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      用于生產(chǎn)萜烯的酵母細(xì)胞及其用途

      文檔序號:510006閱讀:1320來源:國知局
      用于生產(chǎn)萜烯的酵母細(xì)胞及其用途
      【專利摘要】本發(fā)明涉及酵母細(xì)胞,其中所述細(xì)胞包含編碼可溶性羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的功能基因;所述細(xì)胞中一個或更多個編碼甾醇?;D(zhuǎn)移酶的基因缺陷或缺失;并且所述細(xì)胞對于至少組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶是原養(yǎng)型。另外,本發(fā)明涉及所述細(xì)胞用于生產(chǎn)一種或更多種萜烯的用途。此外,本發(fā)明涉及產(chǎn)生所述細(xì)胞以及生產(chǎn)一種或更多種萜烯和包含所述萜烯之藥物組合物或化妝品組合物、潤滑劑或變壓器油的方法。
      【專利說明】用于生產(chǎn)萜烯的酵母細(xì)胞及其用途
      [0001]本發(fā)明涉及酵母細(xì)胞,其中所述細(xì)胞包含編碼可溶性羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的功能基因;所述細(xì)胞中一個或更多個編碼甾醇?;D(zhuǎn)移酶的基因缺陷或缺失;并且所述細(xì)胞對于至少組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶是原養(yǎng)型。另外,本發(fā)明涉及所述細(xì)胞用于生產(chǎn)一種或更多種萜烯的用途。此外,本發(fā)明涉及產(chǎn)生所述細(xì)胞以及生產(chǎn)一種或更多種萜烯和包含所述萜烯之藥物組合物或化妝品組合物、潤滑劑或變壓器油的方法。
      [0002]在今天的制藥、化妝品和化學(xué)工業(yè)中,各種萜烯越來越重要。萜烯被用作例如藥物和化妝品組合物的添加劑,用作疫苗中的佐劑,用作皮膚潤濕劑,用作粘液溶解劑,用作外激素,用作激素,用于害蟲防治,用作潤濕劑,用作芳香劑,用作潤滑劑,用作抗微生物劑,用作抗炎藥,用作食品添加劑,用作電絕緣物,用作變壓器油或變壓器油添加劑,以及用作化學(xué)、制藥和化妝品工業(yè)中有用的原料化學(xué)品。萜烯還可用作用于化學(xué)目的的天然和可持續(xù)來源。
      [0003]在化學(xué)上,職烯衍來源于一個或更多個異戍二烯單位(亦稱作prenyl unit)。異戊二烯具有化學(xué)式CH2=C (CH3) -CH=CH20另外,通過與雜原子如氧或氮綴合,萜烯可被修飾為萜類(其也稱作類異戊二烯)。
      [0004]事實(shí)上,大部分萜烯以次生代謝物發(fā)現(xiàn)于植物、真菌和動物中。另外,多種細(xì)菌產(chǎn)生萜烯。萜烯可包含不同數(shù)目的異戊二烯單位。半萜及其衍生物包含單個異戊二烯單位,包括例如異戊烯醇(prenol)和異戊酸。單萜及其衍生物包含兩個異戊二烯單位,包括例如香葉醇、朽1檬烯和松油醇(terpineol)。倍半職烯及其衍生物包含三個異戍二烯單位,包括例如法呢烯(farnesene)、法尼醇(farnesol)。二職及其衍生物由四個異戍二烯單位構(gòu)成,包括例如焦磷酸香葉基香葉酯(geranylgeranyl pyrophosphate)、咖啡醇(cafestol)、咖啡豆醇(kahweol)、松柏烯(cembrene)和紫衫烯(taxadiene)(紫杉醇的前體)、視黃醇、視黃醛和葉綠醇。二倍半萜及其衍生物包含五個異戊二烯單位,包括例如二倍半萜是香葉基法尼醇。三職包含六個異戍二烯單位,包括例如角S烯(squalene)、羊毛固醇(Ianosterol)和環(huán)阿屯酯(cycloartenol)。四職包括例如無環(huán)番爺紅素(acyclic lycopene)、單環(huán)Y-胡蘿卜素以及雙環(huán)a和(6-胡蘿卜素。多萜由多個異戊二烯的長鏈構(gòu)成,包括天然橡膠和古塔波膠(gutta-percha)。
      [0005]絕大部分萜烯來源于酶催化的甲羥戊酸途徑。在此處,萜烯的形成始于乙酰-輔酶A(CoA)。兩個乙酰-Cok分子在酶催化下反應(yīng)形成一個乙酰乙酰-Cok分子。下一步,乙酰乙酰-CoA與另一乙酰-CoA分子反應(yīng)形成3-羥基-3-甲基-戊二酰-CoA (羥甲基戊二酸-CoA (hydroxymethylglutaryl-CoA), HMG-CoA) ? 下一步,HMG-CoA 被還原成甲輕戍酸。該反應(yīng)由酶HMG-CoA還原酶催化,通常是萜烯生物合成的限速步驟。因此,HMG-CoA還原酶被認(rèn)為是甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵酶。
      [0006]甲羥戊酸通常磷酸化兩次并且去羧基成為異戊烯基焦磷酸(isopentenylpyrophosphate, IPP)。通過連續(xù)的異構(gòu)化、縮合和脫氫步驟,IPP轉(zhuǎn)化成香葉基焦磷酸,其與另一 IPP單位結(jié)合形成法呢基焦磷酸。兩分子法呢基焦磷酸還原縮合成為角鯊烯,其可轉(zhuǎn)化成膽固醇和任意類固醇激素。[0007]或者,香葉基焦磷酸和法呢基焦磷酸可進(jìn)一步反應(yīng)成為更高級萜烯,例如四萜和多萜。
      [0008]較為重要的萜烯是三萜角鯊烯。全世界每年生產(chǎn)約2000噸角鯊烯。這產(chǎn)生約1.25億美元的年貿(mào)易額。在技術(shù)上,角鯊烯優(yōu)選地用作營養(yǎng)添加劑,用在化妝品和制藥工業(yè)中。此外,萜烯也用作可生物降解的潤滑劑,以及用作變壓器油。角鯊烯可用作抗氧化劑,并且還通常用作疫苗中的佐劑。
      [0009]傳統(tǒng)上,角鯊烯獲自生物來源,例如魚油,特別是鯊魚肝油。然后,角鯊烯通過費(fèi)力的程序純化自魚油的復(fù)雜組合物。在制藥領(lǐng)域,待批準(zhǔn)產(chǎn)品的可追溯性對于衛(wèi)生當(dāng)局(Health Authorities)很重要。但是,在產(chǎn)品包含來自動物來源的產(chǎn)品時,很難弄清楚這種可追溯性。例如,很難精確知道魚(例如鯊魚)在被殺死前吃的是什么。因此,對于藥用物品,重要的是使用符合GMP的原材料,這意味著從來源可正確得到其可追溯性。另外,多種鯊魚物種是受到滅絕威脅的瀕危物種。角鯊烯之外的萜烯同樣地獲自生物材料,并且必須借助費(fèi)力且通常有危險的程序來純化。
      [0010]因此,需要生產(chǎn)萜烯(例如,角鯊烯)的替代性方法。用經(jīng)遺傳修飾酵母菌株較高產(chǎn)率地生產(chǎn)角鯊烯的用途已經(jīng)得到證明(EP0486290)。但是,所描述的酵母菌株還產(chǎn)生大量類固醇,例如麥角固醇。類固醇的產(chǎn)生降低了角鯊烯和其他萜烯的產(chǎn)率。另外,大量類固醇雜質(zhì)的存在需要復(fù)雜的方法來從原材料中純化角鯊烯和其他萜烯。
      [0011]迄今為止,本領(lǐng)域中已知的經(jīng)遺傳修飾生物(GMO)生產(chǎn)的萜烯的濃度對于萜烯的有效工業(yè)生產(chǎn)來說太低,并且具有太多雜質(zhì)。
      [0012]另外,一般認(rèn)為經(jīng)遺傳修飾生物在遺傳上較不穩(wěn)定,在培養(yǎng)時通常比相應(yīng)的野生型細(xì)胞具有更低的生存力和/或生長動力學(xué)。因此,在批量培養(yǎng)所述細(xì)胞時,所述批次的生產(chǎn)力通常隨時間快速下降。這通常妨礙經(jīng)遺傳修飾生物在各種工業(yè)生產(chǎn)方法中的有效使用。
      [0013]另外,當(dāng)通過插入一個或`更多個外源基因產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾生物時,該生物的一個或更多個原始基因被所述外源基因代替。這可具有使細(xì)胞成為針對某些有機(jī)營養(yǎng)的營養(yǎng)缺陷型的優(yōu)點(diǎn),這一優(yōu)點(diǎn)可用于選擇的目的。另外,在某些細(xì)胞培養(yǎng)條件下,已知營養(yǎng)缺陷型能夠具有細(xì)胞繁殖上的優(yōu)點(diǎn)。在某些情況下,原養(yǎng)型細(xì)胞甚至被營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞超過。例如,已經(jīng)描述在氨受限的生長條件下,在培養(yǎng)30代后組氨酸原養(yǎng)型ho Λ::HIS3酵母細(xì)胞被相應(yīng)的組氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞HO his3超過(Pronk,2002)。因此,經(jīng)遺傳修飾生物通常以營養(yǎng)缺陷菌株培養(yǎng)。但是,使用營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞明顯限制了對培養(yǎng)基的自由選擇。
      [0014]鑒于以上內(nèi)容,對于以下生物具有尚未滿足的需求:即生產(chǎn)濃度和純度對于工業(yè)應(yīng)用來說足夠高的萜烯并且遺傳上足夠穩(wěn)定的生物。
      [0015]因此,本發(fā)明的技術(shù)問題在于提供具有改進(jìn)的萜烯生產(chǎn)力以及改進(jìn)的遺傳和表型穩(wěn)定性的生物。
      [0016]出乎意料地,發(fā)現(xiàn)以下酵母細(xì)胞具有高萜烯生產(chǎn)力并且在細(xì)胞培養(yǎng)時具有改進(jìn)的遺傳和表型穩(wěn)定性,所述酵母細(xì)胞包含編碼可溶性羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶的功能基因,其中一個或更個編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因缺失,并且所述酵母細(xì)胞對于組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶是原養(yǎng)型。預(yù)期地,編碼留醇酰基轉(zhuǎn)移酶的基因的缺失導(dǎo)致較低水平的甾醇酯。但是,出乎意料地,編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因的缺失并未導(dǎo)致留醇的積累,而是導(dǎo)致萜烯(例如角鯊烯)的積累。
      [0017]產(chǎn)生的細(xì)胞形成穩(wěn)定的細(xì)胞系,并且在培養(yǎng)超過30代時是遺傳穩(wěn)定的。在本文中,出乎意料地發(fā)現(xiàn)組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶原養(yǎng)型細(xì)胞比相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷細(xì)胞具有更高的遺傳和表型穩(wěn)定性。
      [0018]在第一個方面,本發(fā)明涉及酵母細(xì)胞,其中:
      [0019]a)所述細(xì)胞包含編碼可溶性羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶的功能基因;
      [0020]b)所述細(xì)胞中一個或更多個編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因缺陷或缺失;和
      [0021]c)所述細(xì)胞是至少組氨酸、亮氨酸或尿啼唳原養(yǎng)型,優(yōu)選地,其中所述細(xì)胞至少是組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶原養(yǎng)型,特別地,所述細(xì)胞是組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶原養(yǎng)型。[0022]本文使用的術(shù)語“酵母細(xì)胞”可廣義理解為任意酵母生物的細(xì)胞。優(yōu)選地,酵母細(xì)胞可以是酵母屬(Saccharomyces)細(xì)胞,特別是選自以下的酵母屬細(xì)胞:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、德氏酵母(Saccharomyces delbrackii)、意大利酵母(Saccharomyces italicus)、捕圓酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、發(fā)酵酵母(Saccharomyces fermentati)、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、克魯斯假絲酵母(Saccharomyces krusei)、乳酸酵母(Saccharomyces Iactis)、馬克酵母(Saccharomycesmarxianus)、小捕圓酵母(Saccharomyces microellipsoides)、山地酵母(Saccharomycesmontanus)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)、撤攬酵母(Saccharomyces oleaceus)、奇異酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、布雷多倫酵母(Saccharomyces pretoriensis)、羅氏酵母(Saccharomyces rosei)、魯氏酵母(Saccharomyces rouxii)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、路德類酵母(Saccharomycodes Iudwigii)。最優(yōu)選地,細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞。釀酒酵母細(xì)胞可以是任意菌株的細(xì)胞,優(yōu)選如在實(shí)施例中示例性使用的菌株AH22的細(xì)胞。
      [0023]或者,所述細(xì)胞可以是非酵母屬(non-Saccharomyces)細(xì)胞,如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、馬克斯克魯維酵母馬克斯變種(Kluyveromycesmarxianus var.marxianus)、耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、解脂假絲酵母(Candida lipolytica)和多變假絲酵母(Candida versatilis)、畢赤酵母屬(Pichia)如樹干畢赤酵母(Pichia stipidis)、巴斯德畢赤酵母(Piachia pastoris)和嗜木糖醇畢赤酵母(Pichia sorbitophila)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaromyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、復(fù)膜抱酵母屬(Saccharomycecopsis)、類酵母屬(Saccharomycodes)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、威克酵母屬(Wickerhamia)、德巴利酵母屬(Debayomyces)、有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、結(jié)合酵母屬(Zygosaccharomyces)、甲醇誘導(dǎo)型酵母屬(Ogataea)、Kuraishia、Komagataella、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、擬威爾酵母屬(Williopsis)、Nahazawaea^隱球菌屬(Cryptococcus)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、孢酵母屬(Bullera)、紅酵母屬(Rhodotorula)、Willopsis 或擲抱酵母屬(Sporobolomyces)。
      [0024]本文中使用的術(shù)語“功能基因”是指在酵母細(xì)胞中具有活性的基因。因此,在合適的條件下,基因可在酵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯,并且可表達(dá)可溶性羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶多肽。在整個發(fā)明中使用的術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地理解。
      [0025]術(shù)語“可溶性羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶”可最廣義地理解為催化還原羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)成為甲羥戊酸的可溶形式的酶。本文使用的術(shù)語“羥甲基戊二酰輔酶A”、“羥甲基戊二酰-CoA”、“3-羥基-3-甲基-戊二酰-CoA”、“3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA”、“ P -羥基-P -甲基-戊二酰-CoA”、“ P -羥基-P -甲基戊二酰-CoA”、“beta-羥基-beta-甲基-戊二酰-CoAbeta-羥基-beta-甲基戊二酰-CoA”和“HMG-CoA”可互換地理解。
      [0026]優(yōu)選地,與野生型形式的HMG-CoA還原酶相比,本發(fā)明的可溶性HMG-CoA還原酶可不受野生型HMG-CoA的一種或更多種抑制劑的抑制,所述抑制劑例如甲羥戊酸、胰高血糖素、膽固醇、L-羥膽固醇、低密度脂蛋白和膽汁酸。
      [0027] 最優(yōu)選地,如在實(shí)施例中示例性使用的,可溶性HMG-CoA還原酶是截短的HMG-CoA還原酶(tHMGl)。該截短的tHMGl在Basson等(Basson等,1988)中進(jìn)一步描述,和/或由SEQ ID NO:1的DNA序列編碼。
      [0028]應(yīng)理解,本發(fā)明的可溶性HMG-CoA還原酶還可以是一種或更多種翻譯后修飾的產(chǎn)物。翻譯后修飾是本領(lǐng)域中周知的,可包括但不限于酯化、磷酸化、硫酸化、糖基化、截短、數(shù)個氨基酸部分的環(huán)化、多肽鏈的環(huán)化、氧化、還原、脫羧、乙?;Ⅴ0坊?、脫氨基、二硫鍵形成、焦谷氨酸鹽/酯形成、氨基酸添加、輔因子添加(例如,生物素化、血紅素添加)和金屬離子、非金屬離子、肽或小分子的絡(luò)合、以及鐵-硫化物簇的添加。顯然,輔因子例如ATP、ADP、NAD+、NADH+H+、NADP+、NADPH+H+、金屬離子、陽離子、脂質(zhì)等可與多肽結(jié)合,而不論這些輔因子的生物學(xué)影響如何。
      [0029]本文使用的術(shù)語“可溶性”是指具有降低的膜結(jié)合性質(zhì)的酶形式。優(yōu)選地,超過50 %的本發(fā)明的可溶性HMG-CoA分子不整合進(jìn)或附接到細(xì)胞膜上,更優(yōu)選地,超過60 %的本發(fā)明的可溶性HMG-CoA分子不整合進(jìn)或附接到細(xì)胞膜上,更優(yōu)選地,超過70%的本發(fā)明的可溶性HMG-CoA分子不整合進(jìn)或附接到細(xì)胞膜上,更優(yōu)選地,超過80 %的本發(fā)明的可溶性HMG-CoA分子不整合進(jìn)或附接到細(xì)胞膜上,更優(yōu)選地,超過90 %的本發(fā)明的可溶性HMG-CoA分子不整合進(jìn)或附接到細(xì)胞膜上,最優(yōu)選地,超過95%的本發(fā)明的可溶性HMG-CoA分子不整合進(jìn)或附接到細(xì)胞膜上。優(yōu)選地,可溶性HMG-CoA還原酶存在于本發(fā)明的酵母細(xì)胞的胞漿中。
      [0030]本文使用的術(shù)語“留醇?;D(zhuǎn)移酶”是指任何催化形成留醇?;サ拿浮A舸减;D(zhuǎn)移酶可以是留醇0-?;D(zhuǎn)移酶。本文使用的術(shù)語“留醇0-?;D(zhuǎn)移酶”、“留醇酯合酶”和“?;?CoA:留醇?;D(zhuǎn)移酶”可互換地理解。在本發(fā)明上下文中,留醇0-酰基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選酵母留醇0-?;D(zhuǎn)移酶(EC2.3.1.26)。更優(yōu)選地,留醇0-酰基轉(zhuǎn)移酶是在實(shí)施例中示例使用的一種或兩種留醇0-?;D(zhuǎn)移酶的基因產(chǎn)物,因此,是酵母的AREl基因和/或ARE2基因。
      [0031]AREl基因也稱作SAT2基因,有序基因座名稱YCR048W或ORF名稱YCR48W。ARE2基因也稱作SATl基因,有序基因座名稱YNR019W或ORF名稱N3206。
      [0032]在本發(fā)明的酵母細(xì)胞的情況下,編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因缺失或缺陷。本文使用的術(shù)語“缺失”是指基因或者基因的一個或更多個部分被移除?;虿晦D(zhuǎn)錄,并且無基因產(chǎn)物產(chǎn)生,因此沒有相應(yīng)的多肽產(chǎn)生??衫斫?,不需要整個基因都從基因組中移除。優(yōu)選地,超過基因的50%、更優(yōu)選超過基因的60%、更優(yōu)選超過基因的70%、更優(yōu)選超過基因的80%、更優(yōu)選超過基因的90%、更優(yōu)選超過基因的95%、最優(yōu)選基因的100%缺失。缺失可以是末端缺失或中間缺失。其可由實(shí)驗(yàn)者或自然造成??赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法使基因缺失。例如,可通過交換(cross over)或使用ere重組酶程序使基因缺失(Guldener等,1996)。
      [0033]本文使用的術(shù)語“缺陷”是指基因不轉(zhuǎn)錄或基因編碼無功能的基因產(chǎn)物(因此,無功能的多肽)。在留醇?;D(zhuǎn)移酶基因的情況下,術(shù)語“無功能”是指與相應(yīng)的野生型多肽相比,該多肽具有小于50%、優(yōu)選小于40%、更優(yōu)選小于30%、更優(yōu)選小于20%、更優(yōu)選小于10%、更優(yōu)選小于5%、更優(yōu)選小于4%、更優(yōu)選小于3%、更優(yōu)選小于2%、最優(yōu)選小于I%的?;D(zhuǎn)移酶效率。
      [0034]如在實(shí)施例中示例性示出的,AREl和/或ARE2基因可優(yōu)選地缺失,特別地,AREl和ARE2基因缺失??赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任意方法使基因缺陷。例如,可通過實(shí)驗(yàn)者或自然(例如,輻射、化學(xué)劑或自發(fā))引起的非特定誘變或通過定點(diǎn)誘變(例如,通過PCR)使基因缺陷。其可由移碼突變或點(diǎn)突變(單個核苷酸改變)引起。
      [0035]在整個發(fā)明中,術(shù)語“原養(yǎng)型”可最廣義地理解為具有合成細(xì)胞生長所需的特定有機(jī)化合物的能力。在本發(fā)明的情況下,酵母細(xì)胞可以是組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶原養(yǎng)型。因此,細(xì)胞能夠獨(dú)自合成組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶,因此能夠在不含組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的培養(yǎng)基中以及不含組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的細(xì)胞培養(yǎng)板上生長。可理解,酵母細(xì)胞還可以是其他營養(yǎng)因子原養(yǎng)型。
      [0036]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的酵母細(xì)胞是穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞,優(yōu)選比以下相應(yīng)細(xì)胞更穩(wěn)定:至少是組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型,更優(yōu)選組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或者亮氨酸和尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷性,更優(yōu)選是組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型。
      [0037]本文使用的術(shù)語“穩(wěn)定細(xì)胞系”應(yīng)理解為保持其與本發(fā)明的背景相關(guān)的表型特性的細(xì)胞群。這些相關(guān)特性主要是生存力、生長和/或萜烯生產(chǎn)力,最優(yōu)選生存力、生長和萜烯生產(chǎn)力。
      [0038]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解,穩(wěn)定的細(xì)胞系優(yōu)選地也是遺傳穩(wěn)定的。
      [0039]與培養(yǎng)30代之前的酵母細(xì)胞相比,在培養(yǎng)了 30代時,萜烯生產(chǎn)力優(yōu)選地降低不超過50 %、更優(yōu)選降低不超過30 %、更優(yōu)選不超過20 %、更優(yōu)選不超過10 %、更優(yōu)選不超過
      8%、更優(yōu)選不超過6 %、更優(yōu)選不超過4 %、最優(yōu)選不超過2 %。
      [0040]另外,與培養(yǎng)30代之前的酵母細(xì)胞相比,在培養(yǎng)了 30代時,細(xì)胞增殖速率優(yōu)選地降低不超過50 %、更優(yōu)選降低不超過30 %、更優(yōu)選不超過20 %、更優(yōu)選不超過10 %、更優(yōu)選不超過8 %、更優(yōu)選不超過6 %、更優(yōu)選不超過4 %、最優(yōu)選不超過2 %。
      [0041]此外,在培養(yǎng)超過10、超過20、超過30、超過40、超過50、超過60、超過70、超過80、超過90、超過100、超過150或超過200代后,本發(fā)明酵母細(xì)胞的萜烯生產(chǎn)力優(yōu)選地未降低超過20%。
      [0042]同樣地,在培養(yǎng)超過10、超過20、超過30、超過40、超過50、超過60、超過70、超過80、超過90、超過100、超過150或超過200代后,本發(fā)明酵母細(xì)胞的細(xì)胞增殖速率優(yōu)選地未降低超過20%。
      [0043]在整個發(fā)明中,術(shù)語“營養(yǎng)缺陷型”可最廣義地理解為酵母細(xì)胞無法合成其生長所需的特定有機(jī)化合物。在本發(fā)明的情況下,酵母細(xì)胞可以是組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型。因此,細(xì)胞無法自己合成組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶,因此無法在不含組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的培養(yǎng)基和不含組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的細(xì)胞培養(yǎng)板中生長。營養(yǎng)缺陷型酵母需要在培養(yǎng)基中分別補(bǔ)充組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶。應(yīng)理解,酵母細(xì)胞還可以是其他營養(yǎng)因子營養(yǎng)缺陷型,所述其他營養(yǎng)因子包括但不限于維生素、氨基酸、糖和脂質(zhì)酸。
      [0044]本文使用的術(shù)語“至少為組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞”是指與本發(fā)明的細(xì)胞具有相同遺產(chǎn)來源的細(xì)胞。至少為組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞也包括編碼可溶性HMG-CoA還原酶的功能基因。另外,所述細(xì)胞中一個或更多個編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因缺陷或缺失。本發(fā)明的細(xì)胞與至少為組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞之間唯一的遺傳差異是后者至少為組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型。優(yōu)選地,細(xì)胞是酵母屬細(xì)胞。更優(yōu)選為釀酒酵母細(xì)胞,更優(yōu)選為菌株AH22的釀酒酵母細(xì)胞,更優(yōu)選地為來源于由菌株AH22得到的酵母菌株AH22tH3的細(xì)胞,更優(yōu)選地來源于菌株AH22tH3ura8,更優(yōu)選地來源于菌株AH22tH3ura8 A are I或AH22tH3ura8 A are2中的一種。最優(yōu)選地,至少為組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞是實(shí)施例中示例性示出的菌株AH22tH3ura8 A are I A are2的酵母細(xì)胞。
      [0045]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞是經(jīng)遺傳修飾細(xì)胞。
      [0046]本文使用的術(shù)語“經(jīng)遺傳修飾細(xì)胞”可最廣義地理解為基因已經(jīng)通過本領(lǐng)域中任何已知方法修飾的細(xì)胞,也稱為經(jīng)遺傳修飾生物(GMO)。細(xì)胞本身可以是經(jīng)修飾的或可以是經(jīng)遺傳修飾細(xì)胞的后代。通常GMO由人實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生,例如借助以下手段的非特異性或特異性誘變:輻射(例如,紫外線(UV)輻射、X-線輻射、放射性/核輻射(例如,a -、0 -或Y -輻射)或宇宙輻射)或一種或更多種誘變劑(例如,針對核苷堿基的烷化劑(例如,氮芥(例如,環(huán)磷酰胺、甲二氯二乙胺或雙氯乙基甲 胺(mustine) (HN2)、烏拉莫司汀或尿嘧啶氮芥、美法侖、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺)、亞硝基脲(例如,卡莫司汀、洛莫司汀、鏈脲佐菌素)、烷基磺酸鹽(例如,白消安)、噻替派及其類似物、鉬衍生物(例如,順鉬、卡鉬、奈達(dá)鉬、奧沙利鉬、賽特鉬、四硝酸三鉬)、甲基芐肼、六甲蜜胺、黃曲霉毒素和黃曲霉毒素及其代謝產(chǎn)物和衍生物、亞硝酸鹽、苯胺及其代謝產(chǎn)物和衍生物、苯及其代謝產(chǎn)物和衍生物、多環(huán)芳香烴及其代謝產(chǎn)物和衍生物))、亞硝胺、砷、石棉、鈹及其絡(luò)合物、環(huán)氧乙烷、六價鉻(VI)化合物、氡、氯乙烯、吸煙等)。但是,突變也可以是自發(fā)的。
      [0047]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞是酵母屬細(xì)胞,更優(yōu)選地,其中所述細(xì)胞是釀酒酵母,特別地,其中所述細(xì)胞來源于釀酒酵母細(xì)胞菌株AH22。
      [0048]菌株AH22的酵母細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection, ATCC),ATCC 號 38626。最初,AH22 菌株具有 leu2-雙突變,基因型 a’ Ieu2-31eu2-112his4-519canl 來源于野生型菌株 S288c (Hinnen 等,1978)。S288c菌株(Mortimer等,1985)也可以ATCC號26108商購得到。優(yōu)選地,本發(fā)明的酵母細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞,其來源于由菌株AH22的細(xì)胞得到的菌株AH22tH3,更優(yōu)選地來源于 AH22tH3ura8,更優(yōu)選地來源于菌株 AH22tH3ura8 A arc 1、AH22tH3ura8 A are2或 AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2 中的一種,更優(yōu)選地來源于 AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2,更優(yōu)選地來源于菌株 AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2H> AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2U> 或AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2L中的一種。最優(yōu)選地,本發(fā)明的酵母細(xì)胞是實(shí)施例中示例性示出的菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HUL的酵母細(xì)胞。
      [0049]在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中,可溶性HMG-CoA還原酶的特征在于:
      [0050]a)它是缺少膜結(jié)合區(qū)的截短的可溶性HMG-CoA還原酶蛋白;
      [0051]b)它編碼在載體上處于在所述細(xì)胞中有活性的啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下;和/或
      [0052]c)它在組成型啟動子的控制下,特別是在強(qiáng)組成型啟動子的控制下表達(dá)。
      [0053]在本發(fā)明上下文中,術(shù)語“截短的可溶性HMG-CoA還原酶蛋白”是指在組成的氨基酸鏈的長度方面,長度比野生型HMG-CoA還原酶蛋白短的HMG-CoA還原酶蛋白。優(yōu)選地,所述HMG-CoA還原酶蛋白缺少野生型蛋白的膜結(jié)合區(qū)。
      [0054]本文使用的術(shù)語“膜結(jié)合區(qū)”是指多肽鏈中與整合到膜中或附接到膜上有關(guān)的區(qū)域。在本領(lǐng)域中已知HMG-CoA還原酶的氨基末端525氨基酸主要整合到膜內(nèi)(Basson等,1988)。
      [0055]因此,在本發(fā)明的情況下,優(yōu)選地,多至位于約450至500、約500至510、約510至520、約 520 至 530、約 530 至 540、約 540 至 550、約 550 至 560、約 560 至 570、或約 570 至
      600位氨基酸的氨基末端的氨基酸可被截短。例如,多至氨基酸552的氨基酸(即,因此氨基酸I至552)可被截短(Polakowski等,1998)。更優(yōu)選地,如Basson等(Basson等,1988)等描述的,截短的可溶性HMG-CoA還原酶是tHMGl。tHMGl由SEQ ID NO:1的DNA序列編碼。
      [0056]與野生型形式的HMG-CoA還原酶相比,本發(fā)明的截短的可溶性HMG-CoA還原酶可不受野生型HMG-CoA還原酶的一種或更多種抑制劑抑制,所述抑制劑例如甲羥戊酸、胰高血糖素、膽固醇、L-羥膽固醇、低密度脂蛋白和膽汁酸。
      [0057]最優(yōu)選地,可溶性HMG-CoA還原酶是實(shí)施例中示例性使用的截短的HMG-CoA還原酶 tHMGl。該 tHMGl 還被 Basson 等(Basson 等,1988)描述,和 / 或由 SEQ ID NO:1 的 DNA序列編碼。
      [0058]如上所述,應(yīng)理解本發(fā)明的可溶性HMG-CoA還原酶也可以是一種或更多種翻譯后修飾的產(chǎn)物。翻譯后修飾是本領(lǐng)域中周知的,可包括但不限于酯化、磷酸化、硫酸化、糖基化、截短、多個氨基酸部分的環(huán)化、多肽鏈的環(huán)化、氧化、還原、脫羧、乙?;Ⅴ0坊?、脫氨基、二硫鍵形成、焦谷氨酸形成、氨基酸添加、輔因子添加(例如,生物素化、血紅素添加)和金屬離子、非金屬離子、肽或小分子的絡(luò)合、以及鐵-硫化物簇的添加。顯然,輔因子例如ATP、ADP、NAD+、NADH+H+、NADP+、NADPH+H+、金屬離子、陽離子、脂質(zhì)等可與多肽結(jié)合,而不論這些輔因子的生物學(xué)影響。
      [0059]在本文上下文中使用的術(shù)語“載體”可指將遺傳信息轉(zhuǎn)移到酵母細(xì)胞中的任何組合物。遺傳信息可被編碼成脫氧核苷酸(DNA)(雙鏈DNA (dsDNA)、單鏈DNA (ssDNA)),核糖核酸(RNA)(單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈RNA(dsDNA)),或DNA類似物如肽核酸(PNA)、嗎啉基(morpholino)、甘油核酸(GNA)、蘇阿糖核酸(TNA)或甲基化DNA。優(yōu)選地,遺傳信息被編碼成DNA。載體可以是本領(lǐng)域中已知的任何載體,例如線性載體、環(huán)狀載體、病毒載體或細(xì)菌載體。優(yōu)選地,載體包含線性DNA或環(huán)狀DNA,更優(yōu)選環(huán)狀DNA,特別是質(zhì)粒??赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法將載體插入到細(xì)胞中,并且其使用可聯(lián)合或不聯(lián)合轉(zhuǎn)染劑(例如,醋酸鋰、聚乙烯亞胺(PEI)、fugene、LT-1> JetPEI> transfectamine、脂質(zhì)體(Iipofectamine)、UptiFectin、PromoFectin、GenePORTER、Hilymax、碳納米纖維、碳納米管、細(xì)胞滲透肽(CPP)、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)、脂質(zhì)體、DEAE葡聚糖、樹狀聚合物)、聯(lián)合或不聯(lián)合電穿孔、聯(lián)合或不聯(lián)合基因槍、聯(lián)合或不聯(lián)合光學(xué)轉(zhuǎn)染、聯(lián)合或不聯(lián)合基因電轉(zhuǎn)移、聯(lián)合或不聯(lián)合穿刺轉(zhuǎn)染、聯(lián)合或不聯(lián)合磁轉(zhuǎn)染、和/或聯(lián)合或不聯(lián)合磁鐵輔助的轉(zhuǎn)染。優(yōu)選地,載體是環(huán)狀DNA載體,更優(yōu)選地,載體是質(zhì)粒。質(zhì)??梢允潜绢I(lǐng)域中已知的任何質(zhì)粒,例如YEpH2或PUC19質(zhì)粒。載體也可以是線性表達(dá)盒,其可整合或未整合在靶細(xì)胞的基因組中。但是,應(yīng)理解也可使用其他任何載體。
      [0060]術(shù)語“在轉(zhuǎn)錄控制下”是指啟動子調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄速率。轉(zhuǎn)錄速率是指每單位時間間隔與載體DNA的反義鏈區(qū)段互補(bǔ)的信使RNA(mRNA)的產(chǎn)生速率。
      [0061]本文使用的術(shù)語“啟動子”可最廣義地理解為有助于編碼可溶性HMG-CoA還原酶的基因轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。啟動子可位于基因附近,可位于同一鏈上并且在上游。上游是指其定位于朝向編碼可溶性HMG-CoA還原酶的有義鏈的5'區(qū)域。啟動子可以是同源啟動子或異源啟動子。最優(yōu)選地,使用在實(shí)施例中示例性示出的啟動子。
      [0062]術(shù)語“表達(dá)”可最廣義地理解為將遺傳信息轉(zhuǎn)換成多肽鏈。
      [0063]術(shù)語“組成型啟動子”可最廣義地理解為普遍未受調(diào)節(jié)的啟動子,其允許連續(xù)轉(zhuǎn)錄其相關(guān)的基因。術(shù)語“強(qiáng)組成型啟動子”是指具有高轉(zhuǎn)錄速率的啟動子。
      [0064]另外,在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,編碼留醇酰基轉(zhuǎn)移酶的一個或更多個基因是AREl和/或ARE2,優(yōu)選AREl和ARE2都基因缺陷或缺失。
      [0065]另外地或可替代地 ,對留醇?;サ男纬捎杏绊懙钠渌蛞部扇毕莼蛉笔?。
      [0066]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞的萜烯生產(chǎn)力,優(yōu)選三萜生產(chǎn)力,特別是角鯊烯生產(chǎn)力與以下細(xì)胞相比至少相當(dāng),優(yōu)選增加:相應(yīng)的野生型細(xì)胞和/或至少為組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型,優(yōu)選組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型,更優(yōu)選組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞。
      [0067]術(shù)語“萜烯”可最廣義地理解為由異戊二烯衍生的任何分子結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地,本發(fā)明的萜烯是包含至少兩個異戊二烯單位的萜烯,更優(yōu)選包含三個異戊二烯單位的萜烯,更優(yōu)選包含四個異戊二烯單位的萜烯,更優(yōu)選包含五個異戊二烯單位的萜烯,更優(yōu)選包含六個異戊二烯單位的萜烯,特別地,萜烯是三萜。
      [0068]優(yōu)選地,所述萜烯是來源于甲羥戊酸途徑的萜烯。這些萜烯包括但不限于角鯊烯、胡蘿卜素(例如,a -胡蘿卜素、P -胡蘿卜素、Y -胡蘿卜素、S -胡蘿卜素、e-胡蘿卜素、胡蘿卜素)、類胡蘿卜素、視黃酸酯(retinoate)、視黃酸絡(luò)合物、視黃酯、視黃醛(全-反-視黃醛、11-順-視黃醛)、視黃醇(維生素A、全-反-視黃醇、11-順-視黃醇)、法呢烯、法呢醇、香葉烯、香葉醇、異戊烯、醌醇(例如,葉綠醌醇、質(zhì)體醌醇、泛醌醇、甲基萘醌醇)、植烯(phytene)、植烯醇(phytenol)、香葉基香葉烯、香葉基香葉醇、葉黃素(例如,紫黃質(zhì)、玉米黃質(zhì))、異戍醇(isopentol)、朽1檬烯、朽1檬
      醇(Iimonol)、菔烯、菔烯醇(pinol)、保幼激素 II1、^--異戍烯(undecaprene)、^--
      異戍烯醇(undecaprenol)、^--異戍烯糖(undecaprenyl sugar)、貝殼杉烯、貝殼杉
      醇(kaurenol)、植物抗毒素、甜椒醇(capsidiol)、愈創(chuàng)木奧(guaiaazulene)、赤霉素(giberillin)、橡膠、生育酹(tocopmerol)、葉綠素、醌(例如,葉綠醌、質(zhì)體醌、泛醌、甲基萘醌)、多職醇、多職基糖(dolechyl sugar)、前植物烯(prephytoene)、八氫番爺紅素、八氫番爺紅素醇(phytoenol)、六氫番爺紅素、六氫番爺紅素醇(phytofluenol)、鏈孢紅素、番爺紅素(Iycopene)、番爺紅素醇(Iycopenol)、番爺紅素(Iycoprene)、和番爺紅素醇(Iycopreno I)、咖啡醇、咖啡豆醇、松柏烯、松柏醇(cambreno I)、紫衫烯、紫杉醇(paclitaxel、taxol)、二倍半職、環(huán)阿屯醇、天然橡膠或古塔波膠。
      [0069]萜烯可包含或不包含一個或更多個雜原子,優(yōu)選氧和/或氮。應(yīng)理解,包含一個或更多個羥基的萜烯也可與以下物質(zhì)酯化:例如磷酸、焦磷酸、一個或更多個脂肪酸、一個或更多個氨基酸、一個或更多個多肽、和/或一個或更多個短肽。另外,包含一個或更多個氨基的萜烯可與以下物質(zhì)酰胺化:例如磷酸、焦磷酸、一個或更多個脂肪酸、一個或更多個氨基酸、一個或更多個多肽、和/或一個或更多個短肽。另外,包含一個或更多個羧基的萜烯可與以下物質(zhì)酰胺化:例如一個或更多個氨基酸、一個或更多個多肽、和/或一個或更多個短肽;和/或可與以下物質(zhì)酯化:例如一個或更多個輔酶(例如,輔酶A (CoA))、一個或更多個糖、一個或更多個氨基酸、一個或更多個多肽、和/或一個或更多個短肽。優(yōu)選地,萜烯是未綴合的或者與磷酸、焦磷酸和/或CoA酯化。更優(yōu)選地,萜烯是未綴合的。最優(yōu)選的,萜烯是實(shí)施例中示例性示出的角鯊烯。
      [0070]術(shù)語“萜烯生產(chǎn)力”可理解為酵母細(xì)胞的任何萜烯的生產(chǎn)力。優(yōu)選地,萜烯生產(chǎn)力是指甲羥戊酸途徑的萜烯生產(chǎn)力,更優(yōu)選角鯊烯生產(chǎn)力。
      [0071]在整個發(fā)明中,術(shù)語“生產(chǎn)力”可最廣義地理解為本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生特定分子的能力。生產(chǎn)力可通過特定時間段內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的所述分子的量來量化。因此,生產(chǎn)力可理解為特定分子隨時間的產(chǎn)生。優(yōu)選地,一批細(xì)胞的生產(chǎn)力可如下量化:每體積培養(yǎng)液中特定分子的質(zhì)量,每個細(xì)胞中所述分子的質(zhì)量`、或每細(xì)胞干質(zhì)量的重量百分比(w/w)。如果將兩種菌株(例如本發(fā)明的菌株和相應(yīng)的野生型菌株)彼此比較,那么相對生產(chǎn)力用萜烯生產(chǎn)的每重量百分比增加或降低來量化。
      [0072]本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語“野生型”是指同一物種未經(jīng)基因修飾的酵母細(xì)胞。野生型細(xì)胞可優(yōu)選地與本發(fā)明的酵母細(xì)胞來源于相同菌株。更優(yōu)選地,野生型細(xì)胞不包含編碼可溶性HMG-CoA還原酶的功能基因和/或所述野生型細(xì)胞包含功能AREl基因和/或功能ARE2基因。野生型細(xì)胞可以是天然存在的細(xì)胞和/或可由細(xì)胞庫(例如,美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))得到。
      [0073]術(shù)語“相應(yīng)的野生型細(xì)胞”是指與本發(fā)明的細(xì)胞來源于相同基因來源的野生型細(xì)胞,但是其中未發(fā)生一個或更多個基因突變。相應(yīng)的野生型細(xì)胞與本發(fā)明的酵母細(xì)胞為相同物種和來源于相同菌株。另外,相應(yīng)的野生型細(xì)胞可優(yōu)選地不具有AREl和/或ARE2基因、特別是AREl和ARE2基因的缺失或缺陷。優(yōu)選地,野生型細(xì)胞是酵母細(xì)胞,更優(yōu)選酵母屬細(xì)胞,更優(yōu)選釀酒酵母細(xì)胞,更優(yōu)選釀酒酵母細(xì)胞的商購菌株,更優(yōu)選釀酒酵母細(xì)胞菌株AH22或S288c。最優(yōu)選地,野生型細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞菌株AH22。
      [0074]術(shù)語“相當(dāng)(equivalent) ”是指與上文定義的相應(yīng)的野生型細(xì)胞和/或相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞相比萜烯生產(chǎn)力相同,其具有+ / -20%誤差范圍,更優(yōu)選+ / -10%誤差范圍,更優(yōu)選小于10%誤差范圍。
      [0075]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞產(chǎn)生減少量的留醇酰基酯,優(yōu)選地,其中所述細(xì)胞的留醇?;サ纳a(chǎn)缺陷。
      [0076]本文使用的術(shù)語“減少量”是指生產(chǎn)較少量的留醇?;ァp少量的生產(chǎn)可指甾醇?;サ纳a(chǎn)力是相應(yīng)野生型細(xì)胞所生產(chǎn)量的少于100 %、少于50 %、少于40 %、少于30%、少于20%、少于10%、少于8%、少于6%、少于5%、少于4%、少于3%、少于2%、或甚至少于I %。例如,相應(yīng)的野生型細(xì)胞可以是AH22菌株的酵母細(xì)胞或S288c菌株的酵母細(xì)胞,特別是AH22菌株的酵母細(xì)胞。
      [0077]術(shù)語“留醇?;サ纳a(chǎn)缺陷”可理解為留醇酯的形成極大減少。應(yīng)理解在生物系統(tǒng)中,始終存在基礎(chǔ)水平的非特異性活性。因此,本文中使用的術(shù)語“極大減少”可指濃度是相應(yīng)野生型細(xì)胞中濃度的少于5%、優(yōu)選少于I %、更優(yōu)選少于0.5%、更優(yōu)選少于0.1 %。
      [0078]本發(fā)明的第二個方面涉及產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)胞的方法,所述方法包括:
      [0079]a)將編碼可溶性HMG-CoA還原酶的基因插入到酵母細(xì)胞中;
      [0080]b)選擇包含編碼所述可溶性HMG-CoA還原酶的基因的細(xì)胞;
      [0081]c)使所述細(xì)胞中一個或更多個編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因缺失或突變;
      [0082] d)將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化成至少針對以下的原養(yǎng)型細(xì)胞:組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶,優(yōu)選組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶,更優(yōu)選組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶,轉(zhuǎn)化如下所述實(shí)施:
      [0083](i)插入編碼一種或更多種產(chǎn)生組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的基因盒,和/或
      [0084](ii)回復(fù)誘變編碼一個或更多個產(chǎn)生組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的缺陷基因,
      [0085]特別地,通過回復(fù)誘變編碼產(chǎn)生組氨酸的酶的缺陷基因,和通過插入編碼產(chǎn)生亮氨酸和尿嘧啶的酶的基因盒;
      [0086]e)選擇組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的原養(yǎng)型細(xì)胞,優(yōu)選至少是組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶的原養(yǎng)型細(xì)胞,特別是組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的原養(yǎng)型細(xì)胞;和任選地
      [0087]f)培養(yǎng)步驟e)的細(xì)胞;和任選地
      [0088]g)分離和穩(wěn)定步驟e)或f)的細(xì)胞。
      [0089]以上詳細(xì)說明了酵母細(xì)胞及其功能特征。應(yīng)理解本文中定義的特征也適合于由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
      [0090]本文中使用的術(shù)語“產(chǎn)生細(xì)胞”可廣義理解為提供本發(fā)明的細(xì)胞。應(yīng)理解母細(xì)胞可是任意酵母細(xì)胞。優(yōu)選地,所述細(xì)胞是野生型菌株細(xì)胞。例如,如上文詳細(xì)說明的,野生型菌株可以是AH22菌株或S288c菌株,優(yōu)選AH22菌株。最優(yōu)選地,如實(shí)施例中示例性示出的產(chǎn)生細(xì)胞。
      [0091]術(shù)語“將基因插入......”是任何將基因整合到酵母細(xì)胞中的方法。基因可編
      碼在任意遺傳信息的載體上,例如DNA(雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA))、RNA(單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈RNA(dsRNA))、DNA類似物如肽核酸(PNA)、嗎啉基、甘油核酸(GNA)、蘇阿糖核酸(TNA)或甲基化DNA或其雜合物。優(yōu)選地,基因編碼在DNA上,更優(yōu)選雙鏈DNA,特別是環(huán)狀雙鏈DNA鏈,特別是質(zhì)粒。質(zhì)粒可以是本領(lǐng)域中已知的任何質(zhì)粒。例如,質(zhì)粒可以是YEpH2或pUC質(zhì)粒。最優(yōu)選地,可如實(shí)施例示例性示出的插入一個或更多個基因。[0092]可將遺傳信息作為載體插入到細(xì)胞中。如上文詳細(xì)說明的,載體可以是本領(lǐng)域中已知的任何載體,例如線性載體、環(huán)狀載體、病毒載體或細(xì)菌載體。優(yōu)選地,載體包含線性DNA或環(huán)狀DNA,更優(yōu)選環(huán)狀DNA,特別是質(zhì)粒??赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法將載體插入到細(xì)胞中,并且使用時可聯(lián)合或不聯(lián)合轉(zhuǎn)染劑(例如,聚乙烯亞胺(PEI)、Fugene、LT-1, JetPE1、transfectamine、月旨質(zhì)體(Iipofectamine)、UptiFectin、PromoFcctin、GenePORTER、Hilymax、碳納米纖維、碳納米管、細(xì)胞滲透肽(CPP)、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)、脂質(zhì)體、DEAE葡聚糖、樹狀聚合物)、聯(lián)合或不聯(lián)合電穿孔、聯(lián)合或不聯(lián)合基因槍、聯(lián)合或不聯(lián)合光學(xué)轉(zhuǎn)染、聯(lián)合或不聯(lián)合基因電轉(zhuǎn)移、聯(lián)合或不聯(lián)合穿刺轉(zhuǎn)染、聯(lián)合或不聯(lián)合磁轉(zhuǎn)染、和/或聯(lián)合或不聯(lián)合磁鐵輔助的轉(zhuǎn)染。優(yōu)選地,所述載體是環(huán)狀DNA載體,更優(yōu)選地,所述載體是質(zhì)粒。質(zhì)??梢允潜绢I(lǐng)域中已知的任何質(zhì)粒,例如YEpH2或pUC19質(zhì)粒。但是,應(yīng)理解也可使用所有其他載體。
      [0093]插入的基因在細(xì)胞中可以是活躍的或不活躍的(passive)。優(yōu)選地,插入的基因可在細(xì)胞中活躍轉(zhuǎn)錄和表達(dá)為核外質(zhì)粒、核內(nèi)質(zhì)粒、核外線性載體、核內(nèi)線性載體或可插入到酵母細(xì)胞的基因組中。如本文使用的,術(shù)語“基因組”是指酵母細(xì)胞的整個遺傳信息。優(yōu)選地,編碼可溶性HMG-CoA還原酶的基因插入在所述酵母細(xì)胞的基因組中。任選地,HMG-CoA還原酶可代替其他基因,例如尿嘧啶原養(yǎng)型基因,例如ura3基因。然后,所得細(xì)胞是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型。
      [0094]優(yōu)選地,編碼可溶性HMG-CoA還原酶的所述基因在酵母細(xì)胞中表達(dá),因此,由所述細(xì)胞產(chǎn)生可溶性HMG-CoA還原酶。
      [0095]在整個發(fā)明中,術(shù)語“選擇細(xì)胞”是指使細(xì)胞群的期望部分富集。最優(yōu)選地,如實(shí)施例中示例性示出地選擇細(xì)胞。
      [0096]在細(xì)胞包含編碼所述可溶性HMG-CoA還原酶的基因的情況下,使細(xì)胞群中包含所述基因的細(xì)胞富集??稍趹腋∨囵B(yǎng)物中或固體物質(zhì)的培養(yǎng)平板(例如,瓊脂平板)上選擇細(xì)胞。可如下選擇細(xì)胞:稀釋細(xì)胞`并且用其劃線以產(chǎn)生僅來源于單細(xì)胞的菌落。優(yōu)選地,隨后測試這些菌落中編碼所述可溶性HMG-CoA還原酶的基因的存在?;蛘?,可通過確定萜烯的生產(chǎn)力從功能上測試細(xì)胞。另外地或可替換地,也可通過使細(xì)胞面臨選擇壓力來選擇細(xì)胞。該選擇壓力可以是僅期望的細(xì)胞群有抗性的抗生素或可以是偏向期望的細(xì)胞群的生長條件。在選擇包含編碼所述可溶性HMG-CoA還原酶基因的細(xì)胞的情況下,可將細(xì)胞培養(yǎng)在偏向包含所述基因的細(xì)胞的培養(yǎng)基上或其中。例如,如果編碼所述HMG-CoA還原酶的基因整合在酵母基因組中替換了尿嘧啶原養(yǎng)型基因,那么細(xì)胞培養(yǎng)基可包含5-F0A(5-氟乳清酸)(Boeke等,1987),其促進(jìn)選擇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷酵母。
      [0097]本文使用的術(shù)語“使基因缺失”應(yīng)理解為移除基因或所述基因的一個或更多個部分。然后,基因不轉(zhuǎn)錄并且沒有基因產(chǎn)物,因此不產(chǎn)生相應(yīng)的多肽。應(yīng)理解,未必整個基因都從基因組中移除。優(yōu)選地,使超過基因的50%、更優(yōu)選超過基因的60%、更優(yōu)選超過基因的70 %、更優(yōu)選超過基因的80 %、更優(yōu)選超過基因的90 %、更優(yōu)選超過基因的95 %、最優(yōu)選使基因的100%缺失。缺失可以是末端缺失或中間缺失。可由實(shí)驗(yàn)者或自然引起??赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法使基因缺失。例如,通過交換或使用ere重組酶程序使基因缺失(Guldener等,1996)。最優(yōu)選地,可如實(shí)施例中示例性示出地使一個或更多個基因缺失。
      [0098]本文中使用的術(shù)語“使基因突變”可廣義理解為改變所述基因的核酸序列。所得突變可以是單核苷酸替換(點(diǎn)突變)或可以是移碼突變。優(yōu)選地,以下述方式使基因突變:不產(chǎn)生基因產(chǎn)物(即,多肽)或者多肽的活性比野生型多肽的活性低??赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法(輻射或化學(xué)劑)或定點(diǎn)誘變引起突變。突變也可因自然發(fā)生突變速率自發(fā)產(chǎn)生。突變可引起移碼突變或點(diǎn)(單核苷酸)突變。例如,突變可通過實(shí)驗(yàn)者或自然引起的非特異誘變得到。最優(yōu)選地,可如實(shí)施例中示例性示出地使一個或更多個基因突變。
      [0099] 突變可由以下因素引起:例如輻射(紫外線(UV)輻射、X-線輻射、放射性/核輻射(例如,a -、P -或Y-輻射)或宇宙輻射)或一種或更多種誘變劑(例如,針對核苷堿基的烷化劑(例如,氮芥(例如,環(huán)磷酰胺、甲二氯二乙胺或雙氯乙基甲胺(mustine) (HN2)、烏拉莫司汀或尿嘧啶氮芥、美法侖、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺)、亞硝基脲(例如,卡莫司汀、洛莫司汀、鏈脲佐菌素)、烷基磺酸鹽(例如,白消安)、噻替派及其類似物、鉬衍生物(例如,順鉬、卡鉬、奈達(dá)鉬、奧沙利鉬、賽特鉬、四硝酸三鉬)、甲基芐肼、六甲蜜胺、黃曲霉毒素及其代謝產(chǎn)物和衍生物、亞硝酸鹽、苯胺及其代謝產(chǎn)物和衍生物、苯及其代謝產(chǎn)物和衍生物、多環(huán)芳香烴及其代謝產(chǎn)物和衍生物))、亞硝胺、砷、石棉、鈹及其絡(luò)合物、環(huán)氧乙烷、六價鉻(VI)化合物、氡、氯乙烯、吸煙等)。突變也可以是自發(fā)的。
      [0100]優(yōu)選地,甾醇酰基轉(zhuǎn)移酶是AREI和/或ARE2。優(yōu)選地,AREI和/或ARE2基因缺失,更優(yōu)選地,AREl和ARE2基因缺失。
      [0101]術(shù)語“轉(zhuǎn)化”可最廣義地理解為細(xì)胞的遺傳性質(zhì)的改變??蓪⒕幋a一種或更多種產(chǎn)生組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的一個或更多個基因盒插入細(xì)胞中或者回復(fù)誘變編碼一個或更多個產(chǎn)生組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的缺陷基因。最優(yōu)選地,如實(shí)施例中示例性示出地轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
      [0102]本文使用的術(shù)語“基因盒”可最廣義地理解為編碼單一生物學(xué)功能的一個或更多個基因的模塊化DNA序列??梢灾窪NA的可操作片段,其攜帶一個或更多個感興趣的基因,能夠表達(dá)一個或更多個所述基因,并且還可包括一個或更多個限制性位點(diǎn)組。優(yōu)選地,所述一個或更多個基因位于兩個或更多個限制性位點(diǎn)之間。任選地,基因盒可從一個DNA序列(通常在載體上)轉(zhuǎn)移到基因組并且代替本發(fā)明的細(xì)胞的基因組的DNA序列。最優(yōu)選地,可如實(shí)施例中示例性示出地使基因盒缺失。
      [0103]在本發(fā)明上下文中,術(shù)語“回復(fù)誘變”是指在恢復(fù)之前的基因型或相應(yīng)野生型細(xì)胞在特定表型方面的初始表型的突變。然后,優(yōu)選地,修復(fù)缺陷基因。例如,組氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞中用于編碼產(chǎn)生組氨酸的酶的缺陷基因回復(fù)突變可產(chǎn)生組氨酸原養(yǎng)型細(xì)胞。最優(yōu)選地,可如實(shí)施例中示例性示出的進(jìn)行回復(fù)誘變。
      [0104]可通過插入基因盒或通過回復(fù)誘變來修復(fù)用于編碼產(chǎn)生組氨酸的酶的缺陷基因。優(yōu)選地,通過回復(fù)誘變,更優(yōu)選地,通過HIS4基因回復(fù)突變來修復(fù)基因。
      [0105]可通過插入基因盒或通過回復(fù)誘變來修復(fù)用于編碼產(chǎn)生亮氨酸的酶的缺陷基因。優(yōu)選地,通過插入包含完整形式的所述基因的基因盒,更優(yōu)選地,通過插入編碼LEU2基因的基因盒來修復(fù)基因。
      [0106]可通過插入基因盒或通過回復(fù)誘變來修復(fù)用于編碼產(chǎn)生尿嘧啶的酶的缺陷基因。優(yōu)選地,通過插入包含完整形式的所述基因的基因盒,更優(yōu)選地,通過插入編碼URA3基因的基因盒來修復(fù)基因。
      [0107]在組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶原養(yǎng)型的情況下,使群體中原養(yǎng)型細(xì)胞富集??稍趹腋∨囵B(yǎng)物中或固體物質(zhì)的培養(yǎng)平板(例如,瓊脂平板)上選擇細(xì)胞??扇缦逻x擇細(xì)胞:稀釋細(xì)胞并且用其劃線產(chǎn)生僅來源于單細(xì)胞的菌落。隨后可測試這些菌落中各基因的存在或通過其表型性質(zhì)進(jìn)行選擇??商鎿Q地或另外地,也可通過使細(xì)胞面臨選擇壓力來選擇細(xì)胞。該選擇壓力可以是僅期望的細(xì)胞群有抗性的抗生素或可以是偏向期望的細(xì)胞群的生長條件。優(yōu)選地,培養(yǎng)基缺少組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶,更優(yōu)選地,所述培養(yǎng)基缺少組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶,特別地,所述培養(yǎng)基缺少組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶。本文使用的術(shù)語“缺少”是指所述化合物不存在或僅微量存在的濃度。
      [0108]術(shù)語“培養(yǎng)細(xì)胞”可最廣義地理解為保持細(xì)胞存活??蓪⒓?xì)胞培養(yǎng)在適合酵母細(xì)胞的條件下。例如,可將酵母細(xì)胞培養(yǎng)在懸浮培養(yǎng)物中或平板如瓊脂平板上。懸浮培養(yǎng)基或瓊脂可包含適合酵母細(xì)胞的營養(yǎng),例如,一種或更多種氨基酸、一種或更多種肽、一種或更多種脂質(zhì)、一種或更多種維生素、微量元素和/或鹽、一種或更多種生長因子、和一種或更多種緩沖劑??蓪⒓?xì)胞培養(yǎng)在有氧或無氧條件下。溫度可是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適合細(xì)胞的范圍。例如對于酵母,溫度通常為18°C至40°C,優(yōu)選20°C至37°C,更優(yōu)選20°C至30°C,更優(yōu)選25°C至30°C,最優(yōu)選30°C。培養(yǎng)基的pH可以為適合酵母細(xì)胞的范圍。對于大部分酵母細(xì)胞,合適的pH可以為中性或微堿性pH。最優(yōu)選地,如實(shí)施例中示例性示出地培養(yǎng)所述細(xì)胞。
      [0109]優(yōu)選地,培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞增殖。增殖可由酵母細(xì)胞的細(xì)胞分裂、酵母細(xì)胞的出芽、形成孢子、形成一種或更多種配子和/或有性生殖完成。更優(yōu)選地,酵母細(xì)胞的增殖是細(xì)胞分裂或出芽。
      [0110]細(xì)胞的培養(yǎng)可包括是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的培養(yǎng),即,多個培養(yǎng)皿的培養(yǎng)或數(shù)毫升至幾升培養(yǎng)液的懸浮培養(yǎng)物。細(xì)胞的培養(yǎng)還可包括半工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng),即,數(shù)升培養(yǎng)液的懸浮培養(yǎng)物;和工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng),即,數(shù)升或甚至數(shù)立方米培養(yǎng)液的懸浮培養(yǎng)物。本文使用的術(shù)語“培養(yǎng)液”包括細(xì)胞和培養(yǎng)基。懸浮培養(yǎng)物可任選地攪拌或震蕩。懸浮培養(yǎng)物可任選地充氣、通氣和/或脫氣。可在合適的壓力下培養(yǎng)細(xì)胞,壓力可以是大氣壓力、超壓或低壓。通常,可在大氣壓力或輕微超壓下培養(yǎng)細(xì)胞。
      [0111]對于萜烯生產(chǎn),細(xì)胞可培養(yǎng)任意時間,優(yōu)選至少30分鐘、至少2小時、至少10小時、至少24小時、至少48小時、至少72小時或甚至長達(dá)一周、長達(dá)一個月或長達(dá)數(shù)月。細(xì)胞可培養(yǎng)數(shù)代。細(xì)胞可培養(yǎng)超過I代、超過5代、超過10代、超過15代、超過20代、超過25代、超過30代、超過35代、超過50代、超過100代或甚至更久。
      [0112]在本發(fā)明上下文中使用的,在指代細(xì)胞時,術(shù)語“分離”最廣義地為濃縮本發(fā)明的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以被收獲。可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法分離細(xì)胞,例如離心、過濾、錯流過濾、色譜(例如,親和色譜、尺寸排阻色譜、離子交換色譜),或者摩擦或擦拭培養(yǎng)板的固體表面。或者,由于包含所述細(xì)胞的容器放出氣體,細(xì)胞可隨時間下沉(decent)或漂浮。或者,可不分離細(xì)胞,而將細(xì)胞和培養(yǎng)基一起進(jìn)一步處理。
      [0113]可進(jìn)一步用合適的緩沖液或培養(yǎng)基洗滌分離的細(xì)胞。優(yōu)選地,可通過離心、過濾、錯流過濾或色譜(例如,親和色譜、尺寸排阻色譜、離子交換色譜)洗滌細(xì)胞。可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法分析分離的細(xì)胞。可將分離的細(xì)胞破碎、在培養(yǎng)板上劃線、接種在懸浮培養(yǎng)基中或可進(jìn)行穩(wěn)定。最優(yōu)選地,如實(shí)施例中示例性示出地分離所述細(xì)胞。
      [0114]如本發(fā)明上下文中使用的,在指代細(xì)胞時,術(shù)語“穩(wěn)定”是指任何保存細(xì)胞的方法。優(yōu)選地,如下所述穩(wěn)定細(xì)胞:將細(xì)胞儲存比較長的時間,并且隨后可用于形成活細(xì)胞培養(yǎng)物。
      [0115]可通過冷凍、冷凍干燥或干燥來穩(wěn)定細(xì)胞。優(yōu)選地,冷凍細(xì)胞。可將細(xì)胞冷凍在-20°C、-80°C、在干冰上或液氮中。優(yōu)選地,可將細(xì)胞冷凍在適合冷凍酵母細(xì)胞的培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基可包含甘油。優(yōu)選地,可在水緩沖液或水中冷凍細(xì)胞,其補(bǔ)充有超過2% (v /V)、超過 5% (V / V)、超過 10% (V / V)、超過 20% (V / V)、超過 30% (v / V)、超過 40%(v / V)、或者超過50% (v / v)的甘油。例如,可在水中包含50%甘油的培養(yǎng)基中冷凍酵母細(xì)胞。在整個發(fā)明中使用的縮寫V / V是指每體積的體積數(shù)??蓪⒗鋬鲈诟视腿芤褐械囊慌鋬黾?xì)胞稱作甘油保存物(glycerol stock)。或者,可干燥或冷凍干燥酵母細(xì)胞,優(yōu)選地,通過添加乳化劑如檸檬酸等。可將干燥或凍干的細(xì)胞儲存在任意溫度下的干燥條件下,例如,室溫、環(huán)境溫度、-4°C、-20°C、_80°C、干冰上或液氮中。最優(yōu)選地,如實(shí)施例中示例性示出的穩(wěn)定細(xì)胞。
      [0116]可將穩(wěn)定的細(xì)胞穩(wěn)定至少超過I天,優(yōu)選超過5天,更優(yōu)選超過I周,更優(yōu)選超過I個月,更優(yōu)選超過I年。如上文所述,“穩(wěn)定”是指細(xì)胞在儲存時間之后可用于形成活細(xì)胞培養(yǎng)物。
      [0117]或者,不分離細(xì)胞,而是將細(xì)胞和培養(yǎng)基一起進(jìn)一步處理。
      [0118]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞是酵母細(xì)胞。優(yōu)選地,其中所述細(xì)胞是酵母屬細(xì)胞,更優(yōu)選地,其中所述細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞,特別地,其中所述細(xì)胞來源于釀酒酵母細(xì)胞菌株AH22。
      [0119]本發(fā)明的優(yōu)選細(xì)胞的特征在上文有詳細(xì)表征。
      [0120]在一個優(yōu)選實(shí)施方 案中,將編碼可溶性HMG-CoA還原酶的基因插入到酵母細(xì)胞中的步驟包括:插入編碼可溶性HMG-CoA還原酶的載體,其中在所述細(xì)胞中有活性的啟動子、優(yōu)選組成型啟動子、特別是強(qiáng)組成型啟動子的控制下表達(dá)所述可溶性HMG-CoA還原酶。
      [0121]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,編碼留醇酰基轉(zhuǎn)移酶的一個或更多個基因是AREl和/或ARE2,優(yōu)選地,其中AREl和ARE2基因都缺陷或缺失。
      [0122]本發(fā)明的第三個方面涉及本發(fā)明的細(xì)胞的用途,其用于生產(chǎn)一種或更多種萜烯,優(yōu)選用于生產(chǎn)一種或更多種三萜,特別是用于生產(chǎn)角鯊烯。
      [0123]本文中所使用的術(shù)語“生產(chǎn)”可指用于獲得萜烯的任何方法。生產(chǎn)可包括任何規(guī)模的生產(chǎn)。生產(chǎn)可包括是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生產(chǎn),即數(shù)微克、數(shù)毫克或數(shù)克萜烯的生產(chǎn)。生產(chǎn)可包括半工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn),即數(shù)克或數(shù)千克萜烯的生產(chǎn)。生產(chǎn)還可包括工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn),即數(shù)千克或數(shù)噸萜烯的生產(chǎn)。生產(chǎn)還可包括用于純化或保存萜烯的一種或更多種其他工藝步驟。
      [0124]因?yàn)榇蟛糠州葡┒际歉叨仁杷模暂葡┩ǔT诩?xì)胞中積累。第一步,可通過本領(lǐng)域中的任何方法,例如離心、過濾、錯流過濾、色譜(例如,親和色譜、尺寸排阻色譜、離子交換色譜),或者摩擦或擦拭固體表面或培養(yǎng)板收獲細(xì)胞。然后,可借助任何方法,優(yōu)選離心、過濾或錯流過濾的細(xì)胞團(tuán)塊?;蛘?,細(xì)胞可因包含所述細(xì)胞的容器的放氣而隨時間沉淀或漂浮。任選地,可通過本領(lǐng)域中的任何方法洗滌細(xì)胞,例如離心、過濾、或錯流過濾??筛稍锘虿桓稍锛?xì)胞團(tuán)塊??赏ㄟ^本領(lǐng)域中任何方法裂解細(xì)胞。可借助機(jī)械力(例如,勻漿(例如,(Potter或Downs勻漿機(jī)),借助細(xì)胞壓力如弗氏壓碎器),借助洗滌劑、超聲處理、溶解性噬菌體裂解細(xì)胞。任選地,可通過溶劑萃取來萃取(例如,利用有機(jī)溶劑)萜烯。任選地,可隨后將有機(jī)溶劑蒸發(fā)??蛇x擇地或另外地,可根據(jù)萜烯的特定化學(xué)性質(zhì)、通過色譜方法(例如,相色譜、離子交換色譜、反向色譜、尺寸排阻色譜、高效液相色譜(HPLC)、超高壓液相色譜(UPLC)、快速蛋白質(zhì)色譜(FPLC))、通過電泳、毛細(xì)管電泳(CE)或通過蒸餾分離職烯。
      [0125]本發(fā)明的另一方面涉及用于生產(chǎn)一種或更多種萜烯、優(yōu)選三萜、更優(yōu)選鯊烯的方法,所述方法包括:
      [0126]a)將本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中;和
      [0127]b)從步驟(a)的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離一種或更多種萜烯,優(yōu)選一種或更多種二職,更特別是角S烯。
      [0128]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解,為了有效生產(chǎn)萜烯,細(xì)胞必須培養(yǎng)至少數(shù)小時,優(yōu)選至少12小時,更優(yōu)選至少24小時,更優(yōu)選至少48小時或至少72小時或甚至更久。細(xì)胞可培養(yǎng)數(shù)代。細(xì)胞可培養(yǎng)超過5代、超過10代、超過15代、超過20代、超過25代、超過30代、超過35代、超過50代、超過100代或甚至更久??蓴嚢杌蛘駬u懸浮培養(yǎng)物。
      [0129]本文使用的術(shù)語“分離一種或更多種萜烯”可最廣義地理解為從培養(yǎng)液中純化萜烯。萜烯可積累在細(xì)胞中或可由細(xì)胞分泌從而存在于培養(yǎng)基中。
      [0130]可如上文描述收獲并任選地洗滌細(xì)胞。隨后,可通過本領(lǐng)域中已知的以及上文描述的任何方法裂解細(xì)胞。任選地,可通過溶劑萃取(例如,利用有機(jī)溶劑)萃取萜烯。任選地,可隨后將有機(jī)溶劑蒸發(fā)。可替換地或另外地,可根據(jù)萜烯的特定化學(xué)性質(zhì)、通過色譜方法(例如,相色譜、離子交換色譜、反向色譜、尺寸排阻色譜、高效液相色譜(HPLC)、超高壓液相色譜(UPLC)、快速蛋白質(zhì)色譜(FPLC))、通過電泳、毛細(xì)管電泳(CE)或通過蒸餾分離萜烯。
      [0131]本發(fā)明的另一個方面涉及生產(chǎn)藥物或化妝品組合物、潤滑劑或變壓器油,特別是生產(chǎn)疫苗組合物的方法,所述方法包括:
      [0132]a)根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)一種或更多種萜烯;和
      [0133]b)將所述萜烯混合到所述藥物或化妝品組合物、所述潤滑劑或所述變壓器油,特別是所述疫苗組合物。
      [0134]其中任選地對所述一種或更多種萜烯進(jìn)一步實(shí)施一個或更多個氫化步驟,其中所述一種或更多種萜烯優(yōu)選地是氫化三萜,特別是角鯊烯。
      [0135]術(shù)語“混合”可廣義理解將萜烯添加到感興趣的組合物中。
      [0136]藥物組合物可指包含由本發(fā)明的細(xì)胞得到的萜烯的任何藥物組合物。在藥物組合物中,萜烯可優(yōu)選地用作佐劑,用作皮膚潤濕劑,用作粘液溶解劑,用作激素,用作芳香劑,用作潤滑劑,用作抗微生物劑,用作抗炎藥或用作抗氧化劑。
      [0137]化妝品組合物可指包含由本發(fā)明的細(xì)胞得到的萜烯的任何化妝品組合物。在化妝品組合物中,萜烯可優(yōu)選地用作皮膚潤濕劑,用作芳香劑,或用作抗氧化劑。萜烯也可用作食品添加劑。另外,萜烯可用作信息素(例如用于害蟲防治的昆蟲信息素),用作激素(例如,例如用于害蟲防治的昆蟲信息素),用作潤滑劑,用作電絕緣物,用作變壓器油或變壓器油添加劑,以及用作化學(xué)、制藥和化妝品工業(yè)的原材料。
      [0138]優(yōu)選地,由本發(fā)明的方法得到的萜烯是角鯊烯。角鯊烯可優(yōu)選地用作藥物和化妝品組合物中的添加劑、用作皮膚潤濕劑、用作潤滑劑、用作變壓器油或變壓器油添加劑以及用作化學(xué)工業(yè)中的原料化學(xué)物質(zhì)。更優(yōu)選地,由本發(fā)明的方法得到的角鯊烯可用在藥物和化妝品組合物中,特別是制備可用作疫苗佐劑的乳劑。
      [0139]萜烯可用于生產(chǎn)一種或更多種氫化萜烯,優(yōu)選一種或更多種氫化三萜。特別地,角鯊烯可用于生產(chǎn)角鯊烯。對于該目的,將對角鯊烯進(jìn)行本領(lǐng)域中已知的一個或更多個氫化步驟。
      [0140] 本文使用的術(shù)語“氫化步驟”是指通過添加氫使一個或更多個雙鍵或三鍵,優(yōu)選一個或更多個雙鍵,特別是萜烯的碳原子之間的一個或更多個雙鍵氫化。例如,可如下使萜烯氫化:催化轉(zhuǎn)化器(例如,鉬基、鈀基、銠基、鎳基、銥基和/或釘基催化劑),用氫吹氣或含氫氣體混合物的吹氣,與還原劑如硼氫化鈉反應(yīng),酶促處理(例如,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和/或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)轉(zhuǎn)化酶)或其兩種或更多種的組合。NADH和/或NADPH轉(zhuǎn)化酶也可克隆在本發(fā)明的細(xì)胞的基因組中。優(yōu)選地,在氫化萜烯中,萜烯分子的大部分或甚至全部雙鍵和/或三鍵都被氫化,更優(yōu)選地,萜烯分子的全部雙鍵和/或三鍵都被氫化。優(yōu)選地,氫化萜烯是氫化三萜,更優(yōu)選氫化角鯊烯。最優(yōu)選地,氫化萜烯是角鯊烯。角鯊烯可優(yōu)選地用在化妝品或藥物組合物中,特別是化妝品中。
      [0141]附圖簡述
      [0142]圖1示出了載體pPTHTL的克隆策略。用EcoRl和BamHl從pUC19_tHMGl切下HMGl片段,并且將其整合到用EcoRl和BamHl切割的質(zhì)粒pT2b中。將LEU2基因作為平末端片段進(jìn)行克隆。因此,用XhoI和Sail切割YEpl3,將粘性末端平端化。用NruI打開pPT2b-tHMGl0
      [0143]圖2示出了載體YEpH2的示意圖。pPT2b_tHMGl的表達(dá)盒作為EcoRV / NruI片段連接到用SphI打開并平端化的Y印13中。
      [0144]圖3示出了整合載體YDpUHK3的克隆策略。表達(dá)盒作為YEpH2的EcoRV / NruI片段連接在用StuI切割的YDpU中。將pUCTK23的HindII片段與用SmaI切割的YDpUH2 /12連接。
      [0145]圖4示出了整合在基因座URA3中的tHMGl表達(dá)盒的示意圖(陰影部分)。被EcoRV(A)線性化的載體YDpUHK3整合在染色體URA3基因(B)中。質(zhì)粒整合成單個整體(C)或作為串聯(lián)重復(fù)。經(jīng)過同源重組,全部載體丟失(虛線箭頭)或質(zhì)粒的一部分丟失(連續(xù)線箭頭)。如果表達(dá)盒保留,在URA3基因座中實(shí)現(xiàn)D下表示的情況。
      [0146]圖5示出了用于使菌株AH22tH3ura8中的基因ARE1、ARE2缺失之程序的示意性描述。
      [0147]圖6示出了質(zhì)粒pUG6 (圖6A)和pSH47 (圖6B)的示意性描述。
      [0148]圖7示出了菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2HUL在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵罐(5升)中培養(yǎng)的結(jié)果。圖7A示出了酵母隨時間的生長。描述了發(fā)酵過程中的細(xì)胞干重(CDW)g / L和光密度(OD6cicimiAiL)。圖7B示出了 66小時和72小時后的角鯊烯生產(chǎn)力。角鯊烯生產(chǎn)力描述成發(fā)酵過程中發(fā)酵液的每細(xì)胞干重的百分比和體積生產(chǎn)力g / L。
      [0149]圖8示出了從構(gòu)建的釀酒酵母的突變菌株中萃取全部脂質(zhì)的薄層色譜法。
      實(shí)施例
      [0150]以下實(shí)施例以及附圖旨在說明本發(fā)明描述實(shí)施方案和本文的要求。這些實(shí)施例并未意圖限制本發(fā)明主題的范圍。
      [0151]實(shí)施例1
      [0152]菌株AH22tH3ura8 A are I A are2 的構(gòu)建
      [0153]1.1 基礎(chǔ)菌株 AH22tH3ura8(Polakowski 等,1998)。
      [0154]AH22tH3ura8 以菌株 AH22 (Hinnen 等,1978)為基礎(chǔ),其來源于 S288c (Mortimerand Johnston,1986)。菌株S288c和菌株AH22可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。菌株 S288c 以 ATCC 號 26108 獲自 ATCC。菌株 AH22 以 ATCC 號 38626 獲自 ATCC。
      [0155]AH22的特征如下:
      [0156]基因型:MATaleu2-31eu2-112his4-519canl
      [0157]表型:leu2,his4
      [0158]釀酒酵母的菌株AH22屬于公認(rèn)為安全(生物安全級別I)的微生物組。制備菌株AH22的甘油保存物。
      [0159]通過將tHMGl表達(dá)盒整合到URA3基因座來構(gòu)建菌株AH22tH3ura8 (Polakowski等,1998)。該表達(dá)盒包括截短的組成型版本的ADHl啟動子、截短版本的HMGl基因和TRPl終止子(見下文構(gòu)建詳情)
      [0160]AH22tH3ura8菌株的特征如下:
      [0161]基因型:MATaIeu2-31eu2-112his4-519canlura3::tHMGl`[0162]表型:ura3,leu2, his4
      [0163]1.2將tHMGl表達(dá)盒整合到基因座URA3中(克隆策略和整合)
      [0164]載體pPTHTL的克隆策略
      [0165]使用標(biāo)準(zhǔn)方法,由釀酒酵母菌株S288c的基因組DNA(Mortimer and Johnston,1986)通過PCR擴(kuò)增tHMGl (Basson等,1988)的DNA序列。用于該目的的引物是DNA寡聚物tHMG-5'和tHMG-3'(表1)。將得到的DNA片段(SEQ ID NO:2)引入到用Klenow處理后的克隆載體pUC19 (Yanisch-Perron等,1985)的SmaI位點(diǎn),得到載體pUC19_tHMGl (見圖1)。
      [0166]在分離質(zhì)粒并且用限制酶EcoRl和BamHl限制pUC19_tHMGl后,將得到的片段引入到同樣用EcoRl和BamHl處理了的酵母表達(dá)載體pPT2b (Lang and Looman, 1995)中。所得質(zhì)粒pPT2b-tHMGl在tHMGl編碼區(qū)之間包含截短的ADHl啟動子(Bennetzen and Hall,1982)和 TRPl 終止子(Tschumper and Carbon,1980)。用 XhoI 和 Sail 將LEU2基因從酵母載體YEpl3 (Parent等,1985)切下,將平末端連接到用NruI限制處理的載體pPT2b_tHMGl (包含所謂的中等長度ADHl啟動子、tHMGl基因和TRPl終止子),得到載體pPTHTL(見圖1)。
      [0167]載體YEpH2的克隆策略
      [0168]通過將線性化(SphI)的載體YEpl3與用EcoRV和NruI從載體pPT2b_tHMGl (圖1)切下的tHMGl表達(dá)盒(短形式的ADHl啟動子,在EcoRV位點(diǎn)的下游,Bennetzen and Hall,1982)平末端連接來構(gòu)建載體YEpH2 (見圖2)。
      [0169]整合載體YDPUHK3的克隆策略
      [0170]將用EcoRV和NruI切自載體YEpH2(見圖2)的tHMGl表達(dá)盒引入(連接)到用Stul處理的載體YDpU(Berben等,1991)中。將所得載體YDpUH2 / 12(見圖3)用核酸內(nèi)切酶Smal處理并且與載體pUCTK23的編碼卡那霉素抗性(Webster and Dickson, 1983)的HindII片段連接。將產(chǎn)生的構(gòu)建物(YDpUHK3,見圖3)用EcoRV處理,之后進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。借助Gietz等(Gietz, D.,等,1992)描述的醋酸鋰方法用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)化酵母菌株釀酒酵母AH22 (Hinnen等,1978)。用該線性化載體轉(zhuǎn)化酵母導(dǎo)致全部載體在URA3基因的基因座上整合(見圖4)。為了去除來自整合載體非表達(dá)盒部分的區(qū)域(大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因、TEF啟動子和卡那霉素抗性基因),向轉(zhuǎn)化細(xì)胞施加促進(jìn)尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型酵母的5-FOA(Boeke等,1987)選擇壓力。在含有5-FOA(AH22tH3ura8)的平板上選擇的尿嘧啶-營養(yǎng)缺陷型菌株顯示在URA3基因座中染色體整合的tHMGl表達(dá)盒(見圖4)。
      [0171]SEQ ID N0:3代表整合在菌株AH22tH3ura8中的URA3基因座中的tHMGl表達(dá)盒的序列(包括URA3編碼區(qū)(見圖4))。
      [0172]1.3 使菌株 AH22tH3ura8 中的基因 ARE1、ARE2 缺失。
      [0173]用引入與靶基因座AREl和ARE2同源的短側(cè)翼序列的引物(分別為arelcrelox正向(fw),arel crelox 反向(rev)以及 are2crelox fw, are2crelox rev;表 1)(見圖 5)從質(zhì)粒pUG6 (Guldener等,1996)(見圖6)中擴(kuò)增具有kanMX標(biāo)記基因(編碼慶大霉素抗性)的缺失盒(deletion cassette)。將缺失盒(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的序列)通過Gietz等(Gietz, D.,等,1992)中描述的醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中。
      [0174]在該盒整合到靶基因座中以后(導(dǎo)致相應(yīng)基因丟失),通過ere-重組酶程序(Guldener等,1996)恢復(fù)標(biāo)記基因kanMX,以便能夠再利用該標(biāo)記分別進(jìn)行進(jìn)一步的染色體缺失或整合。
      [0175]ere-重組酶程序需要用攜帶ere-重組酶基因的質(zhì)粒pSH47 (見圖6)轉(zhuǎn)化酵母菌株。該酶能夠重組kanMX抗性基因側(cè)翼的兩個1xP位點(diǎn)。該重組事件甚至導(dǎo)致失去該標(biāo)記基因,在靶基因座留下一個1xP位點(diǎn)。
      `[0176]通過在具有5-氟乳清酸(Guldener等,1996)的平板上反向選擇來鑒別失去質(zhì)粒PSH47的菌落,并且挑取用于進(jìn)一步構(gòu)建目的或作為最終的菌株。
      [0177]表1:用于構(gòu)建菌株AH22tH3ura8AarelAare2的寡核苷酸(引物)
      [0178]
      Jti T 名稱廠— 序列_1_tHMG-51_ACTA TG GACCAATTGGTGAAAACTG____
      2_tHMG-3!__AGTCACATGGTGCTGTTGTGCTT_
      3arelcrelox fw ATGACGGAGACTAAGGATTTGTTGCAAGACG___AAGAGTTTCccagctgaagcttcgtacgc__
      4arelcrelox rev TCATAAGGTCAGGTACAACGTCATAATGATAC___TGGGCCCTgcataggccactagtggatctg_
      5are2crelox fw ATGGACAAGAAGAAGGATCTACTGGAGAACG___A AC A A’ I I 'TC ccagctgaagcttcgtacgc_
      6are2crelox rev TTAGAATGTCAAGTACAACGTACACATGACAC___TTGGTCCCgcataggccactagtggatctg_
      [0179]制備菌株AH22tH3ura8AarelAare2的10份甘油保存物。表1中的大寫字母表示靶基因座的同源區(qū)域,其中整合有或已整合有各整合基因盒。這些區(qū)域可負(fù)責(zé)基因盒在靶基因座中的染色體整合(通過同源重組,例如分別為AREl和ARE2)。因此,這些區(qū)域可位于整合盒的開始或末端。
      [0180]實(shí)施例2
      [0181]通過薄層色譜(TLC)評估所構(gòu)建菌株的中性脂質(zhì)組合物和游離留醇。根據(jù)以下方案進(jìn)行全脂質(zhì)萃取和薄層色譜。
      [0182]TLC (薄層色譜)分析
      [0183]培養(yǎng)稈序:
      [0184]用于TLC分析的釀酒酵母菌株的培養(yǎng)程序?yàn)?
      [0185] 預(yù)培養(yǎng):用50 ill相應(yīng)的甘油保存物接種100ml搖瓶中的20mlWMVIII培養(yǎng)基,并且在30°C 150rpm培養(yǎng)48小時。
      [0186]主培養(yǎng):用1%預(yù)培養(yǎng)物接種250ml具有擋板的搖瓶中的50mlWMVIII培養(yǎng)基,并且在300C 150rpm培養(yǎng)72小時。
      [0187]樣品制各
      [0188]將3 X 0.5mL培養(yǎng)液收集在Eppendorf管(一式三份)中并且通過在4000rpm下離心5分鐘來沉淀。棄去上清液。將酵母沉淀重懸在200 u LTE緩沖液(pH=8.0)中。加入200 u L玻璃珠和200 u L氯仿/甲醇(80:20 (體積% ))。
      [0189]使樣品渦流5X I分鐘(之間在冰上冷卻)。用針在Eppendorf管底部刺孔。將反應(yīng)管放在另一 1.5ml Eppendorf管中并且離心(1000g,2分鐘)。丟棄具有玻璃珠的上Eppendorf管。封閉下Eppendorf管并且離心(13,OOOg, 15分鐘)。在離心的過程中,在沉淀的上面和下面形成相。將下層有機(jī)物轉(zhuǎn)移到1.5ml Eppendorf管中并且用薄層色譜法分析。
      [0190]TLC (薄層色譜)
      [0191]固定相:硅膠60卩254,10\20011,硅膠層厚度0.21111]1。
      [0192]流動相:石油醚:乙醚:醋酸(90:10:1(體積% ))。
      [0193]樣品量:IOiiL
      [0194]運(yùn)行時間:直至平板表面下方Icm
      [0195]檢測:用碘蒸氣染色(檢測角鯊烯、三?;视汀⒘舸己土舸减?
      [0196]結(jié)果:
      [0197]圖8示出野生型菌株AH22ura3、具有下調(diào)的HMG-CoA還原酶的菌株AH22tH3ura8和雙缺失菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2的全部/中性脂質(zhì)組合物。圖8表明,與表達(dá)下調(diào)的HMG-CoA還原酶并且產(chǎn)生大量角鯊烯的泳道3至6中的菌株相比,野生型菌株(AH22ura3,泳道I和2)產(chǎn)生極少量的角鯊烯。編碼負(fù)責(zé)形成甾醇酯的酶的基因(ARE1、ARE2)的缺失導(dǎo)致在相應(yīng)菌株中完全缺乏這些組分(泳道5和6中上部黑框表示)。編碼負(fù)責(zé)形成留醇酯的酶的基因(ARE1、ARE2)的缺失不導(dǎo)致游離留醇積累(泳道3和4與泳道5和6相比,下部黑框表示)。這是出乎意料的,因?yàn)轭A(yù)期在缺乏以留醇酯形式儲存留醇之能力的菌株中,游離留醇的含量增加。
      [0198]通過標(biāo)準(zhǔn)角鯊烯、甾醇-油酸、三油酸甘油酯、油酸和麥角固醇(未示出)鑒別脂質(zhì)組分。[0199]實(shí)施例3
      [0200]菌株AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2原養(yǎng)型(最終菌株I)的構(gòu)建以及細(xì)胞庫生產(chǎn)和儲存
      [0201]3.1菌株構(gòu)建詳情、引物和測序
      [0202]菌株 AH22tH3ura8 A are I A are2H(中間菌株 I)的構(gòu)建:
      [0203]用接種環(huán)將AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2的液體培養(yǎng)物在缺少組氨酸的平板上劃線,之后選擇菌株AH22tH3ura8AarelAare2的HIS4原養(yǎng)型克隆(回復(fù))(見下文)
      [0204]菌株 AH22tH3ura8 A are I A are2HL (中間菌株 2)的構(gòu)建:
      [0205]用引物I和引物2 (引物序列見表2)從菌株S288c的基因組DNA中擴(kuò)增基因LEU2的編碼區(qū)。將所得基因盒轉(zhuǎn)化到菌株AH22tH3ura8AarelAare2H中。通過引物3和引物
      2(在LEU2基因座的5' UTR區(qū)和LEU2編碼區(qū)中退火;引物序列見表2)的PCR分析檢查借助同源重組的靶基因座LEU2(YCL018W)中的正確整合。
      [0206]菌株 AH22tH3ura8 A are I A are2HUL (最終菌株 I)的構(gòu)建:
      [0207]用引入了與靶整合基因座同源的5’ -和3’ -突出序列(長40bp)的引物4和引物5從菌株S288c的基因組DNA中擴(kuò)增基因URA3的完整天然表達(dá)盒(包括天然啟動子和終止子)。不使用基因URA3的天然基因座作為靶基因座,因?yàn)閠HMG表達(dá)盒整合到了菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HL的該基因座中。作為可供選擇的染色體表達(dá)基因座,選擇HO基因座。將天然URA3表達(dá)盒(包括天然啟動子和終止子)轉(zhuǎn)化到菌株AH22tH3ura8AarelAare2HL中。 通過引物6和引物7(在HO基因座的5' UTR區(qū)和3' UTR區(qū)中退火,引物序列見表2)的PCR分析檢查通過同源重組的靶基因座HO(YDL227C)中的正確整合。
      [0208]:
      [0209]通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序來證明突變his4_519的回復(fù)(移碼突變、包括堿基插入,導(dǎo)致Y -GGGG-3' mRNA序列代替野生型Y -CCC-3 ;甘氨酸密碼子(Gaber andCulbertson, 1982)),所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過用引物8和引物9(在HIS4編碼區(qū)中間和在HIS4基因座的:V UTR區(qū)退火,引物序列見表2)從菌株AH22tH3ura8AarelAare2HUL的基因組DNA中擴(kuò)增相應(yīng)的HIS3編碼序列來產(chǎn)生。
      [0210]結(jié)果:序列是正確的(對應(yīng)于S288c的序列,其存于http: / / www.yeastgenome.0rg)。發(fā)生了突變his4-519的回復(fù)。在his4_519突變的情況下,也可通過甘氨酸t(yī)RNA中的基因外抑制性突變進(jìn)行組氨酸營養(yǎng)缺陷型表型的回復(fù)(Gaber and Culbertson, 1982)。
      [0211]通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序來證明菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2HUL中LEU2基因座(YCL018W)處LEU2編碼區(qū)的正確序列,所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過用引物3和引物2 (引物序列見表2)在菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HUL的基因組DNA中擴(kuò)增包括LEU2基因座51 UTR之一部分的整個LEU2編碼序列來產(chǎn)生。
      [0212]結(jié)果:序列是正確的(對應(yīng)于S288c的序列,其存于http: / / www.yeastgenome.0rg)。
      [0213]通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序來證明整合在菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HUL中HO基因座(YDL227C)的基因URA3(包括天然啟動子和終止子)的天然表達(dá)盒的正確序列,所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過用引物6和引物7(在HO基因座的Y UTR區(qū)和:V UTR區(qū)中退火,弓丨物序列見表2)在菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HUL的基因組DNA中擴(kuò)增基因URA3的表
      達(dá)盒來產(chǎn)生。
      [0214]結(jié)果:序列是正確的(對應(yīng)于S288c的序列,其存儲在http: / / www.yeastgenome.0rg)。
      [0215]表2:用于構(gòu)建菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2HUL的寡核苷酸(引物)
      [0216]
      編號 J_HIS4 fw.中間 TCTGAATATGAAGCATCTGAAG_
      9\r H1S4 rev.ATGGCGCTAATGTCTTCAATAC
      [0217]3.2中間菌株lAH22tH3ura8 Λ are I Λ are2H的甘油保存物的制備
      [0218]如Lang 和 Looman (Lang and Loomann, 1995)所不制備 WMV-1I 培養(yǎng)基。
      [0219]用50 μ I甘油保存物將菌株AH22tH3ura8AarelAare2接種到IOOmL無擋板搖瓶中補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmg / L)和亮氨酸(400mg / L)的20mL培養(yǎng)基中,并且在30°C 150rpm孵育72小時(接種物O)。
      [0220]用接種環(huán)將接種物O劃線于補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmg L)和亮氨酸(400mg / L)(無組氨酸)的WMVIII瓊脂平板上,將其在30°C下孵育72小時(平板I)。未確定菌落數(shù)(回復(fù)體數(shù))。
      [0221]接種物1:將從平板I中挑出的菌落接種在IOOmL無擋板搖瓶中的補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmg L)和亮氨酸(400mg / L)的2OmL WMVIII培養(yǎng)基中,并且在30°C 150rpm孵育72小時(接種物I)。
      [0222]接種物2:將350 μ L接種物I接種在IOOmL無擋板搖瓶中的補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmgU和亮氨酸(400mg / L)的35mL WMVIII培養(yǎng)基中,并且在30°C 150rpm孵育48小時(接種物2)。
      [0223]使用接種物2制備中間菌株I (AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2H)的甘油保存物。通過將0.5mL接種物2與0.5mL甘油溶液(水中50% (v / V)的甘油)混合來制備甘油保存物??蓪⒅虚g物l(AH22tH3ura8AarelAare2H)的10份甘油保存物轉(zhuǎn)移在干冰上。
      [0224]接種物2的測試
      [0225]a)接種物2的光密度:
      [0226]0D600 / mL:39.44[0227]b)接種物2的細(xì)胞生存力(在制備甘油保存物之前):
      [0228]通過用菌落形成單位除以細(xì)胞數(shù)(X100)計算接種物2的細(xì)胞生存力%。細(xì)胞數(shù)通過在Thoma計數(shù)室中的計數(shù)來確定。菌落形成單位通過將適當(dāng)稀釋的接種物2在補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmg L)和亮氨酸(400mg / L)的WMVIII瓊脂平板上劃線來確定。
      [0229]c) Thoma計數(shù)室:1:10稀釋接種物2
      [0230]1.計數(shù):34 ;31 ;38 ;32 ;39
      [0231]2.計數(shù):31 ;37 ;31 ;33 ;31
      [0232]33.7 細(xì)胞 X 1.25 X IO6X 10=4.2 X IO8 細(xì)胞 / mL 接種物 2
      [0233]d)平板上的菌落:
      [0234]將50 μ 110-5倍稀釋的接種物2布板在WMVIII平板上
      [0235]計數(shù):207菌落 X IO5 X 20=4.14 X IO8 菌落 / mL 接種物 2
      [0236]生存力:4.1XlO8X 100 / 4.2X IO8 — 98.6%
      [0237]接種物2的細(xì)胞生存力:98.6%
      [0238]e)鈍度和表型
      [0239]表3:用50 μ I接種物2 (如所示用水稀釋至10_5或不稀釋)在指定平板上劃線并且在指定溫度下孵育48小時以 確定純度和表型(營養(yǎng)缺陷型)
      [0240]
      菌株(接種物2)平板孵育溫度觀察結(jié)果
      AH22tH3ura8AareUare2H YE30 °C單酵母菌落(將接種


      物I稀釋10'之后

      在平板上劃線)
      WMVIIi30 0C單酵母菌落(將接種
      +Ura +Leu物I稀釋IO 5,之后
      在平板上劃線)
      LB37°C未生長(未稀釋)
      WMVIii30"O未生長(未稀釋)
      (無氨基酸)
      WMVIIi300C未生長(未稀釋)

      +Ura +His
      WMVIIi300C未生長(未稀釋)

      +Leu +His
      [0241]在顯微鏡下檢查接種物2的細(xì)菌感染一沒有檢測到細(xì)菌污染
      [0242]3.3中間菌株2的構(gòu)建和中間菌株2AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HL的甘油保存物的制備
      [0243]構(gòu)建(工藝流程)[0244]通過本領(lǐng)域中周知的以及下文描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化和用PCR證明LEU2表達(dá)盒在基因座LEU2中的正確整合。
      [0245]酵母轉(zhuǎn)化的結(jié)果
      [0246]如Gietz等(Gietz,D.,等,1992)的描述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化效率(整體轉(zhuǎn)化)為每μ gDNA102-103 轉(zhuǎn)化子。
      [0247]培養(yǎng)在對照平板上的樣品I (AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2H,無DNA)結(jié)果是無菌落生長。培養(yǎng)插入了 AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2H+LEU2盒的樣品2的結(jié)果是可檢測的不同菌落。
      [0248]挑出15個菌落在新WMVlll平板上并且在30°C下孵育72小時。用PCR檢查5個菌落。選擇最大的菌落制備甘油保存物。5個菌落的實(shí)驗(yàn)評估表明全部5個菌落都是可用的。全部5個菌落表明所分析的DNA包含LEU2基因。
      [0249]PCR:
      [0250]從接種在新瓊脂平板上的兩種的酵母轉(zhuǎn)化的菌落中獲得模板。使用PuRe TaqReady To Go-Bead(GE Healthcare:Lot:384777)作為 Taq 聚合酶,體積 25 μ I。
      [0251]這導(dǎo)致珠溶解在23 μ I無菌HPLC-H2O中并且添加各I μ I的引物fw./ rev.(見表)。所使用的 P (R 儀獲自 Flex Cycle Analytik, Jena。
      [0252]PCR 稈序:
      [0253]步驟1:94°C 3 分鐘
      [0254]步驟2:94°C 30 秒
      [0255]步驟3:53 °C 30 秒
      [0256]步驟4:72°C 2分鐘至步驟2,40次循環(huán)
      [0257]步驟5:72 °C 3 分鐘
      [0258]步驟6 A0C
      [0259]用AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HL 的菌落 1、2、3、4 和 5 和引物 5’ LEU2fw 和 LEU2rev的各I μ L引物進(jìn)行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物為約1185bp長。
      [0260]I %瓊脂糖凝膠上凝膠電泳
      [0261]將IOOmL 搖瓶中的來自 Biozym 的 0.5Seakem LE Agarose+50mLl XTAE-緩沖液6uL Iadder(NEB) (500ng /泳道)加樣于一個泳道中。將各擴(kuò)增物的另外10 μ L樣品與2UL6X上樣緩沖液混合并且將混合物加樣于瓊脂糖凝膠上。凝膠在IXTAE緩沖液中于120ν運(yùn)行45分鐘。隨后,將凝膠在溴化乙錠(EtBr)液中孵育20分鐘(EtBr濃度,保存^:10mg / mL,浴(bath):30yL / 300mL IXTAE-緩沖液)。最后,用攝像文件分析凝膠(Alpha 凝膠成像系統(tǒng):0rgBal48 ;任選設(shè)置:exp.0.12s, binlxl, b:0, w:66, g:0.95)。
      [0262]結(jié)果:
      [0263]裝載有樣品的全部5個泳道表明菌株是AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HL菌株。5個菌落表現(xiàn)出約1200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)凝膠電泳,全部5個分析的結(jié)果是菌落包括了正確插入。 因此,LEU2基因的擴(kuò)增導(dǎo)致菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2HL的全部5個菌落中的陽性結(jié)果。
      [0264]菌株AH22tH3ura8 Aarel A are2HL的甘油保存物的制各
      [0265]用從補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmg / L)的WMVIII瓊脂平板中挑出的菌落(平板1,見下文,不等于轉(zhuǎn)化平板)將菌株AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2HL接種在IOOmL無擋板搖瓶中的補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmg / L)的20mLWMVIII培養(yǎng)基中,并且在30°C、150rpm下孵育72小時(接種物I)。
      [0266]通過從轉(zhuǎn)化平板中(見圖1)挑取單菌落產(chǎn)生平板1,所述轉(zhuǎn)化平板通過用包含LEU2編碼序列的DNA片段轉(zhuǎn)化菌株AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2H產(chǎn)生。使用平板I (非轉(zhuǎn)化平板)進(jìn)行下一步的程序。
      [0267]接種物2:將350μ I接種物I接種在IOOmL無擋板搖瓶中的補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmg / L)的35mL WMVIII培養(yǎng)基中,并且在30°C、150rpm下孵育48小時(接種物2)。
      [0268]使用接種物2制備中間菌落2 (AH22tH3ura8 AarelA are2HL)的甘油保存物。通過將0.5mL接種物2與0.5mL甘油溶液(水中50% (v / V)的甘油)混合來制備甘油保存物。可將10份甘油保存物轉(zhuǎn)移到干冰上。
      [0269]接種物2的測試
      [0270]a)接種物2的光密度:
      [0271]0D600 / mL:37.04
      [0272]b)接種物2的細(xì)胞生存力(在制備甘油保存物之前):
      [0273]通過用菌落形成單位除以細(xì)胞數(shù)(X100)計算接種物2的細(xì)胞生存力%。細(xì)胞數(shù)通過在Thoma計數(shù)室中的計數(shù)來確定。菌落形成單位通過將適當(dāng)稀釋的接種物2在補(bǔ)充有尿嘧啶(IOOmg / L)的WMVIII瓊脂平板上劃線來確定。
      [0274]c) Thoma計數(shù)室:1:10稀釋的接種物2
      [0275]1.計數(shù):33 ;36 ;32 ;37 ;39
      [0276]2.計數(shù):28 ;37 ;41 ;33 ;31
      [0277]34.7 細(xì)胞 X 1.25 X IO6X 10=4.3 X IO8 細(xì)胞 / mL 接種物 2
      [0278]d)平板上的菌落:
      [0279]將50 μ 110-5倍稀釋的接種物2布板在WMVIII平板上,結(jié)果:
      [0280]計數(shù):142菌落 X IO5 X 20=2.8 X IO8 菌落 / mL 接種物 2
      [0281]生存力:2.8X IO8X 100 / 4.3X 108,結(jié)果 65.1 %
      [0282]接種物2的細(xì)胞生存力:65.I %
      [0283]e)純度和表型
      [0284]表4:將50 μ I接種物2 (如所示用水稀釋至10_5或不稀釋)在指定平板上劃線并且在指定溫度下孵育48小時以確定純度和表型(營養(yǎng)缺陷型)
      [0285]
      【權(quán)利要求】
      1.酵母細(xì)胞,其中 a)所述細(xì)胞包含編碼可溶性羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的功能基因; b)所述細(xì)胞中一個或更多個編碼留醇酰基轉(zhuǎn)移酶的基因缺陷或缺失;和 c)所述細(xì)胞是至少組氨酸、亮氨酸或尿喃唳原養(yǎng)型的,優(yōu)選地其中所述細(xì)胞至少是組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶原養(yǎng)型的,特別地其中所述細(xì)胞是組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶原養(yǎng)型的。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞是穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞,優(yōu)選地,比下述相應(yīng)細(xì)胞更穩(wěn)定:至少是組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞,更優(yōu)選是組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞,更優(yōu)選是組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞是經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中至少一項所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞是酵母屬(Sacchromyces)細(xì)胞,更優(yōu)選地,其中所述細(xì)胞是釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)細(xì)胞,特別地,其中所述細(xì)胞來源于釀酒酵母細(xì)胞菌株AH22。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中至少一項所述的細(xì)胞,其中所述可溶性HMG-CoA還原酶的特征在于: a)它是缺少膜結(jié)合區(qū)的截短的可溶性HMG-CoA還原酶蛋白; b)它編碼在載體上處于在所述細(xì)胞中有活性的啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下;和/或 c)它在組成型啟動子的控制下表達(dá),特別是在強(qiáng)組成型啟動子的控制下。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中至少一項所述的細(xì)胞,其中所述一個或更多個編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因是AREl和/或ARE2,優(yōu)選地,其中AREl和ARE2基因都缺陷或缺失。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中至少一項所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞的萜烯生產(chǎn)力,優(yōu)選三萜生產(chǎn)力,特別是角鯊烯生產(chǎn)力與以下細(xì)胞相比至少相當(dāng),優(yōu)選增加:相應(yīng)的野生型細(xì)胞和/或至少為組氨酸、亮氨酸或尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型,優(yōu)選組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型,更優(yōu)選組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的相應(yīng)細(xì)胞。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中至少一項所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞產(chǎn)生減少量的留醇酰基酯,優(yōu)選地,其中所述細(xì)胞的留醇?;サ纳a(chǎn)不足。
      9.用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的細(xì)胞的方法,所述方法包括: a)將編碼可溶性HMG-CoA還原酶的基因插入到酵母細(xì)胞中; b)選擇包含編碼所述可溶性HMG-CoA還原酶的基因的細(xì)胞; c)使所述細(xì)胞中一個或更多個編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因缺失或突變; d)將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化成至少針對以下的原養(yǎng)型細(xì)胞:組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶,優(yōu)選組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶,更優(yōu)選組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶,轉(zhuǎn)化如下所述實(shí)施: (i)插入編碼一個或更多個產(chǎn)生組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的基因盒,和/或 (ii)回復(fù)誘變編碼一個或更多個產(chǎn)生組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的缺陷基因, 特別地,通過回復(fù)誘變編碼產(chǎn)生組氨酸的酶的缺陷基因,和通過插入編碼產(chǎn)生亮氨酸和尿嘧啶的酶的基因盒; e)選擇組氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶原養(yǎng)型的細(xì)胞,優(yōu)選至少是組氨酸和亮氨酸、組氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶原養(yǎng)型的細(xì)胞,特別是組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶原養(yǎng)型的細(xì)胞;和任選地 f)培養(yǎng)步驟e)的細(xì)胞;和任選地 g)分離和穩(wěn)定步驟e)或f)的細(xì)胞。
      10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其中所述細(xì)胞是酵母屬細(xì)胞,優(yōu)選地,其中所述細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞,特別地,其中所述細(xì)胞來源于釀酒酵母細(xì)胞菌株AH22。
      11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法,其中步驟a)包括插入編碼可溶性HMG-CoA還原酶的載體,其中所述可溶性HMG-CoA還原酶的表達(dá)處于在所述細(xì)胞中有活性的啟動子控制下,所述啟動子優(yōu)選組成型啟動子,特別是強(qiáng)組成型啟動子。
      12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中至少一項所述的方法,其中所述一個或更多個編碼留醇?;D(zhuǎn)移酶的基因是AREl和/或ARE2,優(yōu)選地,其中AREl和ARE2基因都缺陷或缺失。
      13.根據(jù)權(quán)利要求1至8中至少一項所述的細(xì)胞或由根據(jù)權(quán)利要求9至12中至少一項所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞的用途,其用于生產(chǎn)一種或更多種萜烯,優(yōu)選用于生產(chǎn)一種或更多種三萜,特別是用于生產(chǎn)角鯊烯。
      14.用于生產(chǎn)一種或更多種萜烯,優(yōu)選用于生產(chǎn)一種或更多種三萜,特別是用于生產(chǎn)角鯊烯的方法,所述方法包括: a)將根據(jù)權(quán)利要求1至8中至少一項所述的細(xì)胞或由根據(jù)權(quán)利要求9至12中至少一項所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中;和 b)從步驟(a)的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離一種或更多種萜烯,優(yōu)選一種或更多種三職,更特別是角S烯。
      15.用于生產(chǎn)藥物或化妝品組合物、潤滑劑或變壓器油,特別是用于生產(chǎn)疫苗組合物的方法,所述方法包括: a)根據(jù)權(quán)利要求14生產(chǎn)一種或更多種萜烯;和 b)將所述萜烯混合到所述藥物或化妝品組合物、 所述潤滑劑或所述變壓器油,特別是所述疫苗組合物; 其中任選地對所述一種或更多種萜烯進(jìn)一步實(shí)施一個或更多個氫化步驟,其中所述一種或更多種萜烯優(yōu)選地是氫化三萜,特別是角鯊烯。
      【文檔編號】C12N9/04GK103492558SQ201280010656
      【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月28日
      【發(fā)明者】安德烈亞斯·拉布, 克里斯蒂娜·蘭 申請人:器官平衡有限責(zé)任公司
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