Resolvin D1作為抗癲癇藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Resolvin D1作為抗癲癇藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癲癇(Epil印sy)是神經(jīng)系統(tǒng)僅次于腦卒中的第二大常見疾病，全世界有約5000萬人患有癲癇，我國的癲癇患者約有900多萬，每年的新發(fā)病人大于40萬，目前癲癇的治療仍以藥物為主要手段，其中，傳統(tǒng)的抗癲癇藥物有苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸、苯巴比妥、撲癇酮、乙琥胺、氯硝西泮；新型的抗癲癇藥物有托吡酯、拉莫三嗪、加巴噴丁、非氨酯、奧卡西平、氨已烯酸、替加賓、唑尼沙胺、左乙拉西坦、普瑞巴林。約75-80%患者使用以上抗癲癇藥物得以控制，但仍有25-30%癲癇患者藥物治療無效。這不僅給癲癇患者的身心健康帶來嚴(yán)重的影響，也給家屬帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并帶來一系列心理社會問題。近年來癲癇與炎癥的關(guān)系是癲癇領(lǐng)域的熱點問題，并且有大量研究發(fā)現(xiàn)癲癇與炎癥關(guān)系十分密切。然而，癲癇發(fā)作的機(jī)制尚未完全闡明，因此，研究癲癇發(fā)病機(jī)制并尋找新的更加安全有效、不良反應(yīng)少的抗癲癇藥物顯得尤為重要。
[0003]Resolvin D1 (消退素D1)是由ω-3多不飽和脂肪酸DHA衍生的消退素家族中的重要一員。消退素D1 (Resolvin D1)能抑制細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的活性，從而抑制過度的中性粒細(xì)胞向組織浸潤，降低炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。消退素D1還能對脂多糖(LPS)介導(dǎo)的小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用，也通過中樞或者外周機(jī)制減輕炎癥性疼痛，改善小鼠缺血再灌注損傷以及控制小鼠動脈粥樣硬化形成等作用。但Resolvin D1在癲癇導(dǎo)致的腦組織損傷是否有保護(hù)作用，目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供Resolvin D1作為抗癲癇藥物的應(yīng)用，將Resolvin D1作為抗炎癥、抗癲癇藥物，能降低受損腦細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
Resolvin D1作為抗癲癇藥物的應(yīng)用。
[0006]所述Resolvin D1通過增加內(nèi)源性抗粘附分子DEL-1的表達(dá)、降低IL-17含量而作為抗炎、抗癲癇的藥物。
[0007]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
本發(fā)明利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，首次提出了 DEL-1在癲癇發(fā)作后人腦脊液、血清及鼠腦組織中的表達(dá)下調(diào)。并涉及3 μ g/kg的Resolvin D1對癲癇大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制。所述Resolvin D1對氯化鋰匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠有抗癲癇作用，具有抗炎癥反應(yīng)性能，其機(jī)制可能為顯著增加DEL1表達(dá)，降低IL-17含量等途徑降低癲癇大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生對癲癇大鼠的腦保護(hù)作用。
【附圖說明】
[0008]圖1為癲癇發(fā)作后人腦脊液中DEL1的ELISA檢測結(jié)果，顯示癲癇發(fā)作后人腦脊液中DEL1的表達(dá)含量與對照組相比顯著下降< 0.001)。
[0009]圖2為癲癇發(fā)作后人血漿中DEL1的ELISA檢測結(jié)果，顯示癲癇發(fā)作后人血漿中DEL1的表達(dá)含量與對照組相比顯著下降(***P < 0.001)。
[0010]圖3為Western Blot檢測DELI在人腦脊液中的表達(dá)結(jié)果，顯示癲癇發(fā)作后人腦脊液中DEL1水平與對照組相比顯著下降(***P < 0.001)。
[0011]圖4為Western Blot檢測DELI在大鼠海馬組織中的表達(dá)結(jié)果，顯示癲癇發(fā)作后大鼠海馬組織DEL1的表達(dá)量與對照組相比明顯下降，且resolvin D1可顯著增加DEL1在癲癇大鼠海馬組織中的表達(dá)量(#*P < 0.001)。
[0012]圖5為癲癇發(fā)作后人腦脊液中IL-17的ELISA檢測結(jié)果，顯示癲癇發(fā)作后人腦脊液中IL-17的表達(dá)含量與對照組相比顯著增加(***P < 0.001)。
[0013]圖6為癲癇發(fā)作后人血漿中IL-17的ELISA檢測結(jié)果，顯示癲癇發(fā)作后人血漿中IL-17的表達(dá)含量與對照組相比顯著增加(*#P < 0.001)。
[0014]圖7為Western Blot檢測IL-17在大鼠海馬組織中的表達(dá)結(jié)果，顯示癲癇發(fā)作后大鼠海馬組織IL-17的表達(dá)量與對照組相比明顯增加，且resolvin D1可顯著抑制IL-17在癲癇大鼠海馬組織中的表達(dá)量(***P < 0.001)。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0016]本發(fā)明涉及3 μ g/kg的Resolvin D1對癲癇大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制。所述Resolvin D1對氯化鋰匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠有抗癲癇作用，具有抗炎癥反應(yīng)性能，其機(jī)制可能為顯著增加DEL1表達(dá)，降低IL-17含量等途徑降低癲癇大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生對癲癇大鼠的腦保護(hù)作用。
[0017]Resolvin D1具有抗炎反應(yīng)及抗癲癇作用的實驗:
1.病例(樣本)選擇方法:
人腦脊液及血清:收集2013年12月到2014年12月入住西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者共35人，并分為癲癇組25人和對照組10人。所有患者及家屬取得本研究的知情同意，并在24h內(nèi)進(jìn)行研究評估，及血清及腦脊液的采集。收集近期(24h內(nèi))有癲癇發(fā)作的癲癇患者20例，及符合標(biāo)準(zhǔn)的對照組患者20例。
[0018]入選標(biāo)準(zhǔn):凡24h內(nèi)因癲癇發(fā)作入住我科的患者，發(fā)作類型參照1981年國際抗癲癇聯(lián)盟有關(guān)癲癇發(fā)作分類的規(guī)定進(jìn)行分類。對照組:因頭痛、周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病、原發(fā)性癡呆、繼發(fā)記憶障礙等入住我科各項檢查提示沒有炎性疾病的患者。所有對照組病人進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)常規(guī)檢查，并進(jìn)行后期腦脊液分析。
[0019]排除標(biāo)準(zhǔn):癲癇發(fā)作是由明確病因引起的患者不納入研究，如電解質(zhì)紊亂，代謝紊亂，藥物中毒，感染，MRI檢查提示有新鮮病灶等；腰穿提示腦脊液顏色不清亮或含有血細(xì)胞其他疾病待排的標(biāo)本不納入研究。
[0020]符合入組標(biāo)準(zhǔn)的患者在癲癇發(fā)作后行2%的利多卡因局麻下L3-4或L4-5椎間隙腰椎穿刺術(shù)，留取腦脊液5ml，經(jīng)3000r/min離心20min后留取上清分裝，置于_80°C冰箱待后續(xù)實驗用。血清:空腹肘靜脈采血5ml，3000r/min離心20min后留取上清液，分裝入小的離心管中，立即放人-80°C冰箱，待后續(xù)實驗用。
[0021]2.動物模型制備:選擇健康雄性SD大鼠(出生后6-8周，體重220_2600g)為研究對象，由動物中心提供，飼養(yǎng)于正常晝夜環(huán)境中，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水。采用Costa-Ferro等沿用的方法:a.按127mg/kg的劑量依次腹腔注射氯化鋰；b.20h后腹腔注射阿托品(0.1mg/kg)以降低匹羅卡品外周膽堿能反應(yīng)；c.注射阿托品30min后，按40mg/kg的劑量腹腔注射匹羅卡品；d.半小時后開始觀察大鼠癲癇發(fā)作的程度(依據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn):0.無任何反應(yīng)；1.面部陣攣，眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等；I1.1級加節(jié)律性點頭；111.1I級加前肢陣攣；IV.1II級加后肢站立；V.1V級加摔倒)；e.V級發(fā)作的SD大鼠隨機(jī)納入實驗，V級以下或未發(fā)作的SD大鼠剔除本實驗；f.癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE) 90min后，腹腔注射地西泮(10mg/kg)終止癲癇發(fā)作。而生理鹽水組大鼠經(jīng)皮下注射相同劑量的生理鹽水。Resolvin D1 (Cayman武漢艾美捷科技有限公司)在癲癇持續(xù)狀態(tài)終止后30分鐘經(jīng)尾靜脈給予Aesolvin D1溶解于0.9%的生理鹽水，每只大鼠注射總量不超過1ml，在給藥后24h進(jìn)行檢測。
[0022]3酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定腦脊液和血漿中DEL-1和IL-17水平:
人DEL-1及IL-17 ELISA試劑品牌均為Cusab1 (武漢華美，中國)，對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在450nm波長測量吸光度(0D值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)0D值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，再根據(jù)樣品的0D值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。
[0023]4蛋白質(zhì)印記法(Western Blot)檢測腦脊液及大鼠海馬區(qū)DEL-1水平:
探討DEL-1在人腦脊液和大鼠海馬中的表達(dá)水平，我們首先把冷凍標(biāo)本稱重，放入干燥清潔的勻漿器中，加入含有PMSF的RIPA裂解緩沖液，勻漿后4°C離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘，取上清。采用BCA定量測定試劑盒(Bestb1，中國)進(jìn)行定量檢測樣品蛋白含量。之后我們使用標(biāo)準(zhǔn)的15%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉，孵育多克隆兔抗大鼠DEL-1抗體(腦脊液1:1000，腦組織1:2500，武漢三鷹，中國)，室溫孵育一小時，4°C過夜，然后用HRP結(jié)合的山羊抗兔抗體在室溫下孵育一個半小時(稀釋1:800，CST，美國)。我們應(yīng)用β -actin作為內(nèi)參抗體(稀釋度1:300，武漢博士德，中國)，最后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法定量(Pierce，美國)，X_光片曝光，顯影、定影后室溫晾干膠片掃描分析灰度值。
[0024]5統(tǒng)計結(jié)果分析:
數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土SD)表示。應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組和對照組、實驗組和實驗組之間比較采用方差分析(AN0VA)和t檢驗。以a=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P < 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0025]實驗結(jié)果:
1.人腦脊液及血漿DEL1和IL-17的表達(dá)
DEL1是內(nèi)源性的抗白細(xì)胞粘附因子，圖1、圖2 (ELISA)和圖3 (Western blot)可見，癲癇病人腦脊液及血漿中DEL1的表達(dá)顯著低于對照組DEL1的水平(P < 0.001)。
[0026]IL-17是癲癇發(fā)生發(fā)展中重要的炎性介質(zhì)，圖5和圖6 (ELISA)可見，癲癇病人腦脊液及血漿中IL-17的表達(dá)水平與對照組相比顯著增加(P < 0.001)。
[0027]2.大鼠海馬中DEL1和IL-17的表達(dá)
圖4 (Western blot)可見DELI在癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬中的表達(dá)明顯低于正常大鼠(P < 0.001)，且Resolvin D1可顯著增加DELI在癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬的表達(dá)。
[0028]圖7(Western blot)可見在IL-17在癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬中的表達(dá)明顯高于正常大鼠(P < 0.001)，且Resolvin D1可顯著降低IL-17在癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬的表達(dá)。
[0029]本發(fā)明通過上述實例的研究表明，癲癇發(fā)生后人腦脊液、血清及鼠腦組織中內(nèi)源性抗白細(xì)胞粘附因子DEL-1的表達(dá)明顯降低，炎癥因子IL-17的表達(dá)明顯增加，而ResolvinD1可顯著增加大鼠腦內(nèi)癲癇后DEL1的表達(dá)，并且顯著降低IL-17的表達(dá)，這提示ResolvinD1是DELI的激動劑，也具有拮抗IL-17的功能。本發(fā)明對新型抗癲癇藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，Resolvin D1可成為癲癇治療的一個新的革巴點。
[0030]本發(fā)明的內(nèi)容不限于實施例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1.Resolvin D1作為抗癲癇藥物的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ResolvinD1作為抗癲癇藥物的應(yīng)用，其特征在于: 所述Resolvin D1通過增加內(nèi)源性抗粘附分子DEL-1的表達(dá)、降低IL-17含量而作為抗炎、抗癲癇的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及Resolvin？D1作為抗癲癇藥物的應(yīng)用。Resolvin？D1具有強(qiáng)效的抗炎和促進(jìn)炎癥吸收作用，但其在癲癇導(dǎo)致的腦組織損傷是否有保護(hù)作用，目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本發(fā)明提供了Resolvin？D1作為治療癲癇病藥物的應(yīng)用，所述Resolvin？D1通過增加內(nèi)源性抗粘附分子DEL-1的表達(dá)、降低IL-17含量而作為抗炎、抗癲癇的藥物<b>。</b>
【IPC分類】A61P25/08, A61P29/00, A61K31/232
【公開號】CN105287480
【申請?zhí)枴緾N201510709415
【發(fā)明人】李亞軍, 孟芳霖
【申請人】西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年10月28日