專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水凝膠-納米纖維膜及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種納米纖維聚合物復(fù)合膜及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
老年性黃斑變性(Age-relatedMacular Degeneration, AMD)是一種多因素復(fù)合作用的眼底病，是導(dǎo)致老年人失明的常見(jiàn)疾病之一。該視網(wǎng)膜退行性疾病表現(xiàn)為中心視力進(jìn)行性減退，常導(dǎo)致閱讀和其他行為障礙。雖然目前對(duì)這種病還沒(méi)有特效的治療方法，但科學(xué)家們?cè)诟杉?xì)胞領(lǐng)域的研究為這類(lèi)病人帶來(lái)了治愈的曙光，即把培養(yǎng)在適當(dāng)聚合物支架上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)移植入眼睛內(nèi)以替代退化的細(xì)胞。這種治療方案要求支架具有生物活性和可降解性，而視網(wǎng)膜下腔有限的路徑則要求支架的大小和機(jī)械特性需達(dá)到最優(yōu)化。RPE是Bruch膜上的連續(xù)單層細(xì)胞，位于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞外節(jié)段和脈絡(luò)膜之間。RPE與視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層共同組成功能單位，以提供視覺(jué)的轉(zhuǎn)換界面。RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜新陳代謝最活躍的部分，控制營(yíng)養(yǎng)成分在脈絡(luò)膜和感光細(xì)胞層間的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及代謝廢物通過(guò)Bruch膜由感光細(xì)胞層的排出。隨著年齡的增長(zhǎng)，代謝廢物阻塞RPE和Bruch膜引起積累損傷，并導(dǎo)致RPE脫離或代謝活性的降低，繼而引起光感受器的凋亡和視覺(jué)的不可逆喪失。Bruch膜是脈絡(luò)膜最里面的一層，厚度約有2-4 μ m,由五層結(jié)構(gòu)組成，里面的三層包含膠原(collagen)及彈性蛋白纖維(elastic fibers),側(cè)翼為基底膜。這幾層結(jié)構(gòu)的作用是儲(chǔ)存生長(zhǎng)因子和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。上皮細(xì)胞與基底膜的粘附依賴(lài)于細(xì)胞膜相關(guān)的整合素受體與特異識(shí)別序列的結(jié)合，如存在于基底膜的精氨酸-甘氨酸-天門(mén)冬氨酸序列(Arginine-Glycine-Aspartic acid, RGD sequence)。另外，基底膜的三維結(jié)構(gòu)表面復(fù)雜，布滿(mǎn)大小為30-400nm的小孔，這種納米級(jí)基質(zhì)特征可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、遷移、增殖和分化等基本行為。RPE細(xì)胞具有正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能是移植治療黃斑變性的重要前提。將老化的RPE細(xì)胞通過(guò)外科手術(shù)剝離，再將RPE細(xì)胞或其前體細(xì)胞移植其內(nèi)，這些細(xì)胞將整合到原有的上皮細(xì)胞并恢復(fù)光感受器功能。如果將RPE細(xì)胞懸液直接用于移植，則因其不能與基底膜正常粘附，RPE細(xì)胞將會(huì)發(fā)育為沒(méi)有功能作用的異常取向或多層結(jié)構(gòu)，并最終導(dǎo)致移植失敗。介于RPE細(xì)胞的單層結(jié)構(gòu)和正確的極化對(duì)上皮細(xì)胞機(jī)能恢復(fù)的重要性，將RPE種植在適宜的組織工程支架上將是治愈老年性黃斑變性的最有希望的方向。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種天然和人工合成的載體以替代Bruch膜的功能，如人類(lèi)羊膜或豬晶狀體囊，這些捐贈(zèng)而來(lái)的膜片在視網(wǎng)膜組織工程中經(jīng)常用到。但這些替代物除了有一定局限性和傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)外，也有其他的缺陷，如基于堅(jiān)硬關(guān)聯(lián)的膠原支持物，在RPE移植時(shí)很難與視網(wǎng)膜下腔形狀保持一致，而膠質(zhì)包被的晶狀體前囊太松軟，且在視網(wǎng)膜下腔操作時(shí)容易卷曲。相比之下，人工聚合體支持物，如能水解的聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚癸二酸丙三醇酯、聚羥基脂肪酸酯或不可降解的聚二甲基硅氧烷和聚醚尿烷，可能是RPE 單層細(xì)胞形成的理想底物，但是他們都不具備RPE成功移植所需要的所有條件，如多孔性、充足的滲透性、適宜的厚度和可降解等性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有天然和人工合成載體的不足，提供一種納米纖維聚合物復(fù)合膜及其制備方法和用途。本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—種納米纖維聚合物復(fù)合膜，其下層為水凝膠納米纖維膜、中層為Matrigel基質(zhì)膠層、上層為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層。所述的水凝膠納米纖維膜中由包含以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分制成10-20%硫酸軟骨素、O. 05-0. 1%!1202和0· 0003125-0. 000625%辣根過(guò)氧化物酶和 79. 899375-89. 9496875% 的磷酸緩沖液制成。所述的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層為單層。上述鋪有RPE細(xì)胞的納米纖維聚合物復(fù)合膜的下層水凝膠納米纖維膜質(zhì)地柔軟、有彈性、滲透性好、可生物降解并且具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)，有利于RPE單層細(xì)胞的粘附、分化，便于外科手術(shù)操作，移植后可通過(guò)代謝過(guò)程排出體外，對(duì)人體無(wú)害；中層Matrigel是一種可溶性的基底膜基質(zhì)，可自動(dòng)聚集產(chǎn)生類(lèi)似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料，主要成分包括層黏連蛋白、膠原IV等，同時(shí)含組織纖維酶原活化因子、TGF-β成纖維細(xì)胞及其它生長(zhǎng)因子，可有效幫助RPE細(xì)胞的附著和分化；上層RPE細(xì)胞是多角形、鑲嵌的單層細(xì)胞，呈極性排列。一種上述納米纖維聚合物復(fù)合膜的制備方法，包含如下步驟(I)稱(chēng)取硫酸軟骨素、H2O2和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)并充分混勻；(2)將步驟(I)制備的混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于培養(yǎng)箱中，然后在細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔加入O. 5-2mL視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋該混合物，于培養(yǎng)箱中過(guò)夜，制得水凝膠納米纖維膜；(3)將步驟(2)中細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)基吸掉，每孔鋪上O. 5_2mL稀釋的基質(zhì)膠Matrigel,以利于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，放入培養(yǎng)箱2_4h，待用；(4)吸除培養(yǎng)有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)板(以6孔細(xì)胞培養(yǎng)板計(jì))中的培養(yǎng)基，每孔加O. 5-2mL磷酸鹽緩沖液，以除掉殘留的培養(yǎng)基，每孔加O. 5-lmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 25%的胰酶-EDTA，放入培養(yǎng)箱2-5min，待85-95%細(xì)胞脫離板壁后，每孔加l_2mL視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基以終止胰酶-EDTA作用，吹打后轉(zhuǎn)移離心管中；(5)離心，去除上清，加l_2mL視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并計(jì)數(shù)；將濃度為IO4 IO6個(gè)/mL的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞接種到步驟(3)中制備好的納米纖維膜上；放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基；(6)待細(xì)胞有80-90%鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板底后，將細(xì)胞連同聚合物膜及Matrigel切下，用于臨床細(xì)胞移植。所述的步驟(I)中硫酸軟骨素、H2O2和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶解在磷酸緩沖液中，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 10-20% O. 05-0. 1%和 O. 0003125-0. 000625所述的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，包含以下組分α修飾最小必需培養(yǎng)基 500mL，
NI 補(bǔ)充物5mL，谷氨酰胺-青霉素-鏈霉素 5mL，非必需氨基酸5mL，?；撬?25mg,氫化可的松10g，三碘甲狀腺原氨酸0.0065g，熱滅活胎牛血清25 75mL。 所述的步驟(2)的培養(yǎng)時(shí)間為3_5h。所述的培養(yǎng)箱的條件為37°C,5% C02。所述的步驟(3)中Matrigel以磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)瑑烧叩捏w積比為I 10-1 20。所述的步驟(5)中離心的操作條件為常溫，轉(zhuǎn)速為800-1500rpm,離心時(shí)間為3-5min。一種上述納米纖維聚合物復(fù)合膜用于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植材料的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于目前已開(kāi)發(fā)的天然和人工合成載體，如人類(lèi)羊膜或豬晶狀體囊，除了有一定局限性和傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)外，也有其他的缺陷，如基于堅(jiān)硬關(guān)聯(lián)的膠原支持物，在RPE移植時(shí)很難與視網(wǎng)膜下腔形狀保持一致，而膠質(zhì)包被的晶狀體前囊太松軟，且在視網(wǎng)膜下腔操作時(shí)容易卷曲；人工聚合體支持物，如能水解的聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚癸二酸丙三醇酯、聚羥基脂肪酸酯或不可降解的聚二甲基硅氧烷和聚醚尿烷，都不具備RPE成功移植所需要的所有條件，如多孔性、充足的滲透性、適宜的厚度和可降解等性能。本發(fā)明將納米材料和細(xì)胞工程相結(jié)合，彌補(bǔ)了現(xiàn)有天然和人工合成載體的不足，開(kāi)發(fā)出的水凝膠-納米纖維膜柔軟、有彈性、滲透性好、可生物降解并且具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)，這些特征有利于RPE單層細(xì)胞的粘附、分化，便于外科手術(shù)操作，移植后可通過(guò)代謝過(guò)程排出體外，對(duì)人體無(wú)害。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可以按如下所述選擇所需的試劑α 修飾最小必需培養(yǎng)基 MEM, a modification (Sigma, USA),NI 補(bǔ)充物Nlsupplement (Sigma, USA),谷氨酸胺-青霉素-鏈霉素Glutamine-penicillin-streptomycin (Sigma, USA),非必需氨基酸Non essential amino acids (Sigma, USA),牛橫酸Taurine (Sigma, USA),氫化可的松Hydrocortisone (Sigma, USA)，三碘甲狀腺原氨酸Triiodo-thyronin (Sigma, USA),熱滅活胎牛血清Fetal bovine serum, heat inactivated (Invitrogen,USA),基質(zhì)膠Matrigel (BD, USA),0. 25%胰酶-EDTA0. 25% Trypsin-EDTA(Invitrogen, USA)。
硫酸軟骨素Chondroitin Sulfate (Sigma, USA),過(guò)氧化氫H2O2(Sigma，USA)，辣根過(guò)氧化物酶Horseradish Peroxidase (HRP) (Sigma, USA)。溶液配方I) 12. 5-25wt%硫酸軟骨素125_250mg硫酸軟骨素溶于磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液)，定容至ImL ；2)0. 5-lwt% H2O2 :100 μ L1-2% H2O2 用磷酸鹽緩沖液稀釋至 200 μ L ；
3) 10-20U/mL 辣根過(guò)氧化物酶(HRP，300U/mg):取 5-10 μ L 濃度為 5mg/mL 的 HRP用磷酸鹽緩沖液稀釋至800 μ Lo4)Matrigel (BD Biosciences, cat. no. 356234):用憐酸鹽緩沖液1: 10-1 : 20稀釋5) RPE細(xì)胞培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種納米纖維聚合物復(fù)合膜，其特征在于其下層為水凝膠納米纖維膜、中層為 Matrigel基質(zhì)膠層、上層為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米纖維聚合物復(fù)合膜，其特征在于所述的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層為單層；或所述的水凝膠納米纖維膜中由包含以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分制成10-20%硫酸軟骨素、.O.05-0. 1% H2O2 和 O. 0003125-0. 000625%辣根過(guò)氧化物酶和 79. 899375-89. 9496875% 的磷酸緩沖液。
3.—種上述權(quán)利要求1 2中任一所述的納米纖維聚合物復(fù)合膜的制備方法，其特征在于包含如下步驟(1)稱(chēng)取硫酸軟骨素、H2O2和辣根過(guò)氧化物酶并充分混勻；(2)將步驟(I)制備的混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于培養(yǎng)箱中，然后在細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔加入O. 5-2mL視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋該混合物，于培養(yǎng)箱中過(guò)夜，制得水凝膠納米纖維膜；(3)將步驟(2)中細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)基吸掉，每孔鋪上O.5-2mL稀釋的基質(zhì)膠 Matrigel,放入培養(yǎng)箱2_4h,待用；(4)吸除培養(yǎng)有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加O.5-2mL磷酸鹽緩沖液，除掉殘留的培養(yǎng)基，再在每孔加O. 5-lmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 25%的胰酶-EDTA，放入培養(yǎng)箱 2-5min，待85-95%細(xì)胞脫離板壁后，每孔加l_2mL視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打后轉(zhuǎn)移離心管中；(5)離心，去除上清，加l_2mL視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并計(jì)數(shù)；將濃度為 IO4 IO6個(gè)/mL的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞接種到步驟(3)中制備好的納米纖維膜上；放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基；(6)待細(xì)胞有80-90%鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板底后，將細(xì)胞連同聚合物膜及Matrigel切下，用于臨床細(xì)胞移植。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(I)中硫酸軟骨素、 H2O2和辣根過(guò)氧化物酶溶解在磷酸緩沖液中，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10-20%、0. 05-0. 1%和.O.0003125-0. 000625% ο
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，包含以下組分α修飾最小必需培養(yǎng)基500mL，NI補(bǔ)充物5mL，谷氨酰胺_青霉素_鏈霉素5mL,非必需氨基酸5mL，牛磺酸125mg,氫化可的松10g，三碘甲狀腺原氨酸0.0065g，熱滅活胎牛血清25 75mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)的培養(yǎng)時(shí)間為3-5h。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)箱的條件為37°C，5%CO2。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中Matrigel以磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)瑑烧叩捏w積比為1: 10-1 20。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)中離心的操作條件為常溫，轉(zhuǎn)速為800-1500rpm，離心時(shí)間為3_5min。
10.一種上述權(quán)利要求1-2中任一所述的納米纖維聚合物復(fù)合膜用于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植材料的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種納米纖維聚合物復(fù)合膜及其制備方法和用途。該納米纖維聚合物復(fù)合膜，其下層為水凝膠納米纖維膜、中層為Matrigel基質(zhì)膠層、上層為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層。該納米纖維聚合物復(fù)合膜作為生物支架用于支持RPE細(xì)胞的生長(zhǎng)和移植。該納米纖維膜柔軟、有彈性、滲透性好、可生物降解并且具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)。這些屬征有利于RPE單層細(xì)胞的粘附、分化，便于外科手術(shù)操作，移植后可通過(guò)代謝過(guò)程排出體外，對(duì)人體無(wú)害。本發(fā)明結(jié)合生物納米材料和細(xì)胞工程，其成功研發(fā)給老年性黃斑變性(AMD)患者帶來(lái)光明和希望，并將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A61L27/44GK103007355SQ20111028042
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者范國(guó)平, 薛志剛, 劉振山 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)