專利名稱：酵母在制備抗球蟲病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明公開了酵母菌在制備抗球蟲病藥物中的應用，可以作為球蟲病疫苗的佐劑，用于預防和治療球蟲病，屬于醫(yī)學制藥技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
球蟲是一種單細胞的寄生性原蟲，它廣泛寄生在禽類的腸上皮細胞內(nèi)，可引起宿主嚴重腹瀉、腸道出血、甚至導致死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失。柔嫩艾美耳球蟲是球蟲中危害較為嚴重的一種疾病，在養(yǎng)雞生產(chǎn)中一直受到人們的重視。但是由于抗藥性的出現(xiàn)，使得一些抗球蟲藥物不能產(chǎn)生很好的防治球蟲病作用，藥物殘留等問題也影響了抗球蟲藥物研究的進展。免疫保護性疫苗的研究是預防球蟲病的一個較為理想的手段，但是目前應用的柔嫩艾美耳球蟲基因工程疫苗并不能產(chǎn)理想的免疫保護效果。酵母菌是一種單細胞生物， 屬真菌類，是生產(chǎn)面包必不可少的生物松軟劑，同時也可用于釀酒。酵母菌中蛋白質(zhì)含量特別豐富，有較高的營養(yǎng)價值。但是，酵母菌作為疫苗的佐劑并未見報道，也未見其在寄生蟲病的預防和治療中有所應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了酵母菌在制備抗球蟲病疫苗中的應用，為一種新的醫(yī)用用途，用于球蟲疾病的預防和治療。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的酵母菌可接種于300ml YPD培養(yǎng)基中，待菌液飽和后，室溫離心收集酵母菌細胞，加入200 μ L細胞裂解液重新懸浮酵母菌細胞，用酸洗過的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超聲波超聲破碎20min，測定蛋白濃度，配制成1 μ g/μ L的蛋白溶液，-20°C保存?zhèn)溆?，作為佐劑與疫苗等量混合即可。將釀酒酵母菌擴增，然后使用玻璃珠和超聲波將酵母菌的細胞破碎，與柔嫩艾美耳球蟲亞單位疫苗混合后免疫雛雞，進而檢測細胞免疫水平，體液免疫水平以及抗球蟲指數(shù)，驗證以酵母菌作為佐劑的亞單位疫苗對柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護作用，為雞球蟲病的防治研究提供理論依據(jù)。以下藥理實驗證明本發(fā)明的治療效果
1、柔嫩艾美耳球蟲ROM蛋白與MIC4蛋白的表達
根據(jù)GenBank中柔嫩艾美耳球蟲ROM (DQ323509)、MIC4 (AJ306453) DNA序列設計并合成兩對引物，
ROM-F :5’ -CGGGATCCAACATTTCACTGGACAAGTCG-3’， ROM-R 5' -CCGGAATTCACACGTTACTGCGAACCCGCA-3'； MIC4-F :5’ -CGCGGATCCGAA GGCGAGACAGGGAAACCTGG-3’， MIC4-R 5' -CGGAATTCCTACTGGATGTCACCA CTGTCTGCC-3，。提取柔嫩艾美耳球蟲總RNA，RT-PCR擴增ROM基因與MIC4基因，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET28a-R0M和pET28a-MIC4，及 I和I酶切鑒定正確后，將兩個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，IPTG誘導表達，經(jīng)Wfestern-blot鑒定正確后回收ROM蛋白與 MIC4蛋白，將表達的重組蛋白制備成三種亞單位疫苗
(1)ROM蛋白與MIC4蛋白混合后制備的亞單位疫苗(1 μ g/ μ L)；
(2)ROM蛋白制備的亞單位疫苗(1 μ g/μ L)；
(3)MIC4蛋白制備的亞單位疫苗(1μ g/μ L)。
2、酵母菌在柔嫩艾美耳球蟲亞單位疫苗中的應用
2. 1試驗分組及免疫程序設計
將酵母菌ΑΗ109接種于300ml YPD培養(yǎng)基中，待菌液飽和后，室溫1000 X g離心收集酵母菌細胞，加入200 μ L細胞裂解液重新懸浮酵母菌細胞，用酸洗過的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超聲波超聲破碎20min，測定蛋白濃度，配制成1 μ g/μ L的蛋白溶液，_20°C保存 1日齡雛雞飼養(yǎng)于無球蟲污染的鐵籠中，自由采食，自由飲水。6日齡時，將雛雞隨機分為9組，每組20只。試驗設計與免疫程序見表1。試驗分組情況如下 (Al)將Iml第一種亞單位疫苗與酵母菌破碎蛋白等量混合； (A2)第一種亞單位疫苗；
(Bi)將Iml第二種亞單位疫苗與酵母菌破碎蛋白等量混合； (B2)第二種亞單位疫苗；
(Cl)將Iml第三種亞單位疫苗與酵母菌破碎蛋白等量混合； (C2)第三種亞單位疫苗；
(D)酵母菌破碎蛋白；
(E)紅對照組；
(F)白對照組；
將各組蛋白溶液對雛雞進行肌肉注射IOOPg/只。三免后一周口服接種萬.tenella新疆株孢子化卵囊1 X IO4個/只，紅白對照組肌肉注射PBS，紅對照組最后攻蟲，白對照組不攻蟲。
表1實驗設計與免疫程序
權(quán)利要求
1.酵母菌在制備抗球蟲病疫苗中的應用。
2.權(quán)利要求1所述疫苗的制備方法，包括以下步驟酵母菌可接種于300mlYPD培養(yǎng)基中，待菌液飽和后，室溫離心收集酵母菌細胞，加入200 μ L細胞裂解液重新懸浮酵母菌細胞，用酸洗過的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超聲波超聲破碎20min，測定蛋白濃度，配制成 1 μ g/μ L的蛋白溶液，-20°C保存?zhèn)溆?，作為佐劑與疫苗等量混合即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了酵母菌在制備抗球蟲病藥物中的應用，利用酵母菌能夠提高機體非特異性免疫力的作用，將酵母菌應用到寄生蟲病領域，將酵母菌細胞破碎后的蛋白作為球蟲病疫苗的佐劑，可以明顯增強疫苗的免疫保護效果，用于球蟲疾病的預防和治療。
文檔編號A61P33/02GK102188703SQ20111010236
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月24日
發(fā)明者任文陟, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李淑紅, 李 赫, 楊舉, 鄭君, 陳玉江 申請人:吉林大學