專利名稱：防御素及其在制備抗菌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及防御素及其在制備抗革蘭氏陰性菌和陽性菌藥物中的應用。具體地， 涉及利用小球藻生產的防御素mNP-1，及其在制備抗革蘭氏陰性菌和陽性菌藥物中的應用。
背景技術：
防御素的結構特點及分類防御素是一類廣泛存在于動物、植物和人類體內具有微生物抗性的陽離子小肽。 防御素一般由29-54個氨基酸組成，分子量為3-6KD。在結構上具有以下共同特點(I)帶正電荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定數目的保守的半胱氨酸，(4)通過半胱氨酸分子形成分子內二硫鍵，使肽環(huán)合形成反向平行的β片層結構。自1985年美國加利福尼亞大學 Lehrer教授對其命名以來(Selsted et al.，1985)，受到國內外科學家的廣泛關注。根據分子大小、結構與功能的差異，可將防御素大致分為四類防御素、β防御素、昆蟲防御素與植物防御素?；诎腚装彼釟埢拈g距和二硫鍵的形式，哺乳動物的防御素可分為三類α防御素、β防御素和Θ防御素。哺乳動物的防御素由18-42個氨基酸組成，其中6 個保守的半胱氨酸形成了 3對二硫鍵，使肽鏈折疊成β片層結構。α防御素由29-36個氨基酸組成，二硫鍵的連接方式為1-6、2-4、3-5 ； β防御素由38-42個氨基酸組成，二硫鍵的連接方式為1-5、2-4、3-6，β防御素中還有一個脯氨酸和甘氨酸；1999年從非人靈長類恒河猴中發(fā)現了新的一類防御素一由18個氨基酸殘基組成的環(huán)狀Θ防御素，它們是由兩個不同的截短的α防御素類肽連接而成。防御素在人體中廣泛分布，人體中α防御素有6種，其中4種即ΗΝΡ1-4主要產生于粒細胞，2種HD5-6主要產生于潘氏細胞；人類基因組有28個β -防御素基因，在人類和鼠類已經鑒定出超過35個β_防御素基因。防御素的表達與病源微生物的入侵是緊密相關的，例如在透析病人的腹腔中同時發(fā)現有α防御素與β防御素，又如細菌性腦膜炎患兒的腦脊髓液中防御素的濃度比非細菌性腦膜炎高150倍。眼內防御素的表達研究表明，防御素在淚液中的含量與感染時的表達不同。研究表明防御素在人體防病抗病中起著非常重要的作用。到目前為止,分離到的兔防御素有9個,其中7個為α防御素ΝΡ_1,ΝΡ-2,NP_3a, NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，產生于粒細胞。另外2個兔防御素:RK_1和RK-2， 來自于兔腎細胞。α-防御素NP-I比人防御素HNP-I的抗菌活性強5 10倍，兩者間的這一明顯差異被歸結為它們的分子凈電荷性質在NP-I分子中含有9個凈正電荷，而在HNP-I 分子中僅含有3個凈正電荷。目前，從生物體中分離到的防御素已達30多種，其中兔防御素(Netrophile Peptide-1, NP-1)的抗性譜最廣。兔防御素NP-I由33個氨基酸組成,屬于α-防御素，有6個半胱氨酸，它們形成3個二硫鍵，連接位置分別為l-6，2-4，3-5(Ganz， 1989)。它對梅毒螺旋體、很多革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和病毒有顯著的抑制或毒殺效應。防御素抗微生物機理
在動植物及人體內，防御素含量極其少，卻執(zhí)行著機體重要的防御功能。與傳統(tǒng)抗生素相比，防御素有其獨特的抑制機理。防御素的抗菌作用機理為它依靠靜電作用，通過本身所帶的正電荷與帶負電荷的微生物細胞膜相互吸附，即防御素與革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)、革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸等陰離子分子作用而附著在靶細胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬時的或穩(wěn)定的跨膜離子通道(兔防御素NP-I形成瞬時的，人防御素 HNP-I形成穩(wěn)定的跨膜離子通道)，導致細胞內溶液外滲，從而擾亂了細胞膜的通透性及細胞能量狀態(tài)，導致細胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及細胞內ATP含量下降，最終導致靶細胞死亡。防御素的抗病毒作用則是通過與病毒外殼蛋白結合而導致病毒失去生物活性。 正是由于這種特殊的作用機理，目的微生物難以產生抗防御素的抗性突變，因此防御素被認為是一種新型低耐藥性甚至無耐藥性的抗感染肽類。不同防御素的抗微生物活性由于不同來源的防御素在結構上有一定的差異，因此它們的抑菌譜亦有很大差別。各種α-防御素對革蘭氏陰性菌、陽性菌，分枝桿菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，其作用劑量大部分在1-100 μ g/ml之間(Patterson Delafied et al., 1980,1981 ；Lehrer et al.，1983，1985a，1985b，1986，1989 ;Selsted et al.，1984，1985c， 1987，1992 ;Ganz，1985a ;Segal et al.，1985 ;Daher et al. , 1986 ；Levitz et al.，1986 ; Shafer et al. ，1988 ;Eisenhauer et al. ，1989 ;Yamashita and Saito，1989 ;Cullor et al.，1990，1991 ;Miyasaki et al.，1990a，1990b，1990b ;Borenstein et al·，1991a， 1991b ；Kohashi et al.，1992 ;0gata et al.，1992 ;Nakashima，1993)。與其它抗微生物肽相比，防御素具有更廣的抗性譜，尤其是兔防御素ΝΡ-1，ΝΡ-2，不但抗性譜廣，抑菌活性也較強。1984年，Selsted等發(fā)現從兔中性粒細胞分離獲得的NP-I在濃度為50 μ g/ml時對3個家系的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，月市炎鏈球菌(Staphylococcus pneumoniae)，無乳鏈球菌(Staphylococcus agalactiae)，李斯特菌(Listeria monocytogenes)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大腸桿菌(Escherichia coli)，月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)， 粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和支氣管炎博德氏桿菌(bordetella bronchiseptica)抑制生長或者殺滅作用(Selsted et al. 1984) ο1985年，Lehrer等首次發(fā)現兔MCP-I和MCP_2(現名分別為，兔防御素NP-I和 NP-2)在體外對I型單純皰疫病毒(herpes simplex virus typel，HSV-1)具有中和活性作用，而4個結構同源的肽NP-3a，NP-3b，NP-4和NP-5對HSV-I無效。兔防御素NP-I和 NP-2對單純皰疹病毒的滅活作用依賴于肽濃度以及肽與HSV-I孵育的時間，溫度和pH。2 型單純皰疫病毒(herpes simplex virus type 2，HSV-2)，水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)，流感病毒 A/WSN(inf luenza virus A/WSN)也易被 MCP-1 和 MCP-2 直接中和，但MCP-I和MCP_2對巨細胞病毒(cytomegalovirus)，?？刹《綢I型(echovirus type 11)，和呼腸孤病毒3型(reovirus type 3)無效。1986年，Lehrer等也首次報道HNPl對包膜病毒單純皰疹病毒I和2(HSV_1和 HSV-2)、水泡性口炎病毒，人流感病毒有直接滅活作用，但對非被膜病毒?？刹《竞秃裟c孤
4病毒沒有作用。在包膜病毒的研究中，HNPl對HSV-I和HVS-2有很強的直接抑制作用，對水泡性口炎病毒和流感病毒(IAV)有溫和的直接抑制作用，對巨細胞病毒，僅在高濃度時， 才有輕微的作用。對少數禽類的β防御素抗菌活性的研究顯示其具有廣泛地抗革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌和真菌作用。在美國，每年由于感染造成的死亡人數超過250萬例，因此感染已成為造成死亡的首要原因。而且在美國，每年有70%感染患者有抗藥性，使耐藥細菌迅速的增加，已成為世界所面臨的最嚴重的醫(yī)療問題之一。感染耐甲氧西林的金黃色葡萄菌(MRSA)僅4年已增加了 700% ο在美國，2008年MRSA的住院費用超過了 685，000美元，并預計到2013年增至240萬美元。MRSA感染直接花費美國醫(yī)療系統(tǒng)的100億美元和每年總花費達180億美
J Li ο抗生素耐藥菌的出現，甚至多重耐藥菌的發(fā)現，以及耐藥菌感染的急劇上升，急需不會帶來病原菌耐藥性的新藥物。由于防御素具有強大的抗菌和免疫調節(jié)作用，防御素對抗生素耐藥菌及多重耐藥菌也均具有抑殺作用。與傳統(tǒng)的抗生素相比，細菌從防御素中獲得耐藥性極為困難。因此，廣泛地認為防御素是最具有潛力的新一代抗感染生物肽。防御素的殺傷效果可被血清抵消，可能是由于防御素結合到各種血漿蛋白如特異性補體成分，絲氨酸蛋白酶抑制劑和激活的a2_巨球蛋白(Lichtenstein et al. , 1986 and 1988 ；Okrent et al. , 1990 ；Panyutich et al. , 1991,1994 and 1995)。當 1%胎牛血清存在時，人防御素(HNPs)介導的腫瘤細胞裂解降低了 30%，而當5%胎牛血清存在時，人防御素(HNPs)介導的腫瘤細胞裂解降低了 75% (Lichtenstein et al. ,1986)。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌自然界存在多種多樣的病菌，通過革蘭氏染色法，能夠把細菌分成兩大類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。這種染色方法是先用龍膽紫(也稱結晶紫)染色細菌，所有的細菌均被染成紫色，然后再用革蘭氏碘液來加強染料與菌體的結合，再用95%的乙醇脫水短時脫水(20-30秒)，在這個過程中有些細菌染色很牢固，染色不被脫去，而仍保留著紫色，有些細菌染色不牢固，染色被脫去變成為無色，接著再用番紅或沙黃復染I分鐘，那么被脫色了的細菌可以染色，變成紅色，未脫色的細菌不能再染色了，仍保持著原來的紫色; 據此，凡是被染成紫色的細菌就成為革蘭氏陽性菌(G+菌)，被染成紅色的細菌稱為革蘭氏陰性菌(G-菌)。大多數化膿性球菌都屬于革蘭氏陽性菌，它們能產生外毒素使人致病，常見的革蘭氏陽性菌有葡萄球菌(Staphyloccocus)、鏈球菌(Streptococcus)、肺炎雙球菌 (Diplococcus pneumoniae)、炭疽桿菌(Bacillus anthraci)、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、破傷風桿菌(Clostridium tetani)等,可以選擇青霉素族,頭孢曲松鈉等； 大多數腸道菌多屬于革蘭氏陰性菌，它們產生內毒素，靠內毒素使人致病。常見的革蘭氏陰性菌有痢疾志賀氏桿菌(Shigella dysenteriae)、傷寒桿菌((Salmonella enterica serovar Typhi)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌(proteusbacillus vulgaris)、 銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)等革蘭氏陰性菌則對青霉素不敏感，可以選擇氟喹諾酮類藥物如諾氟沙星，左氧氟沙星等，也可以選擇大環(huán)內酯類比如克拉霉素、羅紅霉素等。革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，約20 80nm。肽聚糖含量豐富，有15 50層，每層厚度Inm,約占細胞干重的50 80%。此外，尚有大量特殊組分磷壁酸(teichoic acid)。 磷壁酸是由核糖醇(ribitol)或甘油(glyocerol)殘基經由磷酸二酯鍵互相連接而成的多聚物。憐壁酸分壁憐壁酸(wall teichoic acid)和膜憐壁酸(membrane teichoic acid) 兩種，前者和細胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸連結，膜磷壁酸又稱脂磷壁酸(Iipteichoic acid)和細胞膜連結，另一端均游離于細胞壁外。磷壁酸抗原性很強，是革蘭氏陽性菌的重要表面抗原；在調節(jié)離子通過粘肽層中起作用；也可能與某些酶的活性有關；某些細菌的磷壁酸，能粘附在人類細胞表面，其作用類似菌毛，可能與致病性有關。此外，某些革蘭氏陽性菌細胞壁表面還有一些特殊的表面蛋白，如a蛋白等，都與致病有關。臨床上，常見的革蘭氏陽性菌(G+菌)致病菌主要包括7大類金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草綠色鏈球菌(Viridans streptococci)、腸球菌屬(Enterococcus其中幾球菌(E. faecalis)更為常見)、肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)、β -溶血鏈球菌(β -haemolytic streptococcus)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, Sau)是目前床上最常見的致病菌之一，青霉素從20世紀40年代開始應用于臨床，但很快出現了耐藥菌株。自從1961年 Jevons首次分離出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-reistant Staphylococcus aureus, MRSA)以來，MRSA在世界的感染率和分離率不斷增加，已成為目前醫(yī)院內感染的主要病原菌之一，由金黃色葡萄球菌引起的感染成為臨床棘手的問題(Moran et al, 2006)。MRSA自出現以來，強大的致病毒力因子以及耐藥性便使其成為臨床上的一個難題，導致MRSA的感染率不斷上升，感染范圍不斷擴大，感染的程度愈來愈嚴重。MRSA感染的治療目前還是以藥物為主，但其對抗生素的多重耐藥導致治療上的困難。其臨床感染率和危害性已經引起醫(yī)學界震驚和高度重視，因此人們把MRSA這種菌株形象地稱為“超級細菌”。自從1968年首次發(fā)現MRSA I引起的感染，40年來，MRSA造成的院內與院外感染均成上升趨勢，我國1989年全國部分城市調查MRSA平均檢出率為42. 7 %，屬MRSA 感染的嚴重國家之一。20世紀90年代以后我國北京、上海、廣州等地大型醫(yī)院MRSA的分離率都已超過了 50%，而其他地區(qū)的報道也大部分在25% -60%之間。上海2004年金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)中MRSA的分離率已達到63. 9%，2006年上海各大醫(yī)院 MRSA的檢出率最高達92. 5%。2006年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測顯示MRSA在金葡菌感染中所占比例平均為76. 3 %，說明MRSA感染已經達到了很嚴重的程度(汪復，2008)。 在國外，近年在南歐部分國家和英國MRS A在金葡菌感染中的檢出率在大型醫(yī)院達到了 30% -50%。在德國，1996-2006年間MRSA的感染率不斷增長達到了 20% -22%，德國的一所大型教學醫(yī)院(kath-arinen hospital)MRSA感染的病例在1994-2003年間上升了 277% (Trautmann et al. ,2007) 2004年美國大部分醫(yī)院MRSA感染率都超過50%， MRSA在美國占院內感染金葡菌的比率從1975年的2. 4%上升到1997年的39. 9%。2005 年，美國Uehnert等在全美475所醫(yī)院的調查顯示，MRSA感染的住院病人相比1995年增長了 10倍，是2000年的3倍，比2004年增長了 30 %，而且由于檢測及培養(yǎng)方面的差別與缺陷，實際的發(fā)生率可能更高(Jarvis et al.，2007)。近年來感染菌變遷的總趨勢是革蘭氏陰性桿菌占主要地位(張秀珍，1999)，臨床上感染的革蘭氏陰性菌菌群主要有 大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、不動桿菌屬 (Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、幽門螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)。季萍等 (2002)的研究結果表明，這些致病的革蘭氏陰性菌大部分產生了耐藥性腸桿菌科細菌對氨芐西林耐藥率為80 % 100 %，除肺炎克雷伯菌外，對阿莫西林/棒酸耐藥率為> 60 %。 除大腸桿菌外，對培氟沙星耐藥率為<50%。除腸桿菌屬外對奈替米星、頭孢西丁的耐藥率為15% 30%，銅綠假單胞菌對亞胺培南、慶大霉素、頭孢他啶、妥布霉素耐藥率為10% 25%。不動桿菌屬對亞胺培南、妥布霉素耐藥率2% 29%。產ESBLs菌株高度耐三代頭孢菌素，對氨基糖苷類、復方新諾明、喹諾酮類交叉耐藥率高達78. 9 % 100 %。兔防御素的生產目前文獻報道獲取兔防御素的途徑大部分是從兔子中獲得的(Judithet al.，
1980；Selsted et al.，1983，1984，1985 ；Lehrer et al.，1981，1983，1985 ；Sinha et al.， 2003)。中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所以橢圓小球藻硝酸還原酶基因缺失突變體為受體，以NPTII和硝酸還原酶基因為篩選標記，以Ubiquitin啟動子控制NP-I，獲得了能夠在硝酸鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)而且具有較強NP-I活性的轉基因小球藻(安洋等，2008)。NP-1 的離體抗菌活性已有較多報道(Patterson-Delaf ield et al. , 1980,
1981；Selsted et al.,1984,1985c ；Lehrer et al, 1983,1985a,986 ；Levitz et al.， 1986 ；Miyasaki et al. , 1990b, Borenstein et al. ,1991a,1991b ；Kohashi et al., 1992)，已報道的NP-I的抗菌譜有白色念球菌(Candida albicans)，糞腸球菌 (S. faecalis),枯草桿菌(B. subtil is),鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，月市炎鏈球菌(Staphylococcus pneumoniae)，無乳鏈球菌(Staphylococcus agalactiae)， 李斯特菌(Listeria monocytogenes),銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),大腸桿菌(Escherichia coli),肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens),流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和支氣管炎博德氏桿菌(bordetella bronchiseptica),曲霉(Aspergillus fumigatus),米根霉 (Rhizopus oryzae)，伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)，哨蝕艾肯菌Eikenella corrodens), 二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga spp.),梅毒螺旋體 (Treponema pallidum)。但其在抗耐藥細菌方面還未見報道,在活體抗細菌方面也未見報道。抗病毒方面的報道較少(Nakashima et al. , 1993 ；Lehrer et al, 1985b ；Sinha et al. ,2003)。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種改造的NP-I (即mNP-1)及其在抗細菌方面的應用，所述的改造的NP-I (即mNP-1)具有34個氨基酸，第一個氨基酸為甲硫氨酸，是新加上的，其余的33個氨基酸來自兔防御素NP-I的序列，改造后的NP-I的核苷酸序列為SEQ ID N0:15所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO :16(簡稱mNP-Ι)。mNP-1具有較強抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的能力，在離體水平mNP-Ι濃度為5 μ g/mL以上時，對部分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有殺滅作用。我們還在活體上證明了 mNP-Ι對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有顯著殺滅效果，尤其是對耐藥菌殺滅的效果更為顯著。而前人從兔中獲得的防御素NP-I濃度為50 μ g/ mL以上時，對金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌桿菌，大腸桿菌，肺炎鏈球菌，無乳鏈球菌，流感嗜血桿菌具有殺滅作用(Selsted et al.，1984)。我們比較了 mNP-Ι與從兔子中分離獲得的天然NP-I抗革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌)及革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌和大腸桿菌)的效果，結果表明mNP-Ι比從兔子中分離獲得的天然NP-I的抗菌效果更好。至今未有報告從兔子中分離獲得的防御素NP-I對耐藥菌有殺滅作用，也未有報道在活體水平上對殺滅革蘭氏陰性菌和陽性菌有效。1-10% (v/v)濃度的人血清對mNPl抑菌活性沒有影響。具體地，在本發(fā)明的一個方面，提供了一種短肽mNP-Ι，其氨基酸序列為SEQ ID NO 16所示的序列。在本發(fā)明的另一個方面，提供了編碼所述短肽mNP-Ι的核酸。優(yōu)選地，所述核酸的序列為SEQ ID NO 15所不的序列。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種表達載體，其包含上述之一的核酸。在一個具體的實施方案中，所述表達載體是通過將Nos終止子(SEQ ID NO: 6)，Ubiquitin 基因啟動子(SEQ ID NO :1)，含有編碼上述 mNP-1 (SEQ ID NO 13)的基因以及NR基因表達框(SEQ ID NO :5)依次連接到載體的多克隆位點中，獲得表達載體 pGreen-NR-U-mNPlο在本發(fā)明的另一個方面，提供了宿主細胞，其包含上述的核酸或上述的表達載體。在本發(fā)明的又一個方面，提供了藥物組合物，其包含上述的短肽mNP-Ι或上述的編碼所述短肽mNP-Ι的核酸和任選地藥用載體。優(yōu)選地，所述的藥物組合物為溶液、片劑、 膠囊、霧劑、膏劑、粉劑或注射劑的形式。在本發(fā)明的又一個方面，提供了上述的短肽mNP-Ι或上述的編碼所述短肽 mNP-Ι的核酸在制備抗革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌藥物中的應用。在優(yōu)選的實施方案中，所述細菌是奈瑟氏菌屬(Neisseria),葡萄球菌屬(Staphylococcus),李斯特菌屬(Listeria),假單胞菌屬(Psdeuomnoda),埃希氏菌屬(Escherichia),克雷伯氏菌屬(Klebsiella),沙雷氏菌屬(Serratia),嗜血桿菌屬(Haemophilus),博德特氏菌屬(Bordetella),螺旋桿菌屬(Heliobacterium),鏈球菌屬(Streptococcus),不動桿菌屬(Acinetobacter),沙門氏菌屬(Salmonella)。更優(yōu)選地，所述細菌為淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),耐甲氧西林的金黃色葡萄菌(MRSA),銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),泛耐藥銅綠假單胞菌， 大腸桿菌(Escherichia coli),幽門螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum),肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)，沙門氏菌(Salmonella)，大腸桿菌(Escherichia coli)。在一個具體的實施方案中，所述的革蘭氏陰性菌為大腸桿菌(Escherichia coli),銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae),幽門螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum)和沙門氏桿菌(Salmonella)。在一個具體的實施方案中，所述的革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。


圖1. PBI221質粒結構圖。圖2. pbinUGUS質粒結構圖。圖3. pGreen0029 質粒結構圖。圖4. pGreen0029nos 質粒結構圖。圖5. pGreen0029-U-nos 質粒的結構圖。圖6. pGreen0029-U-mNPl-nos 質粒結構圖。圖7pGreen-NR-U_mNPl 質粒結構圖。圖8.電擊方法轉化橢圓小球藻硝酸還原酶功能缺失突變體得到的抗G418的藻落。圖9.NPTII基因PCR檢測結果。1泳道為陽性質粒，2泳道為未轉化藻株nrm_4 ; 3-11泳道為轉化藻株1-9 ；圖10. Ubi-mNP-1-Nos基因PCR檢測結果。1泳道為未轉化藻株nrm_4 ；2泳道為 陽性質粒；3-11泳道為轉化藻株1-9。圖11. Sephadex G-50的紫外吸收峰圖。圖12. Sephadex C-25的紫外吸收峰圖。圖13.從轉基因小球藻中純化mNP-1的電泳圖。1，4 :蛋白質分子量標準；2，3 :純 化的mNP-1 (箭頭所指)。圖14. mNP-1胰蛋白酶解肽段LC-MS分析結果。圖15. mNP-1對淋病奈瑟氏菌抑殺結果。圖16. mNP-1對金黃色葡萄球菌(藥敏質控菌)，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA)的抑殺結果。圖16A1為mNP-1對藥敏質控菌的抑菌試驗，圖16A2為mNP-1對MRSA 的抑菌試驗，其中試管編號1為培養(yǎng)基對照(以NC表示，即陰性對照)；編號2-8為不同濃 度(以U g/ml表示)mNP-l ;編號9為細菌對照(以PC表示，陽性對照)。細菌生長以“ + ” 表示，不生長以表示。圖16B頭孢西丁對金黃色葡萄球菌(藥敏質控菌)(上圖)和 MRSA(下圖)的抑菌試驗，其中試管編號1為培養(yǎng)基對照(以NC表示，即陰性對照)；編號 2-8為不同濃度(以y g/ml表示)頭孢西丁 ；編號9為細菌陽性對照，以PC表示。細菌生 長以“ + ”表示，不生長以表示。圖17. mNP-1對銅綠假單胞菌(藥敏質控菌)和臨床多重耐藥銅綠假單胞菌的抑 殺結果。圖17A1為mNP-1對銅綠假單胞菌(藥敏質控菌)的抑菌試驗。圖17A2為mNP_l 對臨床多重耐藥銅綠假單胞菌株的抑菌試驗。其中試管編號1為培養(yǎng)基對照(以NC表示， 即陰性對照)；編號2-8為不同濃度(以y g/ml表示)NP-1 ;編號9為細菌陽性對照，以PC 表示。細菌生長以“ + ”表示，不生長以表示。圖17B為頭孢他啶對銅綠假單胞菌(藥 敏質控菌，上圖)和銅綠假單胞菌臨床多重耐藥菌株的抑菌試驗(下圖)，其中試管編號1 為培養(yǎng)基對照(以NC表示，即陰性對照)；編號2-8為不同濃度(以yg/ml表示)NP-1 ;編 號9為細菌陽性對照，以PC表示。細菌生長以“ + ”表示，不生長以表示。圖18. mNP-1對大腸桿菌的抑殺結果，其中80 y g/ml-5 u g/ml表不mNP-1的濃度， CK表示大腸桿菌對照。
圖19.轉mNP-Ι小球藻提取液對大腸桿菌的抑殺結果,其中含50 μ g/ml mNP-1的小球藻提取液以“TC”表示；非轉基因小球藻(野生藻)提取液以“CK”表示。圖20. mNP-Ι對幽門螺旋桿菌的抑殺結果。圖21. mNP-Ι對肺炎鏈球菌的抑殺結果，CK表示細菌對照。圖22. 1-10%的人血清對mNP-Ι的抑殺大腸桿菌生長的活性沒有影響。圖23. mNP-Ι與從兔子中提取的天然NP-1對金黃色葡萄球菌抗菌效果比較結果。圖24. mNP-Ι與從兔子中提取的天然NP-I對肺炎鏈球菌抗菌效果比較結果。圖25. mNP-Ι與從兔子中提取的天然NP-I對銅綠假單胞菌抗菌效果比較結果。圖26. mNP-Ι與從兔子中提取的天然NP-I對大腸桿菌抗菌效果比較結果。
具體實施例方式下面參考實施例和附圖詳細描述本發(fā)明。本領域的普通技術人員可以理解的是， 下述實施例是舉例說明的目的，其不應以任何方式解釋為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護范圍由后附的權利要求所限定。各種限制性內切酶，DNA上樣緩沖液(6 X Loading Buffer)購自TaKaRa公司；普通 Taq酶，plus 2000 Maker，DNA純化回收試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司；T4DNA 連接酶購自NEB公司；葡萄糖及其他無機試劑均購自北京經科宏達生物技術有限公司；鮭魚精DNA購自Invitrogen公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，購自鼎國公司；SephadexG_50, Sephadex C-25 購自 pharmacia 公司。實施例I.橢圓小球藻硝酸還原酶突變體的表達載體構建方法根據Ubiquitin啟動子序列(SEQ ID NO 1)設計引物，上游引物5’ CCGGAAGCTT GTGCAGCGTGACCCG3’ (SEQ ID NO 2):下游引物5’ GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3 ’ (SEQ ID NO:
3)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位點(下劃線標出部分)，下游引物中加入BamH I酶切位點(下劃線標出部分)，用PCR方法從玉米基因組中得到Ubiquitin啟動子，測序結果顯示為Ubiquitin啟動子序列(SEQ ID NO :4，其在SEQ ID NO :1的5’端及3’端分別添加了 Hind III酶切位點和BamH I酶切位點)。PCR反應條件為94°C預變性3min， 94°C變性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸2min, 30個循環(huán)結束后，72°C延伸IOmin0將PCR產物2007bp大小的片段，用HindIII和BamHI內切酶雙酶切，質粒pBI221 (Clontech)(圖I) 也經HindIII和BamHI內切酶雙酶切，然后將兩雙酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在含有50mg/L氨芐霉素的LB培養(yǎng)基上37 °C倒置培養(yǎng)過夜，對長出的抗性菌落提取質粒進行Hind III和BamH I內切酶雙酶切鑒定，能夠得到1987bp大小片段(即 Ubiquitin啟動子)的質粒即命名為pbinUGUS(圖2)。實施例2.利用pGreen0029框架來構建表達載體。根據Nos終止子序列(SEQ ID NO 6)設計引物，上游引物:5，ATAAGAATGCGGCCGCTC GAATTTCCCCGATCGTTCAAAC3’ (SEQID NO 7)下游引物5，CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATAGATGA 3’(SEQ ID NO :8)其中在上游引物中加入Not I酶切位點(下劃線標出部分)，在下游引物中加入Sac I酶切位點(下劃線標出部分)，用PCR的方法從pBI221 (Clontech)中獲得了 Nos終止子，PCR反應條件為94 V預變性3min，94 V變性30s，56 V退火30s，72 °C延伸30s， 30個循環(huán)結束后，72°C延伸lOmin。將PCR產物268bp大小的片段，用Not I和Sac I內切酶雙酶切，質粒pGreen0029(圖3，來自BBSRC)也經Not I和Sac I內切酶雙酶切，然后將兩雙酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上37°C倒置培養(yǎng)過夜，對長出的抗性菌落提取質粒進行Not I和Sac I內切酶雙酶切鑒定，能夠得到270bp左右大小片段(即Nos終止子)的質粒即命名為pGreen0029nos (圖4)。實施例3.橢圓小球藻硝酸還原酶突變體的表達載體pGreen-NR-U-mNPl的構建.按照常規(guī)技術，將Ubiquitin啟動子(SEQ ID NO :I)從載體pbinUGUS(圖2) 中通過HindIII和BamHI雙酶切回收后，連接到同樣經過HindIII和BamHI雙酶切的 pGreen0029nos載體上(圖4)獲得pGreen0029-U_nos初級中間載體(圖5)。通過化學合成方法合成帶有目的基因mNP-Ι的序列(其序列如SEQ ID NO 13)，為提高NP-I的抗病毒活性，在合成的過程中，在NP-I的N端添加了一個甲硫氨酸，將NP-I改造成了 mNP-1， 因mNP-Ι基因太小，為方便構建載體，在該基因的C端添加了 75bp輔助序列，同時在基因的5’和3’端分別添上兩個酶切位點BamH I和Notl，最終得到合成的帶有mNP-Ι基因的 201bp序列(SEQ ID NO : 13)，將合成的序列(SEQ ID NO :13)通過BamH I和NotI雙酶酶切回收189bp的帶有mNP-1基因的片段，然后與經同樣經過BamH I和NotI雙酶酶切的載體 pGreen0029-U-N0S 連接(圖 5)，獲得載體 pGreen0029-U-mNPl-nos (圖 6)。最后通過HindIII酶切pSK-NR質粒(含有硝酸還原酶表達框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank，接收號為AY275834，NR表達框序列如SEQ ID NO 5所示，涉及pSK_NR質粒及NR表達框的專利公開號CN1676597)，回收4518bp NR表達框片段，單酶切NR表達框和載體pGreen0029-U-mNPl-N0S，然后將它們相連，則構建成橢圓小球藻硝酸還原酶突變體的 mNP-Ι 植物表達載體 pGreen-NR-U-mNPl (見圖 7)。實施例4.小球藻電擊轉化小球藻E4液體培養(yǎng)基見表4。小球藻固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基+7%瓊脂pH 5. 4 7. O。小球藻篩選培養(yǎng)基小球藻固體培養(yǎng)基的Na2NO2O. 69g/L替換為10mmol/L N03_，并添加抗生素G418至終濃度為15mg/L。取50ml對數生長期的硝酸還原酶突變體小球藻nrm-4(公開號CN 1676597A), 50 X g,離心 IOmin 離心收集藻細胞(Refrigerated Centrifuge CR 20B2, HIACHI);用高滲液(山梨醇O. 2M，甘露醇O. 2M)冰上處理l-3h ；50g離心IOmin,去上清，沉淀用5ml電擊緩沖液(山梨醇O. 2M，甘露醇O. 2M, KCL O. 08M, CaCL2O. 005M, HEPES O. 01M)懸浮，并用電擊緩沖液調細胞密度到I X IO6個/mL ;加入終濃度為10 μ g/mL的質粒pGreen-NR-Ubi_mNPl和 25 μ g/mL的鮭精DNA，混勻，冰上放置5_10min后電擊，取400 μ I混合好的小球藻細胞放入電擊杯中，電擊。脈沖電壓為6-10. 5KV，脈沖持續(xù)時間分別為O. 001-0. 2s，脈沖次數為21CI， 脈沖距離為2mm,循環(huán)周期為100。電擊后將小球藻轉入篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖8)。實施例5.轉基因小球藻的分子檢測a.轉基因小球藻總DNA的提取挑取平板上的單藻落細胞接種于15mg/L G418液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，(25°C，光照 25001ux，120rpm)。2周后(濃度達到約為I X IO8個/mL)，1600g離心IOmin收集藻細胞， 在液氮中將細胞磨碎，參照文獻Chen et al.，(2001)的方法提取小球藻總DNA，提取的DNA存于-20°C備用。b.轉基因小球藻的PCR檢測以轉基因藻基因組DNA為模板，分別進行NPTII基因(載體質粒pGreen0029中的卡那抗性基因，序列為SEQ ID NO 14)和Ubiquitin啟動子mNP-1-Nos終止子的PCR擴增。檢測 NPTII 基因的 PCR 引物為:正向引物 NPTII-f，5’GTCCTGATAGCGGTCCGCCAC3’ (SEQ ID NO 9);反向引物 NPTn-r，5' TCCGGTGCCCTGAATGAACT3，(SEQ ID NO :10)。PCR 反應條件為94°C預變性3min，94°C變性30s，57°C退火40s，72°C延伸Imin 30s，30個循環(huán)結束后，72°C延伸IOmin0可以擴增出約501bp的片段。Ubiquitin-mNPl-Nos的基因序列的 PCR 擴增，擴增的引物分別為Ubi-852-L :5’-GCTCCTTCGCTTTCCCTTCC-3’ (SEQ ID NO: 11) ;Nos-2429-R :5’-GCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCG-3’ (SEQ ID NO :12)。PCR 反應條件為 94°〇預變性311^11，941變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，30個循環(huán)結束后，72°C延伸 IOmin0可以擴增出約1578bp的DNA片段，即Ubiquitin-mNPl-Nos片段。共對9個藻株進行了檢測，檢測結果見圖9，10。轉化藻株1-9，能夠擴增出外源 NPTII基因，在轉化藻株1-4和6-9中能夠擴增出外源Ubiquitin-mNPl-Nos片段，在轉化藻株1-4和6-9中NPTII和Ubiquitin-mNPl-Nos片段都能夠擴增出來。證明NPTII和 Ubiquitin-mNPl-Nos片段PCR均為陽性的藻株為轉基因藻株，選取這些藻株進行液體擴繁培養(yǎng)，用以進一步檢測轉基因藻株的mNPl活性。實施例6.轉基因小球藻可溶性蛋白的提取用E4培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分見表4)培養(yǎng)轉基因藻，離心收集對數生長期(濃度約為I X IO8個/mL)的細胞，約3g濕藻重，然后按濕藻重無菌水=I : I進行混合。超聲破碎9s，間隔4s，破碎次數90次(JY92-II超聲細胞粉碎機，寧波)，沸水煮IOmin使大分子量蛋白質變性沉淀。4°C過夜后7500g離心lOmin，取上清液。表4培養(yǎng)基組成
權利要求
1.一種短肽mNP-1，其氨基酸序列為SEQ ID N0:16所示的序列。
2.編碼權利要求I所述短肽mNP-1的核酸，優(yōu)選地，其序列為SEQID NO: 15所示的序列。
3.表達載體或宿主細胞,其包含權利要求2所述的核酸。
4.藥物組合物，其包含權利要求I所述的短肽mNP-1或權利要求2所述的核酸和任選地藥用載體，優(yōu)選地，其為溶液、片劑、膠囊、霧劑、膏劑、粉劑、或注射劑的形式。
5.權利要求I所述的短肽mNP-1或權利要求2所述的核酸在制備抗細菌的藥物中的應用。
6.權利要求5所述的應用，其中所述的細菌為革蘭氏陽性細菌和/或革蘭氏陰性細菌。
7.權利要求6所述的應用，其中所述的細菌為奈瑟氏菌屬(Neisseria)，葡萄球菌屬(Staphylococcus),李斯特菌屬(Listeria),假單胞菌屬(Psdeuomnoda),埃希氏菌屬(Escherichia),克雷伯氏菌屬(Klebsiella),沙雷氏菌屬(Serratia),嗜血桿菌屬 (Haemophilus),博德特氏菌屬(Bordetella),螺旋桿菌屬(Heliobacterium),鏈球菌屬 (Streptococcus),不動桿菌屬(Acinetobacter),沙門氏菌屬(Salmonella)。
8.權利要求6所述的應用，其中所述細菌為上述屬中的具體的細菌。
9.權利要求6所述的應用，其中所述細菌為淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae), 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),耐甲氧西林的金黃色葡萄菌(MRSA),銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),泛耐藥銅綠假單胞菌,大腸桿菌(Escherichia coli),幽門螺旋桿菌(Heliobacterium chlorum),肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae),沙門氏菌(Salmonella)，大腸桿菌(Escherichia coli)。
10.生產權利要求I所述短肽mNP-1的方法，其特征在于在小球藻中表達序列為SEQID NO 15所示的核酸。
全文摘要
本發(fā)明利用小球藻表達了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表達的防御素對革蘭氏陰性菌和陽性菌等具有很強的抑制或殺滅作用，也可殺滅耐藥菌。本發(fā)明的結果可應用于制備抗革蘭氏陰性菌和陽性菌藥物，也可用于制備抗耐藥的超級細菌的藥物。
文檔編號A61K48/00GK102603885SQ20111044506
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權日2011年12月26日
發(fā)明者儲成才, 孫勇如, 孫永華, 宋麗英, 尹維波, 張建中, 張英濤, 彭宜紅, 楊鶴鳴, 白麗莉, 胡贊民, 趙世民, 陳凡, 陳宇紅 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所