專利名稱：具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領域，涉及一種能有效地促進細胞粘附、增殖、分化，加 速新骨形成且兼具良好力學性能的有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料及其制 備方法。
背景技術：
在鈦合金表面制備磷酸鈣生物陶瓷涂層，因其兼具金屬基體材料優(yōu)良力學性能和 磷酸鈣涂層良好生物活性，被廣泛用于人工關節(jié)、牙種植體等承載用骨修復替換材料。隨著 關節(jié)置換病人的年輕化，對植入器械表面成骨活性提出更高的要求，以加速骨的早期長入， 促進假體與骨的早期愈合。膠原是天然骨的主要有機物組成成分，同時也是細胞外基質的主要成分，在骨修 復中起到重要的作用。研究證實，膠原可以顯著改善涂層表面的生物活性，促進成骨細胞 在材料表面的黏附，增殖和分化。同時，膠原可以作為生長因子(M.Murata，B-Z. Huang, Τ.Shibataet al. Bone augmentation by recombinant human BMP-2and collagen on adult rat parietalbone, Oral Maxillofacial Surgery, 1999 ；28 ；232-237)禾口 多肽 (Myles JL, Burgess B Τ, Dickinson BT. Modification of the adhesive properties of collagen by covalentgrafting with RGD peptides. J Biomater Sci Polymer Edn,2000, 11(1) :69-86)良好的載體。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp) 的短肽，作為整合素和其配體相互作用的識別位點，介導細胞與細胞外基質及細胞之間的 相互作用，如 GRGDSP (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro)多肽?，F(xiàn)有研究多集中在膠原和磷酸鈣復合形成的材料。如模擬生理環(huán)境浸泡法， 前驅液礦化沉積法(Roveri N, Falini G, Sidoti MC. Biologically inspired growth of hydroxyapatitenanocrystals inside self-assembled collagen fibers. J Mater Sci Eng，2003，23 :441-446),共沉淀法，羥基磷灰石/膠原的交聯(lián)與固化(John A, Liu H, IKada Y, etal.A trial to prepare biodegradable collagen-hydroxyapatite composites for bonerepair. J Biomater Sci Polymer Edn,2001,12(6) :689-705)等。 通過仿生技術反應得到的HA晶體沉積于膠原的納米材料類似于骨的結構，但其力學性能 存在不足，不能用于承載部位。在金屬材料表面上，多是采用將金屬依次浸泡于Na2HPO4, Ca(OH)2過飽和溶液中預鈣化，再在模擬體液中引入膠原，形成羥基磷灰石/膠原復合涂 層(楊賢金，崔振鐸，蔡彥麗等，鎳鈦合金表面羥基磷灰石/膠原復合涂層的化學制備方 法專利公開號=200510133632. 6)，或是將Ca(NO3)2，NH4H2PO4和I型膠原通過電化學方 法在金屬表面形成羥基磷灰石/膠原復合涂層(S.Manara，F(xiàn). Paolucci, B. Palazzo et al.Electrochemically-assisted depositionof biomimetic hydroxyapatite-collagen coatings on titanium plate. J InorganicaChimica Acta, 2008 ；361 ； 1634-1645)但其缺 點是制備過程復雜且界面的韌性較差，涂層厚度不夠，在沖擊載荷或熱沖擊作用下，容易發(fā)
3生脆性斷裂或剝落。本領域目前急需復合能有效地促進細胞粘附、增殖、分化，加速新骨形成且兼具良 好力學性能的多孔磷酸鈣-膠原復合涂層材料。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效地促進細胞粘附、增殖、分化，加速新骨形成且 兼具良好力學性能的生物醫(yī)用材料。本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案是提供一種新的具有多孔磷酸鈣-膠原復 合涂層的生物醫(yī)用材料。該生物醫(yī)用材料包括基底材料，在基底材料的外表面上復合多孔 磷酸鈣涂層，多孔磷酸鈣涂層上還復合膠原構建成多孔磷酸鈣-膠原復合涂層。其中，上述多孔磷酸鈣涂層為磷酸鈣材料通過液相等離子噴涂法復合在基底材料 上形成的。其中，上述磷酸鈣材料為羥基磷灰石或磷酸三鈣。進一步的，上述膠原裝載有促進成骨的生長因子或功能多肽。進一步的，所述的生 長因子為人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 ；所述功能多肽為RGD肽。其中，上述的基底材料為生物醫(yī)用金屬材料、生物醫(yī)用陶瓷材料、含金屬的生物醫(yī) 用復合材料或含陶瓷的生物醫(yī)用復合材料中的至少一種。其中，上述生物醫(yī)用金屬材料為生物醫(yī)用鈦合金材料、生物醫(yī)用不銹鋼材料、生物 醫(yī)用鈷基合金材料中的至少一種。其中，上述生物生物醫(yī)用陶瓷材料為氧化鋁陶瓷材料或氧化鋯陶瓷材料。本發(fā)明還提供了一種制備上述生物醫(yī)用材料的方法。該方法包括以下步驟a、配制磷酸鈣懸浮液；b、將步驟a得到的磷酸鈣懸浮液注入到等離子火焰中心的高溫區(qū)域，將其噴涂至 基底材料的表面，生成具有多孔的磷酸鈣涂層的生物醫(yī)用材料；C、將步驟b得到的具有的多孔磷酸鈣涂層的生物醫(yī)用材料浸入膠原溶液中18 36小時或將膠原溶液滴加在多孔磷酸鈣涂層表面；然后將材料在無菌條件下風干，即得。其中，上述方法步驟a所述的磷酸鈣懸浮液的制備方法為邊攪拌邊將摩爾濃度為1. 2 3. 6mol/L的磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為 1 3mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液30°C 90°C，以氨水控制其pH保持在9 12， 反應后靜置5 15分鐘，再陳化M 48小時。其中，上述方法中步驟b所述的將磷酸鈣懸浮液注入到等離子火焰中心的高溫區(qū) 域是采用霧化噴嘴進行；等離子噴涂功率為20 70千瓦，噴涂距離為80 180mm。其中，上述方法中步驟c所述膠原溶液為膠原的醋酸溶液。本發(fā)明還提供了使用上述的方法制備的生物醫(yī)用材料。其中上述步驟a中多孔磷酸鈣涂層的制備采用液相等離子噴涂，利用現(xiàn)有的技術 制備磷酸鈣液相先驅液，利用磷酸鈣先驅液作為噴涂原料，通過霧化噴嘴將液體先驅液原 料直接注入等離子火焰高溫區(qū)域，在極短時間(小于1微秒)完成與火焰的熱交換過程，隨 后經過原料中液滴的破碎、細化、蒸發(fā)、燒結、熔融，最后直接噴射在生物醫(yī)用基底上形成涂層。
其中上述作為多孔磷酸鈣涂層基底的材料需要能耐受等離子噴涂的高溫。如，生 物醫(yī)用金屬材料和生物醫(yī)用陶瓷材料。作為基底的生物醫(yī)用金屬材料包括生物醫(yī)用鈦，或 生物醫(yī)用不銹鋼，或生物醫(yī)用鈷基合金，或其他生物醫(yī)用金屬材料，或含金屬的生物醫(yī)用復 合材料。作為基底的生物醫(yī)用陶瓷材料包括氧化鋁陶瓷，或氧化鋯陶瓷，或其他生物醫(yī)用陶 瓷材料，或含陶瓷的生物醫(yī)用復合材料。其中上述的膠原可為I型膠原，可采用本領域常用的膠原材料。其中上述b中多孔磷酸鈣-膠原涂層的構建采用在磷酸鈣涂層表面直接復合膠原 表面層的方法，包括浸泡法，滴加法等方法。本發(fā)明產品可使用以下路線進行制備A多孔磷酸鈣涂層的制備按羥基磷灰石、磷酸三鈣等的鈣磷摩爾比，在不斷攪拌下將摩爾濃度為 1. 2-3. 6mol/L的磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為l_3mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持 反應液30-90°C，以質量百分比濃度10% -30%的氨水控制其pH保持在9_12，反應后靜置 5-15分鐘，再陳化M-48小時，加入常用的造孔劑。通過小角度霧化噴嘴將磷酸鈣先驅液進 行霧化，直接將先驅液注入等離子火焰中心的高溫區(qū)域，直接在作為基底的生物醫(yī)用材料 表面沉積生成多孔磷酸鈣涂層。其中等離子噴涂功率為20-70千瓦，所述作為基底的生物 醫(yī)用材料與等離子噴嘴距離為8-18厘米。涂層空隙結構在較大范圍可調(從接近完全致 密到 50%孔隙度)。B優(yōu)化設計的I型膠原材料的配制I型膠原的濃度，pH值等因素對涂層成骨活性都有一定的影響。通過調節(jié)膠原的 濃度，PH值，濃度范圍;3mg/ml-10mg/ml，pH值3-6. 5，進行優(yōu)化設計，最大限度提高涂層性 能?？傊?，可根據具體臨床應用需要，對膠原進行優(yōu)化設計。為進一步賦予材料與臨床使用密切相關的多種功能，可在膠原裝載促進成骨的生 長因子及功能多肽，如人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2能有效地促進骨髓基質干細胞向成骨細 胞分化，誘導骨分化；成骨細胞及骨髓基質干細胞在種植體表面的黏附、增殖、分化是植入 體與骨界面有效早期整合的前提和關鍵，而RGD多肽能粘附在植入體表面，從而提高成骨 細胞的黏附和活性，加速骨基質礦化。將生長因子和功能多肽配制成適宜濃度的液體，在直 接滴加到膠原溶液中攪拌混勻即可用于多孔磷酸鈣-膠原涂層的構建。C多孔磷酸鈣-膠原涂層的構建采用浸泡法，滴加法等在多孔結構磷酸鈣涂層表面涂覆I型膠原。將膠原溶解于醋酸溶液中(醋酸主要用于調節(jié)PH值)，配置成膠原溶液。將涂層 在無菌條件下浸沒于膠原溶液中18-36小時，或膠原溶液滴加在涂層表面，之后在超凈臺 內風干12-36小時。該制備過程簡單，所制得的磷酸鈣/膠原復合層材料在能有效的促進細胞在材料 表面的粘附，增殖和分化且兼力學特性，并能進一步裝載促進成骨的生長因子功能多肽，進 一步增進其誘導成骨能力及促進骨的早期長入?，F(xiàn)有技術多為多孔磷酸鈣-膠原混合的涂層材料，制備過程復雜且界面的韌性較 差，涂層厚度不夠，在沖擊載荷或熱沖擊作用下，容易發(fā)生脆性斷裂或剝落。無法得到能有 效地促進細胞粘附、增殖、分化，且兼具良好力學性能的多孔磷酸鈣-膠原復合涂層。解決這些問題的一個有效方法是在其涂層表面直接復合膠原表面層，這樣既可以進一步提高涂 層生物活性和成骨能力，同時膠原又是一種良好的載體，可以裝載各種促進成骨的生長因 子和多肽，進一步增進其誘導成骨能力及促進骨的早期長入。另外由于使用生物醫(yī)用材料 作為基底，即在植入器械表面直接復合多孔磷酸鈣-膠原生物活性涂層，這樣作為植入材 料具有很好的力學性能，可以應用在承載部位。同時滿足對植入器械表面生物活性及力學 性能的綜合要求，具有很大的臨床運用前景。此方法的關鍵是如何有效地將膠原很好地復 合在生物活性涂層表面?，F(xiàn)有植入器械表面的生物活性涂層多為致密結構，難以有效地將 膠原復合在生物活性涂層表面，且復合層的性能很差。為解決這一難題，本發(fā)明采用液相等離子噴涂技術制備具有多孔結構的涂層，具 體方法參見申請?zhí)枮?00910302244. 4的公開的中國專利申請。其優(yōu)點為涂層孔隙結構在 較大范圍可調(從接近完全致密到 50%孔隙度)。然后在這種多孔涂層上面直接復合膠 原表面層得到多孔磷酸鈣-膠原涂層，并可以在膠原涂層中裝載生長因子和功能多肽以獲 得更好的性能，此種結構兼具力學性能的同時可以更好的改善材料表面的生物活性及成骨 能力。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下有益技術效果1、現(xiàn)有研究多集中在膠原和磷酸鈣或其他高分子的復合材料，而這些復合材料的 強度較低，往往僅能用在非承載部位，其制備過程往往較為繁復，對其降解速率也很難控 制。本發(fā)現(xiàn)制備過程通過在醫(yī)用植入器械的生物活性涂層表面直接復合膠原，方法簡單，制 作成本低，可直接用于承載植入部位。2、常規(guī)生物活性涂層多為致密結構，不能有效地將膠原裝載在生物活性涂層表 面。針對植入體早期器械表面活性和骨長入能力，促進成骨臨床實際需要，利用液相等離子 噴涂新技術制備多孔生物活性涂層，并復合膠原，為細胞的粘附，增殖，擴展和分化提供良 好的生物界面，有利于促進植入體在術后的早期固定。而且涂層孔隙率結構在較大范圍可 調(從接近完全致密到 50%孔隙度)，可對膠原的釋放速率進行調控。3、多孔涂層上面直接復合膠原表面層，膠原表面層再進一步裝載生長因子及多 肽，這種復合結構更容易牢固吸附生長因子及多肽，降低了其在體內的釋放速率，使其在局 部發(fā)揮更為持久的生物誘導活性作用。而且還提供有利于骨質沉積的支架，避免了生長因 子和多肽的快速破壞，減少了用量。4、本方法制備的材料能有效地促進細胞黏附、增殖、分化，加速新骨形成且兼具力 學性能，能廣泛的用于骨等硬組織的修復中?？偟恼f來，表面多孔結構的納米涂層比現(xiàn)今臨床用商業(yè)化產品有更好的促進成骨 細胞增殖、分化能力，增強材料的組織修復能力。在這種多孔涂層上面直接復合膠原表面 層，改變植入器械表面特性，從而使植入器械具有更為優(yōu)良的生物相容性和細胞親和性，為 細胞的黏附、增殖、擴展和分化提供良好的生物界面，可大幅度提高現(xiàn)有植入器械成功率， 加速病人早期康復。


圖1液相等離子噴涂制備的具有多孔結構羥基磷灰石涂層掃描電鏡照片圖2復合膠原的多孔羥基磷灰石涂層掃描電鏡照片
圖3接種BMSC細胞與涂層表面4天后，多孔磷酸鈣涂層(3_A)，磷酸鈣-膠原復合 涂層(3-B)，磷酸鈣-裝載人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMPD膠原復合涂層(3-C)，磷酸 鈣-裝載RGD多肽膠原復合涂層(3-D)表面的細胞粘附情況的掃描電鏡照片。圖4MTT法對BMSC細胞在各種涂層表面的增殖情況Qd，4d，6d)0D值的檢測。圖中 每天的柱狀圖從左至右依次為多孔磷酸鈣涂層(HA)，磷酸鈣-膠原復合涂層(HA+Col)，磷 酸鈣-裝載人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2(rhBMPD膠原復合涂層(HA+Col+BMP)，磷酸鈣-裝 載RGD多肽膠原復合(HA+Col+RGD)。圖5Elisa法對BMSC在各種涂層表面生長過程中的分化早期堿性磷酸酶(ALP) 的檢測結果，單位ng/ml。圖中分別表示2d、4d、6d結果的柱狀圖從左至右依次為多 孔磷酸鈣涂層(HA)，磷酸鈣-膠原復合涂層(HA+Col)，磷酸鈣-裝載人重組骨形態(tài)發(fā) 生蛋白-2 (rhBMP-2)膠原復合涂層(HA+Col+BMP)，磷酸鈣-裝載R⑶多肽膠原復合 (HA+Col+RGD)。圖6Elisa法對BMSC在各種涂層表面生長過程中的分化晚期骨鈣素(OCN)的檢測 結果(2d、4d、6d)，單位 ng/ml。圖中分別表示2d、4d、6d結果的柱狀圖從左至右依次為多孔磷酸鈣涂層(HA)，磷 酸鈣-膠原復合涂層(HA+Col)，磷酸鈣-裝載人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMPD膠原復 合涂層(HA+Col+BMP)，磷酸鈣-裝載RGD多肽膠原復合(HA+Col+RGD)。圖7肉眼觀察多孔磷酸鈣-裝載人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP_2)膠原復合涂 層植入動物體內異位成骨情況圖8多孔磷酸鈣-裝載人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)膠原復合涂層植入動 物體內異位成骨的顯微鏡觀察結果。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
的描述說明本發(fā)明。本發(fā)明提供一種具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備方法，該 方法是以等離子噴涂為基礎，制備出多孔磷酸鈣涂層，直接在多孔涂層表面上復合膠原表 面層。具體操作步驟為A多孔磷酸鈣涂層的制備按羥基磷灰石、磷酸三鈣等的鈣磷摩爾比，在不斷攪拌下將摩爾濃度為 1. 2-3. 6mol/L的磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為1 3mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持 反應液30-90°C，以質量百分比濃度10% -30%的氨水控制其pH保持在9_12，反應后靜置 5-15分鐘，再陳化M-48小時，加入常用的造孔劑(如去離子水)。通過小角度霧化噴嘴將 羥基磷灰石先驅液進行霧化，直接將先驅液霧化注入等離子火焰中心的高溫區(qū)域，噴涂原 料的熔融，直接在作為基底的生物醫(yī)用材料表面沉積生成多孔磷酸鈣涂層。涂層空隙結構 在較大范圍可調(從接近完全致密到 50%孔隙度)。B膠原材料的設計膠原不同濃度，pH值等因素對涂層生物活性都有一定的影響。通過調節(jié)膠原濃度， PH值，濃度范圍3mg/ml-10mg/ml，pH值3-6. 5，進行優(yōu)化設計，最大限度提高涂層生物活性。
7在濃度范圍:3mg/ml-10mg/ml內，當膠原濃度增大到7mg/ml時，pH 5-6. 5，綜合各方面因素，
細胞增殖效果最好。為了進一步增進其誘導成骨能力及促進骨的早期長入，可在膠原裝載促進成骨的 生長因子或多肽，將生長因子或多肽配制成適宜濃度的液體，在直接滴加到膠原溶液中攪 拌混勻。C多孔磷酸鈣-膠原涂層的構建在涂層表面直接復合I型膠原表面層，采用浸泡法，滴加法在多孔結構羥基磷灰 石涂層表面涂覆膠原。將膠原溶解于醋酸溶液。再將無菌膠原1-2次滴加在涂層上，每次 在超凈臺內風干12-36小時。形成多孔磷酸鈣-膠原復合涂層，得到具有多孔磷酸鈣-膠 原復合涂層的生物醫(yī)用材料。以下通過具體實施例的方式對本發(fā)明做進一步詳述，但不應理解為是對本發(fā)明的 限制。凡基于本發(fā)明上述思想做出的修改，替換，變更均屬于本發(fā)明。實施例一本發(fā)明具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備按Caltl (PO4) 6 (OH) 2的鈣磷摩爾比(1. 67)，在不斷攪拌下將2. 8mol/L的磷酸氫二銨 水溶液滴加到2. 4mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液70°C，以質量百分比濃度25%的氨 水控制其PH保持在10. 5，反應后靜置10分鐘，再陳化M小時，即得固含量為34%的羥基 磷灰石懸浮液。然后將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中，將其稀釋成固含量為 17 %的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化噴嘴，使用液相等離子 噴涂方法，在直徑15mm，厚度1. 5mm的生物醫(yī)用鈦合金基底上(Ti_6Al_4V，西安寶雞市棋鑫 鈦業(yè)有限公司，牌號TC4，下同)形成厚度為120微米的涂層。涂層表面形貌采用掃描電鏡 進行觀察。掃描電鏡照片見圖1。將膠原(以下實驗所用膠原全部購于成都普川生物醫(yī)用 材料有限責任公司)溶解于醋酸溶液，濃度為7mg/ml，pH 6，再將膠原溶液0. 2ml滴加在涂 層上，之后在超凈臺內風干12小時。再次將0.2ml的膠原溶液滴加在涂層上。之后在超凈 臺內風干12小時。復合涂層表面形貌采用掃描電鏡進行觀察。掃描電鏡圖片見圖2。實施例二本發(fā)明具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備按Caltl (PO4) 6 (OH) 2的鈣磷摩爾比(1. 67)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為2. 8mol/L的 磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為2. 4mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液70°C，以質 量百分比濃度25%的氨水控制其pH保持在10. 5，反應后靜置10分鐘，再陳化M小時，即 得固含量為34%的羥基磷灰石懸浮液。將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中，將 其稀釋成固含量為17%的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化噴 嘴，使用液相等離子噴涂方法，最后在生物醫(yī)用鈦合金基底上形成厚度為120微米的涂層。 將膠原溶解于醋酸溶液，PH 6，將人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)溶于超純水中，濃度 為lmg/ml，滴加到膠原溶液中混勻，最終濃度為25 μ g/ml (rhBMP-2/7mg/ml膠原)。裝載 rhBMP-2的膠原溶液0. 2ml滴加在涂層上，之后在超凈臺內風干12小時。再次將0. 2ml的 膠原溶液滴加在涂層上。之后在超凈臺內風干12小時。實施例三本發(fā)明具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備Ca10 (PO4)6 (OH)2的鈣磷摩爾比(1. 67)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為2. 8mol/L 的磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為2. 4mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液70°C，以 質量百分比濃度25%的氨水控制其pH保持在10. 5，反應后靜置10分鐘，再陳化M小時，即得固含量為34%的羥基磷灰石懸浮液。將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中， 將其稀釋成固含量為17%的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化 噴嘴，使用液相等離子噴涂方法，最后在直徑15mm，厚度1. 5mm的生物醫(yī)用鈦合金基底上 (Ti-6A1-4V，西安寶雞市棋鑫鈦業(yè)有限公司，牌號TC4，下同)上形成厚度為120微米的涂 層。將膠原溶解于醋酸溶液，PH6，將多肽GRGDSP (SEQ ID No 1，R⑶中的一種)溶于超純水 中，濃度為5mg/ml，滴加到膠原溶液中混勻，最終濃度為0. 5mg/ml (GRGDSP/7mg/ml膠原)。 裝載GRGDSP的膠原溶液0. 2ml滴加在涂層上，之后在超凈臺內風干12小時。再次將0. 2ml 的膠原溶液滴加在涂層上。之后在超凈臺內風干12小時。實施例四本發(fā)明具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備按Caltl (PO4) 6 (OH) 2的鈣磷摩爾比(1. 67)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為2. 5mol/L的 磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為2. lmol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液65°C，以質 量百分比濃度20%的氨水控制其pH保持在11，反應后靜置7分鐘，再陳化30小時，即得固 含量為31 %的羥基磷灰石懸浮液，將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中，將其稀 釋成固含量為15. 5%的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化噴嘴， 使用液相等離子噴涂方法，在直徑15mm，厚度1. 5mm的生物醫(yī)用鈦合金基底上(Ti_6Al_4V， 西安寶雞市棋鑫鈦業(yè)有限公司，牌號TC4，下同)上形成涂層，噴涂厚度為150微米。將膠原 溶解于醋酸溶液中，濃度為7mg/ml，pH 5在將涂層樣品在無菌的條件下浸泡于膠原溶液中 24小時，之后在超凈臺內風干15小時。實施例五本發(fā)明具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備Ca10 (PO4)6 (OH)2的鈣磷摩爾比(1. 67)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為1. 7mol/L 的磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為1.4mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液65°C， 以質量百分比濃度23%的氨水控制其pH保持在11. 5，反應后靜置12分鐘，再陳化35小 時，即得固含量為21%的羥基磷灰石懸浮液，將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液 中，將其稀釋成固含量為10. 5%的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采 用霧化噴嘴，使用液相等離子噴涂方法，在直徑15mm，厚度1. 5mm的生物醫(yī)用鈦合金基底上 (Ti-6A1-4V，西安寶雞市棋鑫鈦業(yè)有限公司，牌號TC4，下同)上形成涂層，噴涂厚度為130 微米。將膠原溶解于醋酸溶液，濃度為5mg/ml，pH 4. 5再將膠原溶液0. 3ml滴加在涂層上， 之后在超凈臺內風干20小時。再次將0. 3ml的膠原溶液滴加在涂層上，之后在超凈臺內風 干20小時。實施例六本發(fā)明具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備按Caltl (PO4)6 (OH)2的鈣磷摩爾比(1. 67)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為1. 6mol/L的 磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為1. 3mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液50°C，以質 量百分比濃度22%的氨水控制其pH保持在9，反應后靜置5分鐘，再陳化45小時，即得固 含量為20%的羥基磷灰石懸浮液，將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中，將其稀 釋成固含量為10%的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化噴嘴，使 用液相等離子噴涂方法，在直徑15mm，厚度1. 5mm的生物醫(yī)用鈦合金基底上(Ti_6Al_4V，西 安寶雞市棋鑫鈦業(yè)有限公司，牌號TC4，下同)上形成涂層，噴涂厚度為150微米。將膠原溶 解于醋酸溶液，濃度為9mg/ml，pH 6. 5再將膠原溶液0. Iml滴加在涂層上，之后在超凈臺內 風干22小時。再次將0. Iml的膠原溶液滴加在涂層上，之后在超凈臺內風干22小時。
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實施例七本發(fā)明具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備按Ca3 (PO4) 2的鈣磷摩爾比(1. 5)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為3. Omol/L的磷酸氫 二銨水溶液滴加到摩爾濃度為3. Omol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液55°C，以質量百分 比濃度35%的氨水控制其pH保持在9. 5，反應后靜置5分鐘，再陳化25小時，即得固含量 為25 %的磷酸三鈣懸浮液，將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中，將其稀釋成固 含量為12. 5%的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化噴嘴，使用液 相等離子噴涂方法，在直徑15mm，厚度1. 5mm的生物醫(yī)用鈦合金基底上(Ti_6Al_4V，西安寶 雞市棋鑫鈦業(yè)有限公司，牌號TC4，下同)上形成涂層，噴涂厚度為110微米。將膠原溶解于 醋酸溶液中，濃度為5mg/ml，pH3. 5在將涂層樣品在無菌的條件下浸泡于膠原溶液中30小 時，之后在超凈臺內風干15小時。實施例八本發(fā)明具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的制備按Ca3 (PO4) 2的鈣磷摩爾比(1. 5)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為^nol/L的磷酸氫二 銨水溶液滴加到摩爾濃度為1. 7mol/L的硝酸鈣水溶液中，保持反應液75°C，以質量百分比 濃度20%的氨水控制其pH保持在10. 5，反應后靜置15分鐘，再陳化40小時，即得固含量 為25 %的磷酸三鈣懸浮液，將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中，將其稀釋成固 含量為12. 5%的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化噴嘴，使用液 相等離子噴涂方法，經過先驅液中液滴的破碎、細化、蒸發(fā)、燒結、熔融，最后在直徑15mm，厚 度1. 5mm的生物醫(yī)用鈦合金基底上(Ti-6A1-4V，西安寶雞市棋鑫鈦業(yè)有限公司，牌號TC4， 下同)上形成涂層，噴涂厚度為150微米。將膠原溶解于醋酸溶液，濃度為8mg/ml，pH 5.5 再將膠原溶液0. 25ml滴加在涂層上，之后在超凈臺內風干14小時。再次將0. 25ml的膠原 溶液滴加在涂層上，之后在超凈臺內風干14小時。試驗例一本發(fā)明具多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的細胞粘附實 驗取磷酸鈣-膠原生物活性涂層(實施例1制備的羥基磷灰石-膠原復合涂層材 料)，及裝載rhBMP-2 (實施2例制備的涂層材料)的活性涂層，裝載RGD的活性涂層(實施 例3制備的涂層材料)，磷酸鈣涂層(按實施例1方法制備的僅有羥基磷灰石涂層材料)，置 M孔培養(yǎng)板中。取第三代生長旺盛的幼兔的骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)制得2 X104/ml的細胞懸液，按Iml/孔的量接種于材料表面，在37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)4天后取出后，PBS沖洗一次。在4°C的條件下，用2. 5%的戊二醛固定過夜。在臨 界點干燥前先用酒精(30%，50%，70%，80%，90%，95%，100% )梯度脫水，每次15分鐘。 噴金后500倍電鏡(SEM)觀察，結果見圖3。復合膠原的多孔磷酸鈣和復合rhBMP-2/膠原的多孔磷酸鈣，貼附在材料表面的 細胞數量較為類似，并有大量偽足粘附在材料表面，顯示出細胞對材料的較好的粘附作用。 復合RGD/膠原的多孔磷酸鈣，有大量細胞粘附在材料的表面，且細胞呈扁平狀鋪展開。而 未經膠原表面修復的磷酸鈣涂層表面，貼附的細胞數量很少，表示明復合膠原的各組比未 復合組能更促進細胞的粘附。試驗例二 本發(fā)明具多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的細胞增殖試 驗按試驗例一的方式取磷酸鈣-膠原生物活性涂層材料，及分別裝載rhBMP-2、RGD的活性涂層材料，并取磷酸鈣涂層材料作為對照，置24孔培養(yǎng)板中。取第三代生長旺盛的 幼兔的骨髓間充質干細胞制得2*104的細胞懸液，按Iml/孔的量接種于材料表面，在37°C， 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，4天，6天。使用MTT法在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測得各個樣 品的OD值(結果見圖4)。結果表明，裝載膠原及進一步裝載功能多肽的磷酸鈣涂層材料的OD指在第2、4、6 天較磷酸鈣涂層有顯著性增加。在第4、6天，裝載rhBMP-2和裝載RGD多肽的膠原磷酸鈣 涂層相比膠原磷酸鈣涂層的OD值有顯著性增加。表明裝載膠原后能有效地促進細胞增殖， 裝載生長因子及多肽的膠原能進一步促進細胞的增殖。試驗例三本發(fā)明具多孔磷酸鈣_膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料的細胞分化試 驗 按試驗例一的方式取磷酸鈣-膠原生物活性涂層材料，及分別裝載rhBMP-2、RGD 的活性涂層材料，并取磷酸鈣涂層材料作為對照(同試驗例一)，置24孔培養(yǎng)板中。取第 三代生長旺盛的幼兔的骨髓間充質干細胞制得2*104的細胞懸液，按Iml/孔的量接種于材 料表面，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在2天，4天，6天取出，每孔加IOul裂解液 (Triton X-100)，反復吹打，并置37°C過夜，鏡下觀察已無完整細胞，按堿性磷酸酶和骨鈣 素試劑盒(BlueGene公司，中國)說明操作，測450nm出吸光度，并按其說明計算ALP和OCN 的量。結果見圖5、6。隨著時間的增加，膠原_磷酸鈣涂層材料和磷酸鈣涂層材料的ALP值逐漸增加，且 相比與磷酸鈣涂層材料有顯著性增加。表明表面經膠原修飾后能有效地促進骨髓基質干細 胞向成骨細胞分化。隨著時間的增加，OCN的值平緩增加，且裝載膠原的各組相比沒裝載膠 原組有顯著性增加，且裝載rhBMP-2/膠原組增加最為明顯，表明表面經膠原修飾后能有效 地促進骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，本發(fā)明更容易牢固吸附生長因子及多肽，降低了 其在體內的降解速率，使其在局部發(fā)揮更為持久的生物誘導活性作用。試驗例四本發(fā)明生物醫(yī)用材料的體內成骨實驗成年新西蘭大白兔5只，體重2. 0-2. 5kg，雌雄不限，清潔級。實驗過程對動物的處 置符合動物倫理學標準。將具有裝載rhBMP-2的膠原-磷酸鈣涂層的材料(直徑為4mm，長 度為IOmm的一面有內凹的圓柱狀鈦合金短棒，涂層按實施例二制備，鈦合金同實施例，購 自西安寶雞市棋鑫鈦業(yè)有限公司，牌號TC4)植入兔的背部肌肉以觀察材料的骨誘導性。在 術后4周處死動物，取材后，立即將標本置于10%甲醛中固定24h，制成石蠟標本。標本垂 直向切片，切片厚度5 μ m，HE染色，光鏡下觀察。圖7，在肉眼觀察下，能看到取出材料的紅 骨髓且皮質骨已經形成。圖8在光境下能觀察到大量的骨細胞。
權利要求
1.生物醫(yī)用材料，其特征在于所述生物醫(yī)用材料包括基底材料，在基底材料的表面 上復合多孔磷酸鈣涂層，多孔磷酸鈣涂層上復合膠原構建成多孔磷酸鈣-膠原復合涂層。
2.根據權利要求1所述的生物醫(yī)用材料，其特征在于所述多孔磷酸鈣涂層為磷酸鈣 材料通過液相等離子噴涂法復合在基底材料上形成。
3.根據權利要求1所述的生物醫(yī)用材料，其特征在于所述磷酸鈣材料為羥基磷灰石 或磷酸三鈣。
4.根據權利要求1所述的生物醫(yī)用材料，其特征在于所述膠原裝載有促進成骨的生 長因子或功能多肽。
5.根據權利要求1所述的生物醫(yī)用材料，其特征在于所述的基底材料為生物醫(yī)用金 屬材料、生物醫(yī)用陶瓷材料、含金屬的生物醫(yī)用復合材料或含陶瓷的生物醫(yī)用復合材料中 的至少一種。
6.根據權利要求5所述的生物醫(yī)用材料，其特征在于所述生物醫(yī)用金屬材料為生物 醫(yī)用鈦合金材料、生物醫(yī)用不銹鋼材料或生物醫(yī)用鈷基合金材料中的至少一種；所述生物 醫(yī)用陶瓷材料為氧化鋁陶瓷材料或氧化鋯陶瓷材料。
7.制備權利要求1 6任一項所述的生物醫(yī)用材料的方法a、配制磷酸鈣懸浮液；b、將步驟a得到的磷酸鈣懸浮液注入到等離子火焰中心的高溫區(qū)域，將其噴涂至基底 材料的表面，生成具有多孔的羥基磷灰石涂層的生物醫(yī)用材料；C、將步驟b得到的具有的多孔羥基磷灰石涂層的生物醫(yī)用材料浸入膠原溶液中或將 膠原溶液滴加在多孔羥基磷灰石涂層表面；然后將材料在無菌條件下風干，即得。
8.根據權利要求7所述的制備生物醫(yī)用材料的方法，其特征在于步驟b所述的中將 磷酸鈣懸浮液注入到等離子火焰中心的高溫區(qū)域是采用霧化噴嘴進行；等離子噴涂功率為 20 70千瓦，噴涂距離為80 180mm。
9.根據權利要求7所述的制備生物醫(yī)用材料的方法，其特征在于所述膠原溶液為膠原 的醋酸溶液。
10.使用權利要求7 9任一項所述的方法制備的生物醫(yī)用材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領域。要解決的主要技術問題是現(xiàn)有的磷酸鈣生物活性涂層的成骨活性有待進一步提高。本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案是提供一種能有效促進細胞粘附、增殖、分化，且兼具良好力學性能的具有多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的生物醫(yī)用材料及其制備方法。本發(fā)明方在多孔磷酸鈣涂層表面直接復合膠原表面層得到新的生物醫(yī)用材料。其既能加速骨的形成，促進植入體的早期固定，還可在膠原表面層裝載促進成骨的生長因子及多肽，進一步增進其誘導成骨能力及促進骨的早期長入。本發(fā)明工藝簡單，生產成本低，可大幅度提高現(xiàn)有植入器械的安全性和成功率，加速病人早期康復。
文檔編號A61L27/54GK102145194SQ20111008367
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權日2011年4月2日
發(fā)明者何靜, 吳堯, 吳方, 甘露, 田志立, 黃濤 申請人:四川大學