專利名稱：α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑的應(yīng)用及基于該應(yīng)用制備的疫苗制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利屬于疫苗制劑技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑的應(yīng)用及基于該應(yīng)用制備的疫苗制劑。
背景技術(shù)：
佐劑是指與抗原同時(shí)或預(yù)先應(yīng)用，能增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)。理想的佐劑應(yīng)具有有效性、安全性、穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性等特點(diǎn)。目前，通過(guò)佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫原性已經(jīng)成為疫苗開(kāi)發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域。佐劑疫苗的主要優(yōu)勢(shì)在于減少保護(hù)性免疫所需的抗原量。這種劑量節(jié)約效應(yīng)有助于增加可用疫苗劑量的數(shù)量，這一點(diǎn)在傳染病流行期間因制藥商的供貨能力有限而不能滿足需求時(shí)顯得尤為重要。疫苗佐劑的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能提高年幼人群和老年人免疫力的潛能，這是目前多數(shù)疫苗所缺乏的。目前常用的佐劑包括鋁佐劑、脂質(zhì)體、弗氏佐劑、粘膜免疫佐劑、CpG序列等，它們均能有效增強(qiáng)抗原的免疫性，但經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)的上市人用疫苗佐劑僅有鋁佐劑，而其促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力弱，并可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生IgE抗體，引起不良過(guò)敏反應(yīng)。據(jù)悉，諾華公司和葛蘭素史克公司目前正在加快開(kāi)發(fā)適用于老年人的流感疫苗新技術(shù)，這兩家公司均已收到了歐盟批準(zhǔn)他們分別用其水包油乳液MF59和AS03研發(fā)流感疫苗的申請(qǐng)。美國(guó)Juvaris生物治療制劑公司(JuvarisBioTherapeuticsdnc.)是一家開(kāi)發(fā)治療感染性疾病和癌癥的佐劑疫苗和免疫治療制劑的公司，該公司開(kāi)發(fā)的用于預(yù)防老年人流感的疫苗JVRS-100，目前正在為進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)招募受試者。目前甲型(HlNl)流感的流行已重新激發(fā)了各國(guó)政府有關(guān)機(jī)構(gòu)和疫苗研發(fā)人員對(duì)在流感疫苗中添加佐劑的重視， 現(xiàn)已有數(shù)個(gè)政府機(jī)構(gòu)加大了疫苗佐劑研發(fā)的投資，多家疫苗研發(fā)公司也已啟動(dòng)對(duì)甲型流感疫苗的各種佐劑的潛在效果的臨床實(shí)驗(yàn)。甘露聚糖肽是西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院(原西安醫(yī)科大學(xué))首創(chuàng)的一種生物反應(yīng)修飾物，曾用名多抗甲素，是從正常人咽喉部分離的甲型溶血性鏈球菌33#株的深層培養(yǎng)液中經(jīng)乙醇提取得到的一種甘露聚糖肽，是我國(guó)首創(chuàng)的新型免疫增強(qiáng)劑。研究表明低濃度的 α -甘露聚糖肽即可激活機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能，具有免疫調(diào)節(jié)作用，能提升外周白細(xì)胞，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，活化巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)胸腺淋巴細(xì)胞產(chǎn)生活性物質(zhì)，改善和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和應(yīng)激能力；并可激活吞噬細(xì)胞、NK和Τ、B細(xì)胞亞群，具有誘生干擾素和白介素等作用，可誘生多種效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子產(chǎn)生“細(xì)胞因子雞尾酒”效應(yīng)。廣譜殺滅病毒、致病菌以及廣譜誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡。臨床常用于治療或輔助免疫功能低下導(dǎo)致的各種疾病，其對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面1、對(duì)免疫細(xì)胞的作用α -甘露聚糖肽能增強(qiáng)腹腔單核一吞噬細(xì)胞的數(shù)量和一氧化氮的分泌。可使LDH、堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞吞噬活力和清除異物的能力增強(qiáng)。 對(duì)大鼠腹腔內(nèi)分別注射不同濃度的甘露聚糖肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量、LDH和 ACP的活性、吞噬活力、NO的分泌以及細(xì)胞毒性均隨著甘露聚糖肽劑量的增加而增加，同時(shí)大網(wǎng)膜乳斑的數(shù)量和面積也顯著增加。表明腹腔內(nèi)注射甘露聚糖肽增強(qiáng)了腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能。α -甘露聚糖肽還可激活T、B淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)胸腺淋巴細(xì)胞產(chǎn)生活性物質(zhì)，促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化，改善和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和應(yīng)激能力。低濃度甘露聚糖肽(I-IOmg/ L)可使淋巴細(xì)胞合成DNA及RNA功能增強(qiáng)；高濃度(30-100mg/L)作用相反。2、對(duì)外周血白細(xì)胞的影響α-甘露聚糖肽能促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞造血功能、增強(qiáng)外周血細(xì)胞的計(jì)數(shù)，通過(guò)誘生白細(xì)胞介素而產(chǎn)生升白作用。研究發(fā)現(xiàn)其與中藥配合有顯著提高白細(xì)胞療效的功能；并能有效預(yù)防白細(xì)胞下降，可作為原發(fā)性肝癌化療的輔助用藥。3、對(duì)免疫球蛋白和血清補(bǔ)體的影響α -甘露聚糖肽能使血清IgG、IgA增高、刺激補(bǔ)體生成，提高補(bǔ)體生成水平。用其治療小兒反復(fù)呼吸道感染，用藥3個(gè)月后血清IgG、 IgA水平顯著提高。接種乙肝疫苗是人體抵抗HBV侵襲的卓有成效的方法。但是接種乙肝疫苗后，成人約有15% -30%接種者無(wú)免疫應(yīng)答。劉銳等觀察了甘露聚糖肽對(duì)促進(jìn)乙肝疫苗接種者抗體形成的療效，結(jié)果第一針免疫后3個(gè)月和第一針免疫后7個(gè)月抗-HBs陽(yáng)轉(zhuǎn)率明顯增高；第一針后7個(gè)月時(shí)抗-HBs滴度試驗(yàn)組為(5 士89. 86)mIU/mL,對(duì)照組為 0觀士98. 96)mIU/mL，兩組比較有極顯著性差異(P < 0. 01)，表明甘露聚糖肽能促進(jìn)乙肝疫苗接種后免疫抗體的形成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑的應(yīng)用及基于該應(yīng)用制備的疫苗制劑，疫苗免疫效果表明α -甘露聚糖肽是一種有效、穩(wěn)定、的新型疫苗佐劑。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑的應(yīng)用。所述的α -甘露聚糖肽作為疫苗肌肉注射劑、疫苗滴鼻劑或疫苗口服劑的佐劑。α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑與抗原的質(zhì)量比為α-甘露聚糖肽抗原=10 1000 1。α -甘露聚糖肽的使用量為1 1000mg/kg。優(yōu)選α -甘露聚糖肽的使用量為5 10mg/kg。所述的α-甘露聚糖肽作為甲型流感疫苗、季節(jié)性流感疫苗、EV71手足口病疫苗、 肝炎疫苗、呼吸道類疫苗的佐劑。所述的α-甘露聚糖肽作為肝炎治療性疫苗、癌癥治療性疫苗、自身免疫性疾病治療性疫苗的佐劑。一種α -甘露聚糖肽作為佐劑的疫苗肌肉注射劑，以注射用水作為溶劑，在IOOml 疫苗制劑中包含1 50 μ g的抗原和1 IOOOmg的α -甘露聚糖肽。一種α -甘露聚糖肽作為佐劑的疫苗滴鼻劑，以純水作為溶劑，在IOOml疫苗制劑中包含抗原1 50 μ g、α -甘露聚糖肽、蔗糖10 2000mg、谷氨酸鈉1 lOOmg、水解膠原 10 lOOOrng、精氨酸10 lOOOrng、磷酸氫二鉀10 IOOOmg和磷酸二氫鉀5 500mg。一種α -甘露聚糖肽作為佐劑的甲型Hmi流感滴鼻劑疫苗，以純水作為溶劑，在 IOOrnl疫苗制劑中包含HA抗原1 50 μ g、α -甘露聚糖肽1 lOOOrng、蔗糖10 2000mg、 谷氨酸鈉1 100mg、水解膠原10 lOOOrng、精氨酸10 lOOOrng、磷酸氫二鉀10 IOOOmg 和磷酸二氫鉀5 500mg。
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與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果α -甘露聚糖肽作為疫苗佐劑具有安全、有效、穩(wěn)定、價(jià)廉的優(yōu)勢(shì)，首先α -甘露聚糖肽已經(jīng)作為免疫增強(qiáng)劑在臨床應(yīng)用，主要?jiǎng)┬蜑槠瑒?、肌肉注射劑和口服液。因此其安全性已得到充分?yàn)證，在免疫用劑量范圍內(nèi)是安全可靠的；其次，α-甘露聚糖肽來(lái)源于微生物發(fā)酵產(chǎn)物，造價(jià)低廉，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益；尤為重要的是α-甘露聚糖肽可以有效地減少保護(hù)性免疫所需要的抗原用量；在相同抗原用量下能夠激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，特別是能夠很好的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用，這一點(diǎn)是更優(yōu)于鋁佐劑。在不同的疫苗制劑中添加α-甘露聚糖肽作為佐劑之后，在相同抗原用量下能夠激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)包括體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫的免疫反應(yīng)的提升，尤其是對(duì)粘膜免疫水平的提升具有顯著的效果。不同濃度α -甘露聚糖肽與Hmi流感裂解苗配合使用后，血清IgG抗體水平、粘膜分泌型抗體slgA水平均有顯著提高，脾淋巴細(xì)胞增值率亦大幅提升。


圖1為不同濃度的佐劑和抗原配比的Hmi肌肉注射劑在免疫后血清抗體水平比較直方圖；圖2為不同濃度的佐劑和抗原配比的Hmi肌肉注射劑在免疫后脾淋巴細(xì)胞增殖率比較直方圖；圖3為不同濃度的佐劑和抗原配比的Hmi肌肉注射劑在免疫后粘膜分泌型抗體水平比較直方圖；圖4為不同濃度的佐劑和抗原配比的Hmi滴鼻劑在免疫后血清抗體水平比較直方圖；圖5為不同濃度的佐劑和抗原配比的Hmi滴鼻劑在免疫后脾淋巴細(xì)胞增殖率比較直方圖；圖6為不同濃度的佐劑和抗原配比的Hmi滴鼻劑在免疫后粘膜分泌型抗體水平比較直方圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供α -甘露聚糖肽作為疫苗佐劑的應(yīng)用，是基于在相同抗原用量下添加 α -甘露聚糖肽作為佐劑，能夠激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，特別是能夠很好的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用；所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)包括體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫。所述的α-甘露聚糖肽來(lái)源于微生物發(fā)酵液，包括溶血性鏈球菌等；菇類菌株發(fā)酵液，包括香菇、金針菇、猴頭菇等；以及酶轉(zhuǎn)化法，包括纖維素酶、中性細(xì)菌蛋白酶等所獲得的糖肽。α -甘露聚糖肽作為疫苗佐劑可應(yīng)用于甲型流感疫苗、禽流感疫苗、季節(jié)性多價(jià)流感疫苗；乙肝疫苗、丙肝疫苗、戊肝疫苗及其它肝炎疫苗；狂犬疫苗、EV71手足口病疫苗；多價(jià)肺炎疫苗、百日咳疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗及其它呼吸道類疫苗；
肝炎治療性疫苗、癌癥治療性疫苗以及自身免疫性疾病治療性疫苗及其它治療性疫苗。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，包括不同疫苗制劑及其免疫效果，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。實(shí)施例1 α -甘露聚糖肽佐劑Hmi疫苗肌肉注射劑及其免疫效果檢測(cè)1. 1 HlNl疫苗肌肉注射劑及對(duì)照制劑的配制疫苗溶液取含HA 420 μ g/mL的Hmi裂解疫苗液40 μ L，加入至360 μ L注射用水中，既10倍量稀釋，得到400 μ L濃度為0. 042 μ g/ μ L的疫苗稀釋液，記為藥液①。Hmi 裂解疫苗由浙江天元生物制品有限公司惠贈(zèng)。α -甘露聚糖肽溶液取15mga -甘露聚糖肽，溶解于ImL注射用水中，得到ImL濃度為15mg/mL的佐劑溶液，記為藥液②。α _甘露聚糖肽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)川抗制藥有限公司。不同配比的Hmi疫苗肌肉注射劑的配制如表1所示，其中，1 2為疫苗對(duì)照組， 3 5為不同劑量α -甘露聚糖肽作為佐劑，6為佐劑對(duì)照組，7為空白對(duì)照組。表1 Hmi疫苗肌肉注射劑的劑量配比表
權(quán)利要求
1. α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，α-甘露聚糖肽作為疫苗肌肉注射劑、疫苗滴鼻劑或疫苗口服劑的佐劑。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑與抗原的質(zhì)量比為α -甘露聚糖肽抗原=10 1000 1。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，α-甘露聚糖肽的使用量為1 1000mg/kg。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，α-甘露聚糖肽的使用量為5 10mg/kg。
6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的α-甘露聚糖肽作為甲型流感疫苗、 季節(jié)性流感疫苗、EV71手足口病疫苗、肝炎疫苗、呼吸道類疫苗的佐劑。
7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的α-甘露聚糖肽作為肝炎治療性疫苗、癌癥治療性疫苗、自身免疫性疾病治療性疫苗的佐劑。
8.—種α-甘露聚糖肽作為佐劑的疫苗肌肉注射劑，其特征在于，以注射用水作為溶齊[J，在IOOml疫苗肌肉注射劑中包含1 50 μ g的抗原和1 IOOOmg的α -甘露聚糖肽。
9.一種α-甘露聚糖肽作為佐劑的疫苗滴鼻劑，其特征在于，以純水作為溶劑，在 IOOml疫苗制劑中包含抗原1 50 μ g、α-甘露聚糖肽、蔗糖10 2000mg、谷氨酸鈉1 lOOmg、水解膠原10 lOOOrng、精氨酸10 lOOOrng、磷酸氫二鉀10 IOOOmg和磷酸二氫鉀 5 500mg。
10.一種α-甘露聚糖肽作為佐劑的甲型Hmi流感滴鼻劑疫苗，以純水作為溶劑，在 IOOrnl疫苗制劑中包含HA抗原1 50 μ g、α -甘露聚糖肽1 lOOOrng、蔗糖10 2000mg、 谷氨酸鈉1 100mg、水解膠原10 lOOOrng、精氨酸10 lOOOrng、磷酸氫二鉀10 IOOOmg 和磷酸二氫鉀5 500mg。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑的應(yīng)用。α-甘露聚糖肽作為疫苗佐劑具有安全、有效、穩(wěn)定、價(jià)廉的優(yōu)勢(shì)，首先α-甘露聚糖肽已經(jīng)作為免疫增強(qiáng)劑在臨床應(yīng)用，主要?jiǎng)┬蜑槠瑒?、肌肉注射劑和口服液。因此其安全性已得到充分?yàn)證，在免疫用劑量范圍內(nèi)是安全可靠的；其次，α-甘露聚糖肽來(lái)源于微生物發(fā)酵產(chǎn)物，造價(jià)低廉，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益；尤為重要的是α-甘露聚糖肽可以有效地減少保護(hù)性免疫所需要的抗原用量；在相同抗原用量下能夠激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，特別是能夠很好的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用，這一點(diǎn)是更優(yōu)于鋁佐劑。
文檔編號(hào)A61K39/29GK102166356SQ20111009130
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者馮素玲, 張卉, 王冰 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)