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      山芝麻提取物在制備抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):1009748閱讀:227來源:國(guó)知局
      專利名稱:山芝麻提取物在制備抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及中藥山芝麻提取物的用途,具體地說是以山芝麻水提取物、醇提取物、 三萜類化合物為原料在制備抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      乙型肝炎是感染乙型肝炎病毒Ofepatitis B Virus,HBV)引起的一種常見傳染病和多發(fā)病,易轉(zhuǎn)化為慢性,甚至發(fā)展為肝硬化、肝癌。該病發(fā)病的復(fù)雜性及轉(zhuǎn)變?yōu)槁缘碾y治性,尤其是發(fā)展至肝癌的嚴(yán)重性,使其成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界,尤其是我國(guó)醫(yī)務(wù)人員廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)之一。目前研究表明,乙型肝炎的發(fā)病主要與免疫力低下、病毒持續(xù)感染以及進(jìn)行性肝細(xì)胞損傷有關(guān),而某些中藥提取物可三方面并重,從而提高了療效。我國(guó)中草藥資源豐富, 在防治乙型肝炎方面積累了大量的經(jīng)驗(yàn),加之中草藥不良反應(yīng)小,價(jià)格便宜,因而從傳統(tǒng)中藥和天然藥物資源中尋找有效的抗乙型肝炎病毒藥物是一個(gè)行之有效的途徑。山芝麻系梧桐科植物山芝麻(Helicteres angustifolia L.)的根,能清熱解毒, 主要用于感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽、咽喉腫痛、麻疹等。至今,對(duì)山芝麻公開報(bào)道的研究主要集中在其化學(xué)成分的分離、鑒定方面,其藥效學(xué)研究很少,抗乙型肝炎的研究則未見報(bào)道。我們首次對(duì)山芝麻提取物(水提取物、醇提取物、三萜類化合物)在治療乙型肝炎方面進(jìn)行了系列的實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)其提取物具有良好的抗乙肝病毒的作用,療效穩(wěn)定,停藥后沒有出現(xiàn)反跳現(xiàn)象,且毒副作用小,具有非常好的研發(fā)前景。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供中藥山芝麻提取物(水提取物、醇提取物、三萜類化合物)在制備抗乙型肝炎藥物中的應(yīng)用,其中山芝麻水提取物和醇提取物是分別用水和75%乙醇按常規(guī)法提取得到的物質(zhì),而山芝麻三萜類化合物則是依次用乙醇提取、AB-8大孔樹脂柱分離得到的三萜類化學(xué)物質(zhì)的混合物,即總?cè)祁?。本發(fā)明是基于發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)研究而完成的。研究分兩大部分一、山芝麻提取物的制備1、山芝麻水提取物的制備山芝麻藥材飲片,加10倍量水提取2次,每次1.證,合并提取液,60°C減壓恒溫干燥即得山芝麻水提取物。2、山芝麻醇提取物的制備山芝麻藥材飲片,加10倍量75%乙醇浸泡30min,第1次回流提取2h,回收乙醇; 接著再用8倍量75%乙醇回流提取1. 5h,回收乙醇,合并兩次提取液,60°C減壓恒溫干燥即得山芝麻乙醇提取物。3、山芝麻三萜類化合物的制備山芝麻藥材,用乙醇回流提取,上AB-8大孔樹脂柱分離,最后60°C減壓恒溫干燥即得山芝麻三萜類化合物,以齊墩果酸為對(duì)照品,以5%香草醛-冰醋酸和高氯酸為顯色劑,采用分光光度法在550nm測(cè)定樣品的吸光度,測(cè)得山芝麻三萜類化合物純度為79. 8% (三萜類化合物含量測(cè)定方法參考文獻(xiàn)陸震鳴,陶文沂,許泓瑜,等.樟芝菌粉三萜類化合物含量的測(cè)定,中成藥[J],2008,30 (3) :402-405)。二、山芝麻提取物治療乙型肝炎的實(shí)驗(yàn)研究1、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)山芝麻提取物對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用采用健康成年的廣西麻鴨產(chǎn)的蛋孵化的1日齡雛鴨,經(jīng)腹腔注射DHBV-DNA強(qiáng)陽性病毒血清建立麻鴨乙肝動(dòng)物模型,分別給予山芝麻水提取物、醇提取物和三萜類進(jìn)行治療14天,并于用藥前第0天(Od)、用藥第7天(7d)、用藥第14天(14d)、停藥第7天(P7), 分別從脛靜脈采血,分離血清,采用FQ-PCR法、ELISA法、生化指標(biāo)試劑盒法分別檢測(cè)血清 DHBV-DNA、DHBsAg和肝功能生化指標(biāo)(包括清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量)。此外,于停藥第7天(P7),分別剖殺各組試驗(yàn)動(dòng)物,各取小塊肝組織固定于10%甲醛溶液,石蠟切片,用HE染色,病理檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),山芝麻水提物、醇提物和三萜類能明顯降低鴨血清乙型肝炎病毒 DHBV-DNA水平、乙肝血清標(biāo)志物DHBsAg含量和ALT/AST的含量,顯著提高血清SOD的活性, 3種提取物作用程度均與用藥劑量及用藥時(shí)間呈正相關(guān),并且停藥后沒有出現(xiàn)反跳現(xiàn)象。病理檢查顯示一定劑量的山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜類)可改善病變的肝臟組織。 拉米夫定陽性對(duì)照藥治療,在治療過程中可明顯抑制乙肝病毒量,但停藥后即顯著回升,病毒含量變化總體表現(xiàn)為用藥時(shí)持續(xù)下降、停藥即出現(xiàn)反跳的規(guī)律。山芝麻提取物(水提物、 醇提物和三萜類)與拉米夫定比較,總體上看起效比較慢,但其抑制病毒的作用平穩(wěn)而持久且沒反跳現(xiàn)象,提示山芝麻提取物抑制體內(nèi)乙肝病毒的機(jī)制不同于拉米夫定,在長(zhǎng)期服藥用于治療慢性乙型肝炎方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。2、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)山芝麻提取物對(duì)乙肝病毒的抑制作用采用H印G2.2. 15細(xì)胞模型,運(yùn)用熒光定量PCR法、ELISA法,檢測(cè)山芝麻提取物 (水提物、醇提物和三萜類)對(duì)乙肝病毒DNA、HBSAg/HBeiVg的抑制作用。結(jié)果表明,山芝麻提取物對(duì)HBV DNA、HBsAg/HBeAg具有顯著的抑制作用,并且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加,其抑制作用逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)一個(gè)明顯的量效和時(shí)效反應(yīng)關(guān)系。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本相符,都說明了山芝麻提取物具有明顯的抑制乙肝病毒的作用。3、提高機(jī)體免疫實(shí)驗(yàn)觀察山芝麻提取物對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用靜脈注射刀豆蛋白A(Con Α)造成小鼠免疫性肝損傷,采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定給予山芝麻提取物治療后全血中⑶廣、CD4+、細(xì)胞亞群比率。結(jié)果顯示,山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜類)各劑量組外周血OT3+和細(xì)胞百分率及OT4VtD8+比值明顯高于模型組(ρ < ο. 05或ρ < ο. 01),而細(xì)胞百分率明顯低于模型組。提示,一定劑量的山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜類)能提高外周血τ淋巴細(xì)胞亞群(⑶3+、CD4+和⑶// CD8+)的比率,減少其向肝臟的浸潤(rùn),從而減小其細(xì)胞毒性作用對(duì)肝細(xì)胞的損傷??傊?,本發(fā)明首次對(duì)山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜類化合物)進(jìn)行了抗乙型肝炎的研究,體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,山芝麻提取物可明顯抑制乙肝病毒,減輕乙肝炎癥, 緩解肝臟組織細(xì)胞損傷,且作用穩(wěn)定持久,沒有反跳現(xiàn)象,優(yōu)于目前臨床常用的西藥拉米夫定,對(duì)防治乙肝具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。山芝麻提取物用于治療乙肝具有非常好的研發(fā)前景??捎糜谏a(chǎn)片劑、顆粒劑、合劑等劑型的治療乙肝的中藥制劑。
      具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)例一、山芝麻提取物的制備1、山芝麻水提取物的制備山芝麻藥材飲片1000g,W 10升水提取2次,每次1.證,合并提取液,60°C減壓恒溫干燥得268. 9g山芝麻水提取物。2、山芝麻醇提取物的制備山芝麻藥材飲片1000g,W 10升75%乙醇浸泡30min,第1次回流提取2h,回收乙醇;接著再用8升75%乙醇回流提取1. 5h,回收乙醇,合并兩次提取液,60°C減壓恒溫干燥即得山芝麻乙醇提取物113. 5g。3、山芝麻三萜類化合物的制備山芝麻lOOOg,加60 %乙醇浸lh,回流提取,第1次8000ml提濁,第2次8000ml 提1. ,合并提取液,減壓回收乙醇至無乙醇味,將濃縮物加蒸餾水溶解過濾。將濾液上 (40mmX800mm) AB-8大孔樹脂柱,用2倍量的蒸餾水洗滌樹脂柱,再用2倍量80%乙醇洗脫,流脫流速為50-60滴/min (約2_2. 5ml/min)。收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,在60°C 的減壓恒溫干燥箱中濃縮、干燥,得16. 326g山芝麻三萜類化合物。樹脂柱用3倍量的甲醇再生。以齊墩果酸為對(duì)照品,以5%香草醛-冰醋酸和高氯酸為顯色劑,采用分光光度法在550nm測(cè)定樣品的吸光度,測(cè)得山芝麻三萜類化合物純度為79. 8% (三萜類化合物含量測(cè)定方法參考文獻(xiàn)陸震鳴,陶文沂,許泓瑜,等.樟芝菌粉三萜類化合物含量的測(cè)定,中成藥[J],2008,30 (3) :402-405)。 二、山芝麻提取物治療乙型肝炎的實(shí)驗(yàn)研究1、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)山芝麻提取物對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用實(shí)驗(yàn)方案(1)廣西麻鴨乙肝動(dòng)物模型的建立采用健康成年的廣西麻鴨產(chǎn)的蛋孵化的1日齡雛鴨,經(jīng)腹腔注射O.aiil DHBV-DNA強(qiáng)陽性病毒血清。接種7d后,分別從脛靜脈采血約 0. 2-0. 3ml左右,裝入一次性EppendofT管中,整個(gè)過程注意不要交叉污染。4000rpm離心 5min,取血清。-20°C保存?zhèn)溆谩2捎肞CR法檢測(cè)篩選出感染陽性鴨。(2)實(shí)驗(yàn)分組及用藥經(jīng)PCR法檢測(cè)篩選出感染陽性鴨,飼養(yǎng)至13日齡作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行藥物治療試驗(yàn)。將80只鴨隨機(jī)分為8組,每組10只。①模型組等量的生理鹽水;②拉米夫定組灌胃給予拉米夫定50X 10_3g. kg"1. Cf1 ;③山芝麻水提取物高劑量組 2. 689g. kg—1. Cf1 ;④山芝麻水提取物低劑量組1. 345g. kg—1, cf1 ;⑤山芝麻乙醇提取物高劑量組1. 135g. kg-1· cf1 ;⑥山芝麻乙醇提取物低劑量組:0. 568g. kg-1· cf1 ;⑦三萜類高劑量組0. 163g. kg—1· cf1 ;⑧三萜類低劑量組:0. 081g. kg—1· cf1。各組每天早上8-9點(diǎn)鐘左右灌胃給藥,1天1次,連續(xù)14d,實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由取食和飲水。并于用藥前0d、用藥7d、用藥 14d、停藥7d(P7)時(shí),分別從脛靜脈采血,每只0. 5ml左右,分離血清,于_20°C保存?zhèn)溆谩?3) FQ-PCR檢測(cè)血清DHBV-DNA ①DHBV-DNA提取采用直接加熱法。每次取血清 100 μ 1,沸水浴 IOmin, IOOOOrpm 離心 5min。②加樣:2XSYBR PremixEx Taq 12. 5μ 1 ;ΙΟμΜ上游引物Ι.Ομ 1 ;ΙΟμΜ下游引物1. O μ 1 ;加無菌雙蒸水至23μ 1 ;血清提取物 2.0μ 1。③FQ-PCR反應(yīng)條件95°C變性10s,55°C退火20s,72°C延伸30s,共反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。④FQ-PCR的結(jié)果判讀擴(kuò)增過程及數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存和分析均由儀器及自帶的軟件自動(dòng)完成。(4)血清DHBsAg值檢測(cè)采用ELISA快速法、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司, Model450) 490nm 讀取 0. D 值。(5)肝功能生化指標(biāo)測(cè)定各組血清,用全自動(dòng)分析生化儀測(cè)各組鴨血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。(6)各組肝臟病理(HE染色)檢測(cè)于停藥7d分別剖殺各組試驗(yàn)動(dòng)物,各取小塊肝組織固定于10%甲醛溶液,石蠟切片,用HE染色,病理檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)對(duì)乙肝病毒的的抑制作用與模型組比較,山芝麻水提物、醇提物和三萜類各劑量組在給藥7d、14d和停藥7d 鴨血清DHBV-DNA拷貝數(shù)均有明顯降低(P < 0. 05或P < 0. 01),下降程度與用藥劑量及用藥時(shí)間相關(guān),并且停藥后沒有出現(xiàn)反跳現(xiàn)象,仍能維持在較低水平(P < 0. 05)。拉米夫定組用藥后,血清DHBV-DNA拷貝數(shù)開始明顯下降,第14d下降到最低值,停藥7d后DHBV-DNA拷貝數(shù)即顯著回升,病毒含量變化總體表現(xiàn)為用藥時(shí)持續(xù)下降、停藥即出現(xiàn)反跳的規(guī)律。山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜類)組與拉米夫定組比較,總體上看起效比較慢,但其抑制病毒復(fù)制的作用平穩(wěn)而持久,提示山芝麻提取物抑制體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制的機(jī)制不同于拉米夫定,在長(zhǎng)期服藥用于治療慢性乙型肝炎方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。表1治療前后鴨血清DHBV-DNA水平比較(7± S x 1 O8, η = 10Copy/ml)
      剎量DHBV-DNA
      (g-kg'-d"')T0T7T丨4P7模型對(duì)照2.51±1.092.83 士 1.042.76 士 0.982.51 ±0.87拉米夫定50x10°2.73±1·.351.16 士 0.81"δδ0.67 士 0.32*,'ΔΔ1.72±0.83水提取物低劑量1.3452.35±].151.77±0.98"·1.26±0.83*'"Δ1.56±0.75*水提取物高劑量2.6892.59 士 1.201.59±0.7Γδ1.05±0.88""仏厶1.23±0.84*"'ΔΔ醇提取物低劑量0.5682.69±1.081.83 土 0.86*1.43 士 0.78*' ΔΔ1.60±0.65*'Λ醇提取物高劑量1.1352.56±1.11*蚌Λ 1.37士0.84 Δ1.12±0.53*'ΔΔ1.31±0.77" ΔΔ三萜類低劑量0.0812.46 士 1.131.80±0.92*1.41±0.87*'"Δ].69±0.89三萜類高劑量0.1632.62 士 1.181.62 士 0.83-δ1.23 土 0.85*' ΔΔ1.38±0.86*'"ΔΔ注與模型組比較:*P< 0. 05,**P < 0. 01 ;與用藥前比較:Δρ < 0. 05,ΔΔρ < 0. 01(3)對(duì)血清DHBsAg的抑制作用
      模型組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中血清DHBsAg OD值基本穩(wěn)定,拉米夫定組用藥7_14d血清DHBsAg OD值持續(xù)降低(P<0.01),至停藥7d后出現(xiàn)回升現(xiàn)象。山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜類)組從用藥7d開始血清DHBsAg OD值顯有著降低(P < 0. 05或P < 0. 01);停藥后,山芝麻提取物組DHBsAg OD值與給藥前比較,仍有顯著性差異(P < 0. 05 或P < 0. 01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,山芝麻提取物能明顯降低乙型肝炎的血清標(biāo)志物HBsAg,進(jìn)一步證實(shí)了山芝麻提取物具有明顯的抑制乙型肝炎病毒的作用。結(jié)果見表2。表2治療前后鴨血清DHBsAg OD值的變化情況(^ts, η = 10)
      劑量DHBsAg OD值
      祖力丨J/g-kg1T0T7T14P7模型對(duì)照組0.85±0.210.82 士 0.190.87±0.130.86 士 0.17拉米夫定組50 χ IO"30.87±0.240.62±0.11*δ0.42 土 0.15**δδ0.78 士 0.12水提取物低劑量1.3450.88±0.260.71 士 0.140.67±0.12*λ0.70±0.13*水提取物高劑量2.6890.86±0.190.61 士 0.18*δδ0.43±0.12**δδ0.51±0.10**λδ醇提取物低劑量0.5680.84±0.150.80±0.160.71±0.13*0.73±0.11醇提取物高劑量1.1350.89±0.180.70 士 0.1 4δ0.56 士 0.13**δδ0.62±0,11**λδ三萜類低劑量0.0810.87±0.200.68±0.150.60 土 0.10**ΔΔ0.66±0.12**δδ三萜類高劑量0.1630.85±0.140.58±0.11**δδ0.40±0.10**δλ0.47±0.09**αδ注與模型組比較:*Ρ< 0. 05,**Ρ < 0. 01 ;與用藥前比較:ΔΡ < 0. 05,ΔΔρ < 0. 01(4)對(duì)肝臟炎癥的抑制作用與模型組比較,山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜類)組、拉米夫定組用藥后 7d-14d,血清ALT、AST的含量均明顯降低、而SOD活性明顯升高(P < 0. 05或P < 0. 01); 停藥后7d,山芝麻提取物高劑量組ALT、AST仍能維持在較低水平(P < 0. 05),而拉米夫定組ALT、AST則出現(xiàn)明顯反跳現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,山芝麻提取物能抑制乙型肝炎引起的炎癥,對(duì)損傷的肝細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。結(jié)果見表3-表5。表3治療前后鴨血清ALT水平變化情況(J土, η = 10)
      權(quán)利要求
      1.山芝麻水提取物在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
      2.山芝麻醇提取物在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
      3.山芝麻三萜類化合物在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種中藥山芝麻提取物在制備抗乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次對(duì)山芝麻提取物包括水提物、醇提物和三萜類化合物進(jìn)行了抗乙型肝炎的研究,體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,山芝麻提取物可明顯抑制乙肝病毒,減輕乙肝炎癥,緩解肝臟組織細(xì)胞損傷,且作用穩(wěn)定持久,沒有反跳現(xiàn)象,優(yōu)于目前臨床常用的西藥拉米夫定,對(duì)防治乙肝具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。山芝麻提取物用于治療乙肝具有非常好的研發(fā)前景。可用于生產(chǎn)片劑、顆粒劑、合劑等劑型的治療乙肝的中藥制劑。
      文檔編號(hào)A61P31/20GK102188461SQ20111010215
      公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
      發(fā)明者何敏, 廖明, 張士軍, 林興, 黃仁彬, 黃權(quán)芳 申請(qǐng)人:林興
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