專利名稱：一種硫酸軟骨素納米硒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥納米材料技術領域，涉及一種硫酸軟骨素納米硒及其制備方法。
背景技術：
硫酸軟骨素是糖胺聚糖的一種，由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β -1， 4-糖苷鍵連接而成的重復二糖單位組成的多糖，并在N-乙酰氨基半乳糖的C-4位或C-6位 羥基上發(fā)生硫酸酯化。硫酸軟骨素能促進基質(zhì)中纖維的增長，增強通透性，改善血液循環(huán)， 加速新陳代謝，促進滲透液的吸收及炎癥的消除，在心血管疾病、關節(jié)病的防治等方面具有 重要的作用。硫酸軟骨素除了作為藥品外，大量的是作為改善關節(jié)病的補充品，作為健康食 品應用，在美國已經(jīng)風行多年。經(jīng)過多年的應用，已經(jīng)證明硫酸軟骨素對改善老年退行性關 節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎有一定的效果。硫酸軟骨素能發(fā)揮以下功效以緩解關節(jié)疼痛問題①提供墊襯作用，緩和行動時 的沖擊和摩擦；能將水分吸入蛋白多糖分子內(nèi)，使軟骨變厚猶如海綿般并增加關節(jié)內(nèi)的滑 液量。這樣它便能提供“墊襯”作用以增強關節(jié)的減震能力，緩和行走或跳動時的沖擊和摩 擦。②軟骨素的重要功能之一就是作為輸送管道，為軟骨輸送重要的氧和營養(yǎng)素，同時把二 氧化碳和廢物加以排除。由于關節(jié)軟骨并無血液供應，因此所有的充氧、滋養(yǎng)及潤滑作用皆 來自滑液。因老化、受傷或疾病而導致軟骨素流失會造成滑液流失，導致軟骨營養(yǎng)不良、干 涸、變薄及脆弱。此外，軟骨若缺少適當?shù)臓I養(yǎng)，因受傷或日常磨損而造成的軟骨損壞將更 加難以更生或愈合。③軟骨素的其它功效抑制破壞軟骨的酵素(例如膠原酶、彈性蛋白酶 和組織蛋白酶)，以免軟骨被分解或溶解；并且能從問題的根源處著手，抑制C0X-2的活性， 以防止關節(jié)發(fā)炎。微量硒是人體必需的營養(yǎng)元素，在臨床上亞硒酸鈉用于防治癌癥、高血壓、冠心 病、心肌炎、克山病、大骨節(jié)病等，若服用過量硒可引起中毒，每日最大安全量為400yg，硒 及其化合物有劇毒，但納米硒毒性比無機硒小，生物活性又高于無機硒，從而克服了傳統(tǒng)含 硒物質(zhì)有效劑量與中毒劑量相差不大的弱點。故隨著納米硒的研制成功，以及納米硒在生 物安全性上面的深入研究，作為一種有效的補硒劑將得到廣泛的認可和應用。可生物降解的聚合物納米粒子，特別是基于多糖的納米微球和納米微囊作為新型 藥物輸送和控釋載體，因其具有良好的生物相容性、超細粒徑、合理的體內(nèi)分布和高效的藥 物利用率，近年來日益受到廣泛關注。可生物降解聚合物納米微粒不僅可增強藥物的穩(wěn)定 性、提高療效、降低毒副作用，而且可有效地越過許多生物屏障和組織間隙到達病灶部位， 從而更有效地對藥物進行靶向輸送和控制釋。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種硫酸軟骨素納米硒及其制備方法，是以硫酸軟骨 素作為載體結合納米硒的新型材料，其毒性小，生物活性高。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)
一種硫酸軟骨素納米硒，以硫酸軟骨素作為載體，納米硒通過硫酸基團結合在硫 酸軟骨素上所形成的顆粒，其中硒的質(zhì)量分數(shù)為1 30%。所述的硫酸軟骨素納米硒在水或乙醇中分散后，自組裝形成粒徑為30 50nm的 納米顆粒。一種硫酸軟骨素納米硒的制備方法，包括以下步驟以質(zhì)量份數(shù)計，將1份的硫酸軟骨素和0. 1 1份的硒化物加入水中完全溶解 ’然 后在攪拌下，逐滴加入含有2 5份維生素C的水溶液，直至不再有沉淀生成，抽濾并收集 沉淀，30 50°C真空干燥后得到硫酸軟骨素納米硒；或者，以質(zhì)量份數(shù)計，將1份的硫酸軟骨素和0. 1 1份的硒化物加入水中完全溶 解；然后將所得溶液裝入透析袋中，放入含有2 10份維生素C的水溶液中透析24 30h， 收集透析袋中的溶液，冷凍干燥后得到的紅色粉末即為硫酸軟骨素納米硒。所述的硒化物為亞硒酸鹽或硒代硫酸鹽。所述的亞硒酸鹽為亞硒酸鈉或亞硒酸氫鈉，所述的硒代硫酸鹽為硒代硫酸鈉。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果本發(fā)明所提供的硫酸軟骨素納米硒是以硫酸軟骨素為載體，納米硒通過硫酸基團 結合后形成的可生物降解的聚合物納米粒子，在水或乙醇中分散后，形成自組裝納米顆粒。本發(fā)明所提供的硫酸軟骨素納米硒具有較低的細胞毒性，不僅可以拮抗T-2毒素 誘導細胞凋亡的作用，而且硫酸軟骨素納米硒拮抗T-2毒素誘導細胞凋亡的效果強于p38 和JNK抑制劑對T-2毒素誘導細胞凋亡的作用。與作為常規(guī)的治療大骨節(jié)病藥物的亞硒酸鈉相比，本發(fā)明提供的硫酸軟骨素納米 硒，結合了硫酸軟骨素和納米硒雙重藥理活性，降低了無機硒的毒性，提高其生物利用度的 同時結合硫酸軟骨素的生物活性，可以更好的將其發(fā)展成為預防和改善骨關節(jié)病的新型納 米材料。本發(fā)明利用硫酸軟骨素、亞硒酸鹽或硒代硫酸鹽作為原料，在溫和條件下通過維 生素C還原制得硫酸軟骨素納米硒，其工藝簡潔、操作簡單，是一種綠色環(huán)保的合成方法。 制備時硫酸軟骨素和亞硒酸鈉的相對量可以是一個較大的范圍，而在加工成藥品或保健品 時需要結合硒的生理需求量、界限中毒劑量、日建議膳食補充量和最高安全攝入量等數(shù)據(jù) 來綜合考慮每日最適補充劑量。
圖1為硫酸軟骨素納米硒(CSS)與硫酸軟骨素(CS)的紅外光譜對比譜圖；圖2為硫酸軟骨素納米硒(CSS)與硫酸軟骨素(CS)的XRD衍射對比譜圖；圖3為硫酸軟骨素納米硒(CSS)的透射電鏡圖；圖4為不同干預下軟骨細胞的MTT圖；圖5為不同干預下軟骨細胞的熒光顯微鏡圖；圖6為不同干預下軟骨細胞流式細胞圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。實施例1稱取硫酸軟骨素Ig溶解于IOml蒸餾水中，再加入亞硒酸鈉(Na2SeO3)O. 5g溶解， 得到無色透明溶液；然后在攪拌下，逐滴加入維生素C溶液(抗壞血酸溶液，抗壞血酸Ig溶 解于IOml蒸餾水中)，有紅色沉淀生成，待紅色沉淀不再生成時，抽濾，收集紅色沉淀，30°C 真空干燥得紅色粉末即為硫酸軟骨素納米硒。由原子熒光分光光度計測得硫酸軟骨素納米 硒中硒元素的含量為15.6%。實施例2稱取硫酸軟骨素5g溶解于20ml蒸餾水中，再加入亞硒酸氫鈉(NaHSeO3) 1. 2g溶 解，得到無色透明溶液；然后在攪拌下，逐滴加入抗壞血酸溶液(抗壞血酸3g溶解于IOml 蒸餾水中)，有紅色沉淀生成，待紅色沉淀不再生成時，再將反應體系轉(zhuǎn)入到透析袋中，并以 蒸餾水透析48小時，抽濾，收集紅色沉淀，30°C真空干燥得紅色粉末即為硫酸軟骨素納米 硒。由原子熒光分光光度計測得硫酸軟骨素納米硒中硒元素的含量為7.8%。實施例3稱取硫酸軟骨素2g溶解于5ml蒸餾水中，再加入亞硒酸氫鈉0. 5g溶解后得到無 色透明溶液，然后將裝有上述溶液的燒杯放在40KHZ，30°C條件下超聲30min后轉(zhuǎn)移到透析 袋中，將透析袋放入抗壞血酸溶液中(抗壞血酸5g溶解于50ml蒸餾水中)透析過夜，可見 透析袋中有紅色絮狀物，收集透析袋中的反應液，抽濾得紅色物質(zhì)，30°C真空干燥得紅色粉 末即為硫酸軟骨素納米硒。由原子熒光分光光度計測得硫酸軟骨素納米硒中硒元素的含量 為 9. 3%。實施例4稱取硫酸軟骨素2g溶解于5ml蒸餾水中，再加入亞硒酸氫鈉0. 2g溶解后得到無 色透明溶液，然后將裝有上述溶液的燒杯放在40KHZ，30°C條件下超聲30min后轉(zhuǎn)移到透析 袋中，將透析袋放入抗壞血酸溶液中(抗壞血酸2. 5g溶解于50ml蒸餾水中)透析過夜，可 見透析袋中有紅色絮狀物，收集透析袋中的反應液，抽濾得紅色物質(zhì)，30°C真空干燥得紅色 粉末即為硫酸軟骨素納米硒。由原子熒光分光光度計測得硫酸軟骨素納米硒中硒元素的含 量為2. 2%。實施例5稱取硫酸軟骨素0. 5g溶解于2ml蒸餾水中，再加入硒代硫酸鈉(Na2SSeO3) 0. 5g溶 解后得到無色透明溶液，然后將裝有上述溶液的燒杯放在40KHZ，30°C條件下超聲IOmin后 裝入透析袋中，將透析袋放入抗壞血酸溶液中(抗壞血酸2g溶解于30ml蒸餾水中)透析 過夜，然后將抗壞血酸溶液更換為蒸餾水，繼續(xù)透析12h，收集透析袋的反應液，冷凍干燥后 得紅色粉末即為硫酸軟骨素納米硒。由原子熒光分光光度計測得硫酸軟骨素納米硒中硒元 素的含量為18.4%。實施例6稱取硫酸軟骨素Ig溶解于IOml蒸餾水中，再加入硒代硫酸鈉0. Sg溶解，得到無 色透明溶液；然后在攪拌下，逐滴加入維生素C溶液(抗壞血酸溶液，抗壞血酸2g溶解于 IOml蒸餾水中)，有紅色沉淀生成，待紅色沉淀不再生成時，抽濾，收集紅色沉淀，30°C真空 干燥得紅色粉末即為硫酸軟骨素納米硒。由原子熒光分光光度計測得硫酸軟骨素納米硒中硒元素的含量為26.7%。對于所制備的硫酸軟骨素納米硒，下面對于其結構和生物活性進一步介紹。1、硫酸軟骨素納米硒的IR譜圖硫酸軟骨素的紅外吸收光譜在3400CHT1 (-0H，存在多糖經(jīng)基)，IeZOcnT1O C = 0)，1560cm"1 (C-N,存在乙酞氨基)，UOOcnT1至800CHT1間(存在硫酸基)有特征吸收峰。此 外，硫酸軟骨素A和C還略有不同，一般購買的商品硫酸軟骨素為A和C的混合物，硫酸軟 骨素A在928cm—1及852cm—1有特征吸收峰，而硫酸軟骨素C在lOOOcm—1及820cm—1處有特 征吸收峰。如圖1所示的硫酸軟骨素納米硒(CSS)與硫酸軟骨素(CS)的紅外光譜對比譜圖， 橫坐標為波數(shù)，可以看到所制備的硫酸軟骨素納米硒紅外圖譜lOOOcnT1附近的峰位明顯減 少和減弱，表明著納米硒與硫酸軟骨素結合的位置發(fā)生在硫酸基團處。2、硫酸軟骨素納米硒的XRD譜圖如圖2所示的硫酸軟骨素納米硒(CSS)與硫酸軟骨素(CS)的XRD衍射對比譜圖， 橫坐標以2 θ表示衍射儀掃描角度，縱坐標為強度；可以看出，二者晶體衍射的峰位和強度 均發(fā)生較大的變化，CS的衍射圖譜在很多峰位都有較強的吸收峰，每個峰位代表一個晶面， 經(jīng)過修飾后的CSS的衍射圖譜峰位減少，強度降低，說明形成了新的物質(zhì)。3、硫酸軟骨素納米硒形態(tài)與粒徑以無水乙醇分散硫酸軟骨素納米硒制成5%的溶液，超聲IOmin后，置于透射電鏡 下的觀察(加速電壓75kV，放大倍率50000 X)，其結果如圖3所示，可見硫酸軟骨素納米 硒呈較規(guī)則球形，粒徑在30nm-200nm，因為超聲作用，圖中可見少數(shù)硫酸軟骨硒粒子團聚現(xiàn) 象。這表明硫酸軟骨素納米硒在分散后，自組裝形成納米顆粒。4、硫酸軟骨素納米硒的生物活性4. 1硫酸軟骨素納米硒細胞毒性檢測將軟骨細胞種于96孔板中培養(yǎng)1天后，按照預先設定的濃度梯度進行干預，3天 后采用MTT法測量490nm的OD值以檢測細胞相對活力，具體的檢測結果的如圖4所示，橫 坐標為作對照的組號，每組將硒的濃度換算一致，亞硒酸鈉中硒的濃度為45. 6%，本試驗用 硫酸軟骨素納米硒中硒元素的含量由原子熒光分光光度計測得26. 7% (從左到右算起，1 組 Na2SeO3 lng/ml，CSS 為 1. 7ng/ml ；2 組 Na2SeO3 為 2ng/ml，CSS 為 3. 4ng/ml ；3 組 Na2SeO3 為 5ng/ml，CSS 為 8. 5ng/ml 4 組 Na2SeO3 為 10ng/ml，CSS 為 17ng/ml ；5 組 Na2SeO3 為 20ng/ ml, CSS 為 34ng/ml ；6 組 Na2SeO3 為 50ng/ml，CSS 為 85ng/ml ；7 組 Na2SeO3 為 100ng/ml，CSS 為 170ng/ml ；8 組 Na2SeO3 為 200ng/ml, CSS 為 340ng/ml)?？v坐標為細胞活力(% )；結果 顯示隨著濃度的提高，亞硒酸鈉處理過的細胞活力逐漸下降，尤其是從第6組增加到第7組 時，細胞活力下降尤為明顯；與亞硒酸鈉處理相比，硫酸軟骨素納米硒相同濃度處理后，細 胞活力要高于亞硒酸鈉處理后的細胞，尤其是從第6增加到第7、8組時，細胞活力幾乎沒有 下降，細胞活力要遠遠高于亞硒酸鈉處理后的細胞(75%> 20% )。這表明硫酸軟骨素納米 硒細胞毒性低于同劑量的亞硒酸鈉，而且細胞活力衰減到50%所需要的濃度要遠高于亞硒 酸鈉的濃度。4. 2硫酸軟骨素納米硒對T-2毒素的拮抗效果4. 2.1免疫熒光檢測
將軟骨細胞分為3組，一組為作為對照的正常細胞，一組為T-2毒素(濃度為 20ng/ml)處理細胞，一組為加入硫酸軟骨素納米硒(200ng/ml，硒的含量為10. 1%)和T-2 毒素(20ng/ml)處理細胞；培養(yǎng)5天后，用Armexin-V-FITC和PI雙標記細胞染色，熒光顯 微鏡下檢測，結果如圖5所示(上下兩排分別為綠色和藍色濾波片下的圖像)，與正常組細 胞的細胞存活數(shù)量相比，T-2毒素處理細胞組的細胞存活量最少，而加入硫酸軟骨素納米硒 的T-2毒素處理細胞組的細胞存活量，要多于T-2毒素處理細胞組，這表明硫酸軟骨素納米 硒可以拮抗T-2毒素誘導細胞凋亡的作用。4. 2. 2流式細胞術檢測將軟骨細胞分為5組，其中一組做空白對照(A組)，其余4組分別為B組T_2毒素 (20ng/ml)和 p38 (SB203580,10 μ Μ)、C 組Τ_2 毒素(20ng/ml)和 JNK 抑制劑(SP600125， 10 μ Μ)、D組T-2毒素(20ng/ml)和硫酸軟骨素納米硒(200ng/ml，其中硒的濃度為20ng/ ml)和E組T-2毒素(20ng/ml)組；抑制劑和藥物先于T-2毒素30min加入，培養(yǎng)3天后的 軟骨細胞用0. 25%的胰酶消化后，用Armexin-V-FITC和PI雙標記細胞凋亡試劑染色。處理完成之后，在流式細胞儀上檢測細胞的存活數(shù)量，具體的檢測結果如圖6所 示，其中，正常組的檢測結果圖6-A所示，T-2毒素+p38抑制劑的檢測結果圖6-B所示，T-2 毒素+JNK抑制劑的檢測結果圖6-C所示，T-2毒素+硫酸軟骨素納米硒的檢測結果圖6-D 所示，T-2毒素處理的檢測結果圖6-E所示，作為顯示檢測目標的LL、LR分別代表正常細 胞和早期凋亡細胞，而其結果不僅顯示濃度為200ng/ml的硫酸軟骨素納米硒可以拮抗T-2 毒素誘導細胞凋亡的作用，而且硫酸軟骨素納米硒拮抗T-2毒素誘導細胞凋亡的效果強于 P38和JNK抑制劑對T-2毒素誘導細胞凋亡的作用。
權利要求
1.一種硫酸軟骨素納米硒，其特征在于，以硫酸軟骨素作為載體，納米硒通過硫酸基團 結合在硫酸軟骨素上所形成的顆粒，其中硒的質(zhì)量分數(shù)為1 30%。
2.如權利要求1所述的硫酸軟骨素納米硒，其特征在于，所述的硫酸軟骨素納米硒在 水或乙醇中分散后，自組裝形成粒徑為30 200nm的納米顆粒。
3.一種硫酸軟骨素納米硒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟以質(zhì)量份數(shù)計，將1份的硫酸軟骨素和0.1 1份的硒化物加入水中完全溶解；然后在 攪拌下，逐滴加入含有2 5份維生素C的水溶液，直至不再有沉淀生成，抽濾并收集沉淀， 30 50°C真空干燥后得到硫酸軟骨素納米硒；或者，以質(zhì)量份數(shù)計，將1份的硫酸軟骨素和0. 1 1份的硒化物加入水中完全溶解； 然后將所得溶液裝入透析袋中，放入含有2 10份維生素C的水溶液中透析24 30h，收 集透析袋中的反應液，冷凍干燥后得到的紅色粉末即為硫酸軟骨素納米硒。
4.如權利要求3所述的硫酸軟骨素納米硒的制備方法，其特征在于，所述的硒化物為 亞硒酸鹽或硒代硫酸鹽。
5.如權利要求4所述的硫酸軟骨素納米硒的制備方法，其特征在于，所述的亞硒酸鹽 為亞硒酸鈉或亞硒酸氫鈉，所述的硒代硫酸鹽為硒代硫酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種硫酸軟骨素納米硒，以硫酸軟骨素作為載體，納米硒通過硫酸基團結合在硫酸軟骨素上所形成的顆粒，其中硒的質(zhì)量分數(shù)為1～30％。本發(fā)明利用硫酸軟骨素、亞硒酸鹽或硒代硫酸鹽作為原料，在溫和條件下通過維生素C還原制得硫酸軟骨素納米硒，其工藝簡潔、操作簡單，是一種綠色環(huán)保的合成方法。本發(fā)明提供的硫酸軟骨素納米硒，結合了硫酸軟骨素和納米硒雙重藥理活性，降低了無機硒的毒性，提高其生物利用度的同時結合硫酸軟骨素的生物活性，可以更好的將其發(fā)展成為預防和改善骨關節(jié)病的新型納米材料。
文檔編號A61P9/00GK102145174SQ20111008403
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權日2011年4月6日
發(fā)明者張峰, 武世勛, 郭雄, 韓晶, 馬瑋娟 申請人:西安交通大學