＜10微米的顆粒。在這些專利中記載的制備方法不能用于工業(yè)化規(guī)模，并且如此得到的微粒有太高的MPS，這使其不適于和不能用于對(duì)病人給藥。
VivoRx很清楚這一點(diǎn)，因此它在US 5916596和US 6096331及WO 98/14174和WO 99/00113中記載并要求保護(hù)通過用無菌0.9％NaCl水溶液重制紫杉醇和HSA的冷凍干燥粉末而得到的無菌納米乳劑，其MPS＜0.2微米。如引證的專利所述的，這些用高壓勻化方法得到的納米乳劑據(jù)稱有高的穩(wěn)定性，此處術(shù)語“穩(wěn)定性”的意義既表示MPS不隨時(shí)間改變，也表示不出現(xiàn)納米顆粒沉淀(US 6096331，
按前述VivoRx專利的教導(dǎo)(見US 5916596的實(shí)施例1、5和6)，先分別制備紫杉醇的溶液和含有HSA的水溶液，然后將這些相混合在一起，并在室溫(0℃和+44℃之間)將這樣得到的混合物在9000至40000psi之間的高壓下進(jìn)行勻質(zhì)化處理。
蒸發(fā)除去溶劑并通過無菌濾器(0.22微米)過濾后，將混合物在-20℃和-80℃之間冷凍，并最終在+20℃和+35℃之間的溫度下加熱凍干，產(chǎn)生具有抗腫瘤性質(zhì)的能用于制備可注射制劑的粉末。
必須如此制備兩個(gè)分離的相(一個(gè)含有紫杉醇，另一個(gè)含有HSA)，然后在其高壓勻質(zhì)化之前混合在一起。這需要使用至少兩個(gè)分別的反應(yīng)器和用相應(yīng)的混合制備兩個(gè)分別的溶液，所有都要在無菌條件下完成，包括高的設(shè)施成本、完成混合操作的時(shí)間很長，并需要溶劑的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(在勻質(zhì)化處理結(jié)束時(shí))，隨后通過無菌濾器過濾，結(jié)果總產(chǎn)率較低。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的主要目的是提供一種制備紫杉醇和HSA的納米顆粒的無菌冷凍干燥粉末的方法，它需要使用單一反應(yīng)器形成將進(jìn)行勻質(zhì)化處理的含有紫杉醇和HSA的液體混合物，并可以在非常短的時(shí)間內(nèi)，以低于現(xiàn)有技術(shù)的成本完成。
通過下面的方法達(dá)到了這一目的和進(jìn)一步的目的，在該方法中，將溫度為0℃至40℃之間的含有紫杉醇和白蛋白的水性混合物，在9000至40000psi之間的高壓下經(jīng)過勻質(zhì)化處理，產(chǎn)生納米乳劑，它在-20℃和-80℃之間冷凍，并最終在+20℃和+35℃之間的溫度下加熱凍干，其中所述的水性混合物是在無菌條件下通過將所述白蛋白溶解在無菌水中達(dá)到2％-3％(W/V)濃度，然后向此白蛋白溶液中加入2％-4％(V/V)的氯仿，然后加入占溶液中白蛋白重量5.4％-20.0％的無菌粉末狀的紫杉醇而得到的。加入液體混合物中的無菌粉末狀紫杉醇的量?jī)?yōu)選為白蛋白重量的5.6％至19.4％之間。
重要的是注意到在此方法中使用無菌粉末狀的紫杉醇不僅大大簡(jiǎn)化了流程本身，并且此方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，還使在勻化處理前完成各種組分的混合所需的時(shí)間大大縮短，而也能得到更好的最終產(chǎn)率，并簡(jiǎn)化了為得到所需的無菌冷凍干燥粉末所遵循的條件。
通過按前述方式操作，得到了用紫杉醇和HSA的納米顆粒的混合物形成的粉末，它完全類似或等同于用前述在先申請(qǐng)記載的用更復(fù)雜、費(fèi)力和昂貴的方法能得到的粉末。
從這些混合物，當(dāng)使用在US 5916596推薦的壓力范圍內(nèi)的Avestin勻質(zhì)器加工時(shí)，得到pH＝6.7的納米乳劑，當(dāng)它在如所述專利所報(bào)道的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)時(shí)，產(chǎn)生MPS約為0.2微米(在蒸發(fā)后MPS的增加＞0.02微米)的納米乳劑，它在其可注射的生理溶液的制劑中不穩(wěn)定(MPS的增加約為0.05微米，在約12小時(shí)內(nèi)傾向于沉積)，并難于過濾通過0.22微米濾器進(jìn)行滅菌，這些濾器易于阻塞并使紫杉醇的產(chǎn)率降低到非常低的值(降至或低于30％)。
當(dāng)按US 5916596和US 6096331報(bào)道的冷凍干燥并重制后，用如上所述的本發(fā)明的方法和按在先專利的方法制備的產(chǎn)品的穩(wěn)定性(按US 6096331實(shí)施例11的教導(dǎo)評(píng)價(jià))是能接受的，但從未超過24小時(shí)。
已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如果在含有HSA的液體混合物中加入至少一種其量足以使粉末狀納米顆粒的重制可注射水性混合物的pH達(dá)到5.4和5.8之間的生物相容性酸(在向其中加入粉末狀的紫杉醇之前)，可注射形態(tài)的冷凍干燥并重制混合物的穩(wěn)定性大大增加，超過24小時(shí)。
加入上述酸或類似物質(zhì)形成了本發(fā)明的一部分。
優(yōu)選地，所述酸選自鹽酸、檸檬酸、磷酸、醋酸、生物相容性有機(jī)或無機(jī)酸，但檸檬酸是最優(yōu)選的一種。
具體實(shí)施例方式
為闡明本發(fā)明的特征，現(xiàn)在描述它的一些非限定性的實(shí)施例，一些用生理pH的液體混合物，一些用酸酸化以突出使用酸所產(chǎn)生的差異。
實(shí)施例1
制備pH6.7的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的20％(w/v)HSA水溶液(pH-6.9±0.5)稀釋到3％(w/v)。
在高能振蕩下將41.4ml所述溶液與1.25ml無菌氯仿，并與73.6mg(溶液中白蛋白重量的5.9％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合，然后將混合物在高壓勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS約0.2微米)，將其真空蒸發(fā)以除去溶劑，在無菌條件下冷凍并凍干48小時(shí)。
得到的含有4.60％(W/W)紫杉醇的粉末，與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.486微米的MPS，pH＝6.7，穩(wěn)定性＜12小時(shí)。
得到的產(chǎn)品與用US 5916596實(shí)施例1的方法制備的產(chǎn)品有同樣的特性。
實(shí)施例2制備pH6.7的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9±0.5)稀釋到2％(w/v)。
將49.0ml所述溶液與1.0ml無菌氯仿，并與72.5mg(白蛋白重量的7.4％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合，然后將混合物在高壓勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS約0.2微米)，將其真空蒸發(fā)以除去溶劑，通過無菌濾器過濾(0.2微米)，在無菌條件下冷凍并凍干48小時(shí)。
得到的含有0.60％(W/W)紫杉醇的粉末，與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.25微米的MPS，pH-6.7，穩(wěn)定性＜12小時(shí)。
實(shí)施例3制備pH6.7的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的20％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9±0.5)稀釋到3％(w/v)。
將46.7ml所述溶液與1.40ml無菌氯仿，并與108.5mg(白蛋白的7.7％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合，然后將混合物在高壓勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS約0.2微米)，將其真空蒸發(fā)以除去溶劑，通過無菌濾器過濾(0.2微米)，在無菌條件下冷凍并凍干48小時(shí)。
得到的含有0.77％(W/W)紫杉醇的粉末，與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.12微米的MPS，pH＝6.7，穩(wěn)定性＜12小時(shí)。
如已在說明書的開始部分說明的，過濾導(dǎo)致紫杉醇相當(dāng)大的損失(冷凍干燥粉末含有0.55％紫杉醇而非實(shí)施例2的5.2％)。這使將得到的制劑的MPS＜0.2微米。
實(shí)施例4制備pH6.7的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液(pH-6.9±0.5)稀釋到3％(w/v)。
將29.1ml所述溶液與0.90ml無菌氯仿，并與67.0mg(白蛋白的7.7％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合，然后將混合物在高壓勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS約0.2微米)，將其真空蒸發(fā)以除去溶劑，通過無菌濾器過濾(0.2微米)，在無菌條件下冷凍并凍干48小時(shí)。
得到含有0.70％(W/W)紫杉醇的粉末再與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為1.5mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.25微米的MPS，pH-6.7，穩(wěn)定性＜12小時(shí)。
得到的產(chǎn)品與用US 5916596實(shí)施例5的方法制備的產(chǎn)品有同樣的特性。
實(shí)施例5制備pH6.7的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的20％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9+0.5)稀釋到2.5％(w/v)，并用氯仿預(yù)飽和(1％V/V)。
將48.5ml所述溶液與1.0ml無菌氯仿，并與75mg(白蛋白的6.2％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合，然后將混合物在高壓勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS約0.2微米)，將其真空蒸發(fā)以除去溶劑，通過無菌濾器過濾(0.2微米)，在無菌條件下冷凍并凍干48小時(shí)。
得到含有0.70％(W/W)紫杉醇的粉末，再與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2.2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.18微米的MPS，pH＝6.7，穩(wěn)定性＜12小時(shí)。
在實(shí)施例3結(jié)束時(shí)進(jìn)行的觀察在此情況下也得到驗(yàn)證。
實(shí)施例6制備pH＝5.6的制劑以無菌軟化水將FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9±0.5)稀釋到3％(w/v)，用1 MHCl將pH調(diào)節(jié)到5.6，HCl與白蛋白中的一些堿性基團(tuán)成鹽。
將57ml預(yù)先滅菌的所述溶液在強(qiáng)力攪拌下與1.40ml無菌氯仿，并與108mg(白蛋白重量的6.3％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合至少30分鐘。
將混合物在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?在高壓(9000-40000psi)下處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，在無菌條件下將其快速冷凍到-80℃并凍干55小時(shí)，同時(shí)升溫至+30℃。
將得到含有4.83％(W/W)紫杉醇和4％(w/w)水的粉末，與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.175微米的MPS，pH＝5.6，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。用磷酸代替鹽酸得到相同的結(jié)果。
實(shí)施例7制備pH＝5.4的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液稀釋到3％(W/v)，用檸檬酸將pH調(diào)節(jié)到5.4，檸檬酸與白蛋白中的一些堿性基團(tuán)成鹽。
將50ml預(yù)先滅菌的所述溶液在強(qiáng)力攪拌下與1.23ml無菌氯仿，并與98mg(白蛋白的6.5％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合至少40分鐘。
將混合物在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?在高壓(9000-40000psi)下處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，在無菌條件下將其快速冷凍到-30℃并凍干57小時(shí)，同時(shí)升溫至+35℃。
將得到的含有4.80％(W/W)紫杉醇和3.8％(w/w)水的粉末，與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.19微米的MPS，pH＝5.4，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
用醋酸代替檸檬酸得到相同的結(jié)果。
實(shí)施例8制備pH＝5.5的制劑以無菌軟化水將FDA規(guī)范的可注射的25％(w/v)HSA水溶液稀釋到3％(w/v)，用無菌檸檬酸將pH調(diào)節(jié)到5.5，檸檬酸與白蛋白中的一些堿性基團(tuán)成鹽。
將37ml所述溶液在強(qiáng)力攪拌下與0.91ml無菌氯仿，并與71mg(白蛋白的6.4％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合至少40分鐘，然后將混合物冷卻到5-8℃。
將混合物在勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?在高壓(9000-40000psi)下處理直至得到納米乳劑(MPS＜0.2微米)，在無菌條件下將其快速冷凍到-80℃并凍干58小時(shí)，同時(shí)升溫至+30℃。
將得到的含有4.70％(W/W)紫杉醇和4.5％(w/w)水的粉末，與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.185微米的MPS，pH＝5.5，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
實(shí)施例9制備pH＝5.5的制劑以無菌軟化水將符合FDA規(guī)范的可注射的20％(w/v)HSA水溶液(pH＝6.9±0.5)稀釋到3％(w/v)，用檸檬酸將pH調(diào)節(jié)到5.5，檸檬酸與白蛋白中的一些堿性基團(tuán)成鹽。
將110ml所述溶液與4.10ml無菌氯仿，并與639mg(白蛋白的19.4％)粉末狀無菌紫杉醇(效價(jià)＞99％)混合，然后將混合物在高壓勻化器內(nèi)(適當(dāng)?shù)販缇?處理直至得到納米乳劑(MPS約0.2微米)，將其通過無菌濾器過濾(0.2微米)，真空蒸發(fā)以除去溶劑，在無菌條件下冷凍并凍干48小時(shí)。
將得到的含有10.8％(W/W)紫杉醇的粉末，與0.9％NaCl水溶液重制形成紫杉醇濃度為2mg/ml的溶液。得到的制劑具有0.15微米的MPS，穩(wěn)定性＞24小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種制備由紫杉醇和人血清白蛋白的納米顆粒構(gòu)成的無菌冷凍干燥粉末的方法，通過此方法，將含有紫杉醇和白蛋白的水性混合物在0℃-40℃之間的溫度，9000和40000psi之間的高壓下經(jīng)過均質(zhì)化處理，得到納米乳劑，它在-20℃和-80℃之間的溫度下冷凍，最后經(jīng)過加熱到+20℃至35℃之間而凍干，此方法的特征在于所述水性混合物是這樣獲得的在無菌條件下，通過將2％至3％(W/V)所述白蛋白溶解在無菌水中，然后向此白蛋白溶液中加入2％至4％(V/V)的無菌氯仿，再加入占溶液中白蛋白重量5.4％至20.0％的無菌粉末狀的紫杉醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于加入所述白蛋白溶液中的無菌粉末狀的紫杉醇的量在白蛋白重量的5.6％至19.4％之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于在加入紫杉醇之前，向所述白蛋白溶液中加入至少一種生物相容性酸，其量足以使粉末狀納米顆粒重制形成的水性可注射混合物的pH達(dá)到5.4-5.8之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述酸的量是使所述重制形成的水溶液的pH達(dá)到5.5和5.7之間的量。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的方法，其特征在于所述的酸選自鹽酸、檸檬酸、磷酸、醋酸、生物相容性有機(jī)酸和無機(jī)酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的酸是檸檬酸。
全文摘要
一種制備有抗腫瘤性質(zhì)的紫杉醇和白蛋白的納米顆粒的方法，用此方法，將通過向白蛋白與氯仿的水溶液中加入粉末狀紫杉醇得到的混合物進(jìn)行高壓均質(zhì)處理。
文檔編號(hào)C07D305/14GK1448128SQ0310836
公開日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者M·澤諾尼, S·瑪施奧 申請(qǐng)人:艾斯·多伯法股份公司