專利名稱：用于因子xa抑制劑的解毒劑和其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及因子敘^乂幻衍生物的用途，所述因子fe(fXa)衍生物具有降低的固有促凝血活性或沒有固有促凝血活性，但能夠結(jié)合和/或中和fXa抑制劑，由此作為靶向 fXa的抗凝血?jiǎng)┑慕舛緞?br> 背景技術(shù)：
市場(chǎng)上在治療或預(yù)防在不活動(dòng)時(shí)或正接受醫(yī)療手術(shù)時(shí)易于形成血凝塊的患者 (例如，那些患有凝血病癥的患者)的不期望血栓形成時(shí)需要抗凝血?jiǎng)?。然而，抗凝血療法的一個(gè)重要限制是與治療有關(guān)的出血風(fēng)險(xiǎn)，且在服用過量或如果需要緊急手術(shù)的情況下限制了迅速逆轉(zhuǎn)抗凝血活性的能力。因此，業(yè)內(nèi)極為期望針對(duì)所有形式的抗凝血療法的特定且有效解毒劑。出于安全考慮，同樣有利的是在研發(fā)新的抗凝血?jiǎng)┧幬镏蝎@得抗凝血?jiǎng)?解毒劑對(duì)。目前對(duì)于過度抗凝血可用的抗凝血?jiǎng)?解毒劑對(duì)是肝素-魚精蛋白和華法林 (warfarin)-維生素K。新鮮的冷凍血漿和重組因子VIIa(rfVIIa)也已用作在低分子量肝素治療中正經(jīng)受嚴(yán)重創(chuàng)傷或嚴(yán)重失血的患者的非特異性解毒劑。(勞里岑(LaUritzen，B.) 等人，血液(Blood), 2005，607A-608A。)還報(bào)導(dǎo)了魚精蛋白片段(美國(guó)專利第6，624，141 號(hào))和小的合成肽(美國(guó)專利第6，200，955號(hào))作為肝素或低分子量肝素解毒劑；和凝血酶突變蛋白質(zhì)(美國(guó)專利第6，060, 300號(hào))作為凝血酶抑制劑的解毒劑。已報(bào)導(dǎo)將凝血酶原中間產(chǎn)物和衍生物作為水蛭素和合成凝血酶抑制劑的解毒劑(美國(guó)專利第5，817，309號(hào)和第 6，086，871 號(hào))?？鼓煼ǖ囊环N有希望的形式靶向因子fe(fXa)，且實(shí)際上，目前在臨床研發(fā)的不同階段中有多種直接《a抑制劑用于抗凝血療法中。這些中的大多數(shù)是小分子。盡管這些新的《a抑制劑展示有希望用于治療，但仍需要特定且有效的解毒劑。在過度抗凝血或利用這些《a抑制劑治療的患者需要手術(shù)的情況下，可能需要一種試劑來實(shí)質(zhì)上中和所投與的一種或多種fXa抑制劑并恢復(fù)正常止血。目前可用試劑(例如重組因子Vila(rfVIIa))是以機(jī)械方式進(jìn)行限制且并非特定用于ffe抑制劑的逆轉(zhuǎn)且因此臨床醫(yī)生極為期望經(jīng)改良的方案。在人類研究中，已經(jīng)使用 rfVIIa來逆轉(zhuǎn)間接抗凝血酶III依賴性《Ca抑制劑(例如磺達(dá)肝素(fondaparinux)和伊達(dá)肝素(idraparinux))的作用(比斯特沃特(Bijsterveld，NR)等人，循環(huán)(Circulation)， 2002,106 :2550-2554 ；比斯特沃特(Bijsterveld, NR)等人，英國(guó)血液病學(xué)雜志(British J. of Haematology), 2004 (124) :653-658)。因子 Vlla(fVIIa)的作用機(jī)制是與組織因子一起作用將血液循環(huán)中存在的因子X(fX)轉(zhuǎn)化成《a來恢復(fù)患者的正常止血。必須說明的是， 這種作用模式可能達(dá)到以中和活性位點(diǎn)定向《a抑制劑的fXa的最高可能濃度受fX的循環(huán)血漿濃度限制。因此，使用rfVIIa來逆轉(zhuǎn)直接《Ca抑制劑的作用的潛力機(jī)械上受限。由于fX的循環(huán)血漿濃度為150毫微摩爾(“nM”)，所以通過這種模式所產(chǎn)生的fXa的最大量將為150nM。因此，使用rfVIIa來逆轉(zhuǎn)直接ffe抑制劑的作用的潛力機(jī)械上受限。小分子 fi(a抑制劑(例如利伐沙班(rivaroxaban))的報(bào)告治療濃度(大約600nM，庫比察(Kubitza D)等人，歐洲臨床藥理學(xué)雜志(Eur. J. Clin. Pharmacol)，2005，61 :873-880)高于由 rfVIIa 所生成的fXa的可能量。因此，使用rfVIIa來逆轉(zhuǎn)由《a抑制劑所產(chǎn)生的治療或超治療水平的抗凝作用將提供不充分的效能水平。如圖4中所示，在中和因子敘抑制劑貝特沙班 (betrixaban)的抗凝血活性中使用rfVIIa具有有限的作用(如下文所闡述)。重組fVIIa 展示50nM至IOOnM的劑量反應(yīng)解毒活性，但所述作用在IOOnM至200nM之間趨于穩(wěn)定，此表明其解毒作用受除其濃度以外的因素的限制。在所有所測(cè)試的rfVIIa濃度中，貝特沙班在250nM的濃度下仍展示fXa的劑量反應(yīng)抑制(高達(dá)約75%抑制)。此觀察結(jié)果與fVIIa 的建議作用機(jī)制一致。此結(jié)果還被展示rfVIIa不能完全逆轉(zhuǎn)磺達(dá)肝素對(duì)凝血酶生成和凝血酶原活化的參數(shù)的抑制作用的研究所支持。(吉偌提法斯(Gerotiafas，GT)等人，血栓形成和止血(Thrombosis &Haemostasis) 2204 (91) :531-537)。外源活性fXa不能以類似于rfVIIa的方式直接投與個(gè)體。不像rfVIIa在缺少其輔因子組織因子的情況下具有極低促凝血活性那樣，天然fXa是強(qiáng)效酶且具有造成血栓形成的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，使用rfVIIa或活性《Ca作為《Ca抗凝血療法的解毒劑具有許多缺點(diǎn)。因此，需要經(jīng)改良的解毒劑，其不會(huì)造成不期望的血栓形成且在《Ca抑制劑服用過量的情況下或在需要恢復(fù)正常止血以阻止或停止出血的情況下有效地實(shí)質(zhì)上中和fXa 抑制劑的抗凝血活性。本文所提及的任何及所有出版物、專利和專利申請(qǐng)案均以整體引用的方式并入本文中。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，投與fXa蛋白質(zhì)的經(jīng)修飾衍生物可用作靶向fXa的抗凝血?jiǎng)┑慕舛緞?。所述《a蛋白質(zhì)的經(jīng)修飾衍生物并不與fXa競(jìng)爭(zhēng)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物，而是結(jié)合和/或?qū)嵸|(zhì)上中和抗凝血?jiǎng)?例如fXa抑制劑)?？捎米鹘舛緞┑难苌锝?jīng)修飾以降低或去除固有的促凝血和抗凝血活性，同時(shí)保留結(jié)合至抑制劑的能力。預(yù)計(jì)本發(fā)明的衍生物可包括修飾活性位點(diǎn)、或改變Gla結(jié)構(gòu)域或自《a去除整個(gè)Gla結(jié)構(gòu)域、或其各種組合。由于已知活性位點(diǎn)經(jīng)修飾的全長(zhǎng)fXa是抗凝血?jiǎng)?，因此進(jìn)一步預(yù)計(jì)修飾Gla結(jié)構(gòu)域?qū)⒔档突蛳齠Xa衍生物對(duì)正常止血的抗凝血作用。進(jìn)一步預(yù)計(jì)，修飾fXa的EGF結(jié)構(gòu)域(通過EGF1、EGF2、或EGFl和EGF2兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的缺失或取代)提供用于本發(fā)明方法的衍生物。EGF結(jié)構(gòu)域修飾可單獨(dú)實(shí)施或連同Gla 結(jié)構(gòu)域修飾一起實(shí)施。
在一個(gè)實(shí)施例中，衍生物保留結(jié)合靶向fXa的抗凝血?jiǎng)?或《a抑制劑)所需的結(jié)構(gòu)特性。通過衍生物直接或間接結(jié)合抑制劑，抑制劑實(shí)質(zhì)上被中和。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供阻止或降低正利用因子敘抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的因子fe蛋白質(zhì)衍生物，所述衍生物結(jié)合至因子敘抑制劑但不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施例中，衍生物具有一個(gè)或一個(gè)以上的以下性質(zhì)降低的促凝血活性或沒有促凝血活性；經(jīng)修飾或去除的Gla結(jié)構(gòu)域；和經(jīng)修飾的活性位點(diǎn)。本發(fā)明的衍生物選擇性地結(jié)合并抑制以外源方式投與的因子fe抑制劑，由此實(shí)質(zhì)上中和《a抑制劑的抗凝血活性。此方法涵蓋活體外和活體內(nèi)方法二者。本發(fā)明所涵蓋的對(duì)因子)(a蛋白質(zhì)的各種修飾可在整個(gè)具體實(shí)施方式
中找到。應(yīng)了解，本發(fā)明所涵蓋的衍生物不是血漿源性因子Vila、重組因子Vila、新鮮冷凍血漿、凝血酶原復(fù)合物濃縮物、或全血。本發(fā)明的一個(gè)方面是使用因子)(a衍生物和含有其的組合物來治療已接受或正利用因子fe抑制劑接受過度抗凝血療法的患者或之前已投與因子fe抑制劑且然后需要止血的患者(例如非急需或急診手術(shù)可能需要)。在一個(gè)方面中，經(jīng)修飾《a蛋白質(zhì)不同于天然存在的fXa，這是因?yàn)槠渚哂薪档偷墓逃写倌钚曰蛳逃写倌钚郧覍⒉粫?huì)妨礙在止血方面的生理fXa功能，同時(shí)仍能夠結(jié)合并實(shí)質(zhì)上中和fXa抑制劑。在另一方面中，經(jīng)修飾的因子敘蛋白質(zhì)是與能夠延長(zhǎng)所述因子敘衍生物的血漿半壽期(或循環(huán)半壽期)的試劑共同投與。在又一方面中，解毒劑與一個(gè)部分偶聯(lián)以延長(zhǎng)其血漿半壽期。還提供含有因子衍生物的醫(yī)藥組合物，所述因子fe衍生物結(jié)合(和/或?qū)嵸|(zhì)上中和)因子)(a抑制劑，但不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。所述醫(yī)藥組合物任選地包含醫(yī)藥上可接受的載劑。在另一方面中，本發(fā)明提供試劑盒，其包含用于抗凝血用途的《Ca抑制劑和當(dāng)需要實(shí)質(zhì)上中和fXa抑制劑的抗凝血活性時(shí)使用的fXa抑制劑解毒劑(或因子fe衍生物)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 12或與SEQ ID NO. 12具有至少80%同源性的多肽。另一實(shí)施例涉及分離的雙鏈多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或與SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽。再一實(shí)施例涉及分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 15或與SEQ ID N0. 15具有至少80%同源性的多肽。還提供包含載劑和剛剛所闡述多肽的醫(yī)藥組合物。還提供編碼剛剛所闡述多肽的多核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供肽偶聯(lián)物，其包含以共價(jià)或非共價(jià)方式連接至剛剛所闡述多肽的載劑。載劑可為脂質(zhì)體、膠束、醫(yī)藥上可接受的聚合物、或醫(yī)藥上可接受的載劑。本發(fā)明還涉及結(jié)合剛剛所闡述多肽的抗體。所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、 嵌合抗體或人源化抗體。還提供抗體的生物活性片段。所述抗體可以可檢測(cè)方式標(biāo)記。所述抗體(或抗體片段)還作為組合物的一部分提供，所述組合物進(jìn)一步包含載劑。在一個(gè)實(shí)施例中提供抗體-肽復(fù)合物，其包含本發(fā)明的抗體和特異性結(jié)合至所述抗體的多肽。所述多肽是受到對(duì)抗可產(chǎn)生所述抗體的多肽。所述抗體可為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在另一實(shí)施例中提供制備本發(fā)明多肽的方法，其包含在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞且尤其是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell)。在一個(gè)實(shí)施例中，重鏈(SEQ ID NO. 15)表達(dá)于原核細(xì)胞(例如大腸桿菌(E.coli))中。在另一實(shí)施例中，多肽經(jīng)分離。在再一實(shí)施例中提供分離的原核或真核宿主細(xì)胞，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述宿主細(xì)胞在組合物中，所述組合物進(jìn)一步包含載劑。在又一實(shí)施例中提供阻止或降低正利用因子敘抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的組合物，所述組合物包含本發(fā)明的多肽和載劑。 進(jìn)一步提供選擇性結(jié)合并抑制正進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體中以外源方式投與的因子)(a抑制劑，其包含向所述個(gè)體投與有效量的剛剛所闡述的組合物。


圖1示意性地展示表1中所示的人類因子X (SEQ ID NO. 1)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，如在李塔斯(Leytus)等人，生物化學(xué)(Biochem.)，1986，25，5098-5102 中所報(bào)告。SEQ ID NO. 1 是由表2中所示的人類fX的核苷酸序列(SEQ ID N0. 2)編碼的人類fX的氨基酸序列， 如此項(xiàng)技術(shù)中所習(xí)知。例如，經(jīng)翻譯的氨基酸序列報(bào)告于李塔斯等人(Leytus)，生物化學(xué)(Biochem.)，1986，25, 5098-5102 中且可在 <http //www, ncbi. nlm. nih. gov/entrez/ viewer, fcgi ？ db = nuccore&id = 89142731〉的基因庫(GenBank)，“NM_000504”中找至Ij。 此序列中的氨基酸編號(hào)是基于fX序列。人類fX前體(SEQ ID NO. 1)含有前導(dǎo)序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸1至40)，隨后是對(duì)應(yīng)于fX輕鏈(LC)的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸41至 179)、在fX分泌期間去除的RKR三聯(lián)體的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸180至182)、和fX 重鏈的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸183至488)，所述重鏈含有激活肽(AP) (SEQ ID NO. 1 的氨基酸183至234)和催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO. 1的氨基酸235至488)。圖2(SEQ ID NO. 3)展示成熟人類因子X的氨基酸序列。此圖中氨基酸編號(hào)是基于成熟fx序列自fx輕鏈的N-末端開始。因子X在血漿中作為通過二硫鍵連接的雙鏈分子循環(huán)。輕鏈(LC)具有139個(gè)氨基酸(SEQ ID NO. 1的氨基酸41至179)殘基且含有富 Y-羧基谷氨酸(Gla)的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0. 3的1_45)(包括短芳香族堆棧(AS) (SEQ ID NO. 3的氨基酸40-45))，之后是兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域(EGF 1 =SEQ ID N0. 3的氨基酸46-84，EGF2 SEQ ID N0. 3氨基酸85-1 )。重鏈(HC)具有306個(gè)氨基酸且含有52 個(gè)氨基酸激活肽(AP =SEQ ID N0. 3的氨基酸143-194)，然后是催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0. 3的氨基酸195-448)。糜蛋白酶編號(hào)中的H57-D102-S195的催化三元體等效物位于fX序列中的 His236、Asp282、和 Ser379 處并加下劃線(SEQ ID N0. 3 的氨基酸 236,282 和 379)。圖3示意性地展示圖2中所示的成熟人類因子X的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。此圖中的氨基酸編號(hào)是基于成熟fx序列。突出顯示用于糜蛋白酶消化以去除含Gla-結(jié)構(gòu)域的片段(SEQ ID N0. 3的氨基酸1-44)和用于fX激活以去除激活肽的切割位點(diǎn)。糜蛋白酶消化《3產(chǎn)生缺少1-44氨基酸殘基的無Gla結(jié)構(gòu)域fXa(SEQ ID NO. 4)。圖4展示在凝血酶生成(表示為相對(duì)熒光單位(RFU))分析中在組織因子的存在下各種濃度的rfVIIa對(duì)《Ca抑制劑貝特沙班(如下文所述)的抗凝血活性的影響(如實(shí)例2中所述))。數(shù)據(jù)顯示，rfVIIa和組織因子的組合在高達(dá)200nM的濃度下不能完全中和 fXa抑制劑貝特沙班的抗凝血活性。
圖5展示在含活性fXa和貝特沙班(空心圓)的純化系統(tǒng)中Gla-結(jié)構(gòu)域完整的酐_fXa逆轉(zhuǎn)貝特沙班的fXa抑制作用，而與活性fXa相比，僅酐-fXa的促凝血活性(空心三角)可忽略。將fXa發(fā)色活性標(biāo)準(zhǔn)化成在無任何抑制劑的情況下的活性fXa(空心正方形)。此更充分地闡述于實(shí)例2中。數(shù)據(jù)表明，酐對(duì)于fla底物無活性，但仍保留fXa 抑制劑結(jié)合能力。圖6展示在血漿凝血酶生成(表示為相對(duì)熒光單位(RFU))分析(如實(shí)例2中所述)中，圖5中具有完整Gla結(jié)構(gòu)域的酐-ffe是有效抑制劑。其在115nM約時(shí)幾乎完全抑制凝血酶生成。數(shù)據(jù)表明，Gla-結(jié)構(gòu)域未修飾的酐-fXa并不適于用作fXa抑制劑解毒劑。圖7展示在96孔板格式中活性fXa的凝血活性在糜蛋白酶消化之前和在糜蛋白酶消化15分鐘和30分鐘之后的比較。如此圖中所示，凝血時(shí)間(0D405的變化)在《Ca被糜蛋白酶消化15分鐘之后明顯延遲，且當(dāng)fXa被消化30分鐘時(shí)有長(zhǎng)達(dá)20分鐘的時(shí)間未觀察到凝血。此結(jié)果還用于建立糜蛋白酶消化酐_fXa的條件，這是因?yàn)樵谙陂g可監(jiān)測(cè)到酐_fXa沒有活性。此更充分地闡述于實(shí)例3中。圖8展示去Gla的酐-fXa對(duì)因子)(a抑制劑貝特沙班的結(jié)合親和力，如實(shí)例4中所闡述。數(shù)據(jù)表明，通過糜蛋白酶消化酐所制備以去除含Gla-結(jié)構(gòu)域的片段(殘基1-44)的去Gla的酐- a能夠以與天然fla類似的親和力結(jié)合貝特沙班(fXa :Ki = 0. 12nM,去 Gla 的酐-fXa :Kd = 0. 32nM)。圖9展示，在實(shí)例2的凝血酶生成分析中，通過添加濃度為680nM的解毒劑(去Gla 的酐_fXa)逆轉(zhuǎn)不同濃度貝特沙班的抗凝血活性。在濃度為680nM時(shí)，去Gla的酐-fXa能夠產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上完全的fXa活性恢復(fù)。圖10展示，在凝血延長(zhǎng)分析中使用aPTT試劑在96孔板格式(如實(shí)例3中所述)， 通過不同濃度的解毒劑(去Gla的酐-fXa)逆轉(zhuǎn)250nM貝特沙班的抗凝血活性。數(shù)據(jù)表明， 當(dāng)使用約608nM的解毒劑來中和250nM的fXa抑制劑貝特沙班時(shí)，凝血時(shí)間與對(duì)照貧血小板血漿的凝血時(shí)間相當(dāng)。圖11展示，在凝血延長(zhǎng)分析中使用aPTT試劑在96孔板格式中，563nM的解毒劑 (去Gla的酐-fXa)對(duì)依諾肝素(enoxaparin) (0. 3125-1. 25U/mL)的抗凝血活性的影響，其表示為標(biāo)準(zhǔn)化之后的倍數(shù)變化。分析方案闡述于實(shí)例3中。數(shù)據(jù)表明，添加563nM的解毒劑明顯中和低分子量肝素依諾肝素的活性。圖12展示在發(fā)色分析中解毒劑(去Gla的酐-fXa)對(duì)凝血酶(5nM)活性的作用和50nM阿加曲班(argatroban)( 一種特異性凝血酶抑制劑)對(duì)其的抑制作用。正如所預(yù)期，fXa抑制劑的解毒劑在高達(dá)538nM濃度下不會(huì)以可檢測(cè)方式影響凝血酶活性或所述特異性抑制劑阿加曲班對(duì)其的抑制作用。此更充分地闡述于實(shí)例14中。圖13展示，在aPTT分析中使用標(biāo)準(zhǔn)凝血計(jì)時(shí)器通過改變解毒劑去Gla的酐-fXa 的濃度對(duì)400nM貝特沙班抗凝血活性的影響。分析方案闡述于實(shí)例3中。數(shù)據(jù)展示，《3抑制劑的解毒劑實(shí)質(zhì)上400nM貝特沙班對(duì)fXa的抑制作用。據(jù)估計(jì)，在400nM貝特沙班的情況下，解毒劑的EC5tl為約656nM。圖14展示CHO細(xì)胞中用于表達(dá)fXa三重突變體(SEQ ID NO. 12)的DNA構(gòu)建體的圖。將質(zhì)粒DNA線性化并轉(zhuǎn)染至CHO dhfr(-)細(xì)胞中。使用四氫葉酸酯(HT)缺乏的培養(yǎng)基加甲氨蝶呤(MTX)來選擇細(xì)胞。通過ELISA來針對(duì)高蛋白質(zhì)表達(dá)篩選穩(wěn)定克隆。在無血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生《a三重突變體并通過離子交換與親和柱的組合來純化。圖中的編號(hào)是基于編碼人類fX SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列進(jìn)行。例如，活性位點(diǎn)S419(SEQ ID NO. 1)處的丙氨酸突變等效于成熟人類fX的S379(SEQ ID NO. 3)處的突變，如整個(gè)申請(qǐng)案且更具體地實(shí)例7所討論。圖15展示分別使用識(shí)別fX重鏈和輕鏈的單克隆抗體純化的r-解毒劑的西方印跡(Western blot)。當(dāng)將連接輕鏈和重鏈的二硫鍵還原后，r_解毒劑重鏈以類似于血漿源性fXa的預(yù)計(jì)分子量遷移。與正常FXa相比，fXa突變體的Gla-結(jié)構(gòu)域中缺失6_39aa使得r-解毒劑輕鏈的分子量帶較低。圖16展示經(jīng)口單獨(dú)投與貝特沙班(15mg/kg)、或經(jīng)口投與貝特沙班(15mg/kg)然后靜脈注射(300 μ g，IV)根據(jù)實(shí)例1制得的血漿源性解毒劑(Pd-解毒劑)之后小鼠(η =7-10/組)中的貝特沙班血漿水平。pd-解毒劑是在1. 5小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)之前5分鐘時(shí)投與，并在經(jīng)口投與貝特沙班之后1. 5,2. 0和4. 0小時(shí)時(shí)取小鼠血液樣品(0. 5mL)。分析全血 INR、貝特沙班和解毒劑血漿水平。將小鼠血漿中的貝特沙班水平(平均值士SEM)繪示為小鼠投與15mg/kg(空心正方形)和15mg/kg然后解毒劑注射(空心圓)之后隨時(shí)間變化的曲線。在1.5小時(shí)時(shí)間點(diǎn)(解毒劑注射后5分鐘)解毒劑治療組的H(-PD相關(guān)性匯總于表13中。根據(jù)INR測(cè)量值，單次注射解毒劑使功能性貝特沙班減少> 50%。此更充分地闡述于實(shí)例8中。圖17展示利用經(jīng)純化r-解毒劑進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)(n = 4-10/組)的結(jié)果。比較經(jīng)口單獨(dú)投與貝特沙班(15mg/kg)或經(jīng)口投與貝特沙班(15mg/kg)然后靜脈注射(300 μ g) r-解毒劑之后小鼠血漿中的貝特沙班水平(圖17A)和全血INR(圖17B)。標(biāo)明各治療組的平均值。如表14中所匯總，單次靜脈注射r-解毒劑使得離體全血1冊(cè)有> 50%校正，此證明經(jīng)由多次注射或其它方案解毒劑有效中和《a抑制劑。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的fXa 變體具有用作普遍解毒劑來逆轉(zhuǎn)在出血或其它醫(yī)療急診的患者中《a抑制劑的抗凝血作用的潛力。此更充分地闡述于實(shí)例8中。圖18展示在96孔濁度變化凝血分析中r-解毒劑逆轉(zhuǎn)依諾肝素的抑制作用。這些結(jié)果基本上類似于Pd-解毒劑(圖11)，此表明兩種《a衍生物具有相當(dāng)?shù)墓δ苄越舛緞┗钚浴?0nM r-解毒劑實(shí)質(zhì)上校正(>75%)1.25U/mL依諾肝素的抑制作用。分析方案呈現(xiàn)于實(shí)例11中。圖19展示r-解毒劑逆轉(zhuǎn)低分子量肝素(LMWH)的抑制作用，如在人類血漿凝血分析中所測(cè)試。圖18和19 二者均于實(shí)例11中討論。圖20展示r-解毒劑逆轉(zhuǎn)利伐沙班的抗凝血作用。此更充分地討論于實(shí)例12中。圖21展示r-解毒劑的多核苷酸序列和經(jīng)翻譯多肽序列的排列。圖22展示在單次靜脈注射(1次注射)或兩次注射O次注射)r_解毒劑的情況下小鼠實(shí)驗(yàn)(n = 5/組，312ug/200ul r_解毒劑)的結(jié)果。對(duì)經(jīng)口投與貝特沙班(15mg/ kg)之后靜脈注射媒劑或r-解毒劑之后的血漿中的貝特沙班水平進(jìn)行比較(圖22A)(參見實(shí)例8的詳細(xì)闡述)。如圖22A中所示，與媒劑對(duì)照(對(duì)照1)相比，單次靜脈注射r-解毒劑使血漿中的貝特沙班水平增加8倍以上，此表明解毒劑在活體內(nèi)有效捕獲貝特沙班的能力。與單次注射相比，第二次注射解毒劑又使貝特沙班水平增加不到2倍，此表明在小鼠血漿中貝特沙班的數(shù)量有限且其抗凝血作用可能被解毒劑逆轉(zhuǎn)。圖22B表明，單次和雙次注射解毒劑之后，所測(cè)量的INR隨小鼠血漿中解毒劑/貝特沙班的比例的增加而降低。
具體實(shí)施例方式I.定義除非另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)踐將使用組織培養(yǎng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，此在所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的范圍內(nèi)。參見例如薩姆布魯克(Sambrook)和羅塞爾(Russell)編輯Q001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，第 3 版；奧蘇貝爾(Ausubel)等人編輯 Q007)最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(Current Protocols in Molecular Biology)系列；酶學(xué)方法 (Methods in Enzymology)系列(學(xué)術(shù)出版社公司(Academic Press，he.)，紐約(N. Y.))； 麥克弗森(MacPherson)等人(1991)PCR 1 實(shí)用方法(PCR 1 :A Practical Approach) (牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press)的 ^L Press)；麥克弗森(MacPherson) 等人(1995)PCR 2:實(shí)用方法(PCR 2 :A Practical Approach)；哈洛(Harlow)和萊恩 (Lane)編輯(1999)抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies, A Laboratory Manual)；富潤(rùn)氏尼 (Freshney) (2005)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè)(Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique)，第5版；蓋特(Gait)編輯(1984)寡核苷酸的合成(Oligonucleotide Synthesis)；美國(guó)專利第4，683，195號(hào)；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)編輯(1984) 核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)；安德森(Anderson) (1999)核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)編輯(1984)轉(zhuǎn)錄和翻譯； 固定化細(xì)胞禾BBS (Transcription and Translation ；Immobilized Cells and Enzymes) (IRL Press (1986))；佩巴爾(Perbal) (1984)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(A Practical Guide 至 Molecular Cloning)；米勒(Miller)和考斯(Calos)編輯(1987)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory))；馬克瑞德斯(Makrides)編輯^)0 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移禾口表達(dá)(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells)；邁耳口 (Mayer)禾口沃克 (Walker)編輯(1987)細(xì)胞核分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology) ((Academic Press) ,^ (London)) -M 岑貝格(Herzenberg)等人編輯(1996)韋爾的實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Weir' s Handbook of Experimental Immunology)；小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)指南(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual)，第 3 版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press) (2002))ο所有包括范圍在內(nèi)的數(shù)值指定(例如，pH、溫度、時(shí)間、濃度、和分子量)都是近似值，其以⑴或(-)0. 1的增量變化。應(yīng)了解，但不一定明確陳述所有數(shù)值指定前面皆有術(shù)語“約”。還應(yīng)該了解，但未必明確陳述本文所述的試劑僅是例示性的且這些試劑的等效物已為此項(xiàng)技術(shù)習(xí)知。除非上下文另有明確說明，否則說明書和權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一(a， an)”和“所述的(the)”包括復(fù)數(shù)意義。例如，術(shù)語“醫(yī)藥上可接受的載劑”包括多種醫(yī)藥上可接受的載劑(包括其混合物)。本文所用術(shù)語“包含”意欲指組合物和方法包括所列舉要素，但并不排除其它要素。當(dāng)使用“基本上由...組成”定義組合物和方法時(shí)，將意味著出于所想要的用途不包括對(duì)所述組合有任何本質(zhì)意義的其它要素。因此，基本上由本文所定義的要素組成的組合物不會(huì)將來自分離和純化方法的痕量污染物和醫(yī)藥上可接受的載劑(例如磷酸鹽緩沖的鹽水、防腐劑、和諸如此類)排除在外。“由...組成”將意味著排除超過其它成分的痕量元素和用于投與本發(fā)明組合物的大量方法步驟。通過這些過渡術(shù)語中的每一者定義的實(shí)施例均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。診斷或治療的“個(gè)體”是細(xì)胞或哺乳動(dòng)物(包括人類)。診斷或治療的非人類動(dòng)物個(gè)體包括(例如)鼠科動(dòng)物(例如大鼠、小鼠)、犬科動(dòng)物(例如狗)、兔科動(dòng)物(例如兔子)、家畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用且在其最廣泛意義上是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的亞單位氨基酸、氨基酸類似物或擬肽的化合物。所述亞單位可通過肽鍵連接。在另一實(shí)施例中，所述亞單位可通過其它鍵(例如，酯、醚等)連接。蛋白質(zhì)或肽必須含有至少兩個(gè)氨基酸且對(duì)蛋白質(zhì)或肽序列中可包含的氨基酸的最大數(shù)量并無限制。本文所用術(shù)語“氨基酸” 涉及天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，其包括甘氨酸和D與L光學(xué)異構(gòu)體二者、氨基酸類似物和擬肽物質(zhì)。天然存在的氨基酸的單個(gè)字母和三個(gè)字母縮寫列示于下文中。如果肽鏈短，通常將三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸的肽稱為寡肽。如果肽鏈較長(zhǎng)，則通常將所述肽稱為多肽或蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種分離的因子)(a衍生物多肽，所述分離的因子)(a衍生物多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 15，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽結(jié)合至因子敘抑制劑并且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
2.一種分離的因子敘衍生物多肽在制造用于阻止或減少正利用因子fe蛋白衍生物進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的藥物中的應(yīng)用，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 15，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽結(jié)合至因子敘抑制劑并且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
3.—種醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物包含載體和分離的因子敘衍生物多肽，其中，所述分離的因子)(a衍生物多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 15，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽結(jié)合至因子敘抑制劑并且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
4.一種肽偶聯(lián)物，所述肽偶聯(lián)物包含以共價(jià)方式或非共價(jià)方式連接至分離的因子敘衍生物多肽的載體，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 15，其中，所述分離的因子)(a衍生物多肽結(jié)合至因子fe抑制劑并且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽偶聯(lián)物，其中所述載體是脂質(zhì)體、膠束、醫(yī)藥上可接受的聚合物或醫(yī)藥上可接受的載體。
6.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼分離的因子敘衍生物多肽，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 15，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽結(jié)合至因子fe抑制劑并且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
7.一種抗體，所述抗體結(jié)合分離的因子敘衍生物多肽，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 15，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽結(jié)合至因子敘抑制劑并且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的抗體，所述抗體還包括可檢測(cè)的標(biāo)記。
10.一種權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)所述的抗體的生物活性片段。
11.一種組合物，所述組合物含有權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)所述的抗體和載體。
12.—種組合物，所述組合物含有權(quán)利要求10所述的抗體片段。
13.一種抗體-肽復(fù)合物，所述復(fù)合物包含權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)所述的抗體和特異性結(jié)合至所述抗體的多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的復(fù)合物，其中所述多肽是受到對(duì)抗可產(chǎn)生所述抗體的多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的復(fù)合物，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
16.一種制備分離的因子敘衍生物多肽的體外方法，所述方法包括在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述分離的因子)(a衍生物多肽的多核苷酸，其中，所述分離的因子)(a衍生物多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 15，其中，所述分離的因子敘衍生物多肽結(jié)合至因子敘抑制劑并且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含分離所述分離的因子fe 衍生物多肽。
19.一種分離的原核或真核宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼分離的因子敘衍生物多肽的多核苷酸，其中，所述分離的因子)(a衍生物多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 15，其中，所述分離的因子)(a衍生物多肽結(jié)合至因子fe抑制劑并且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
20.一種組合物，所述組合物包含載體和根據(jù)權(quán)利要求19所述的原核或真核宿主細(xì)胞。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物在制造用于阻止或降低正利用因子敘抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的藥物中的應(yīng)用。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物在制造用于選擇性結(jié)合并抑制正利用因子fe抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體中以外源方式投與的因子)(a抑制劑的藥物中的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的應(yīng)用，其中所述因子fe抑制劑選自磺達(dá)肝素、 伊達(dá)肝素、生物素化的伊達(dá)肝素、依諾肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、組織因子途徑抑制劑、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、PD_34^92、奧米沙班、DU_176b、 LY517717、GSK913893、雷扎沙班、低分子量肝素、貝特沙班或其醫(yī)藥上可接受的鹽、和其組
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其中所述因子抑制劑選自貝特沙班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和其組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其中所述藥物是在手術(shù)之前投與。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向因子Xa的抗凝血?jiǎng)┑慕舛緞?。所述解毒劑是因子Xa蛋白質(zhì)衍生物，所述因子Xa蛋白質(zhì)衍生物結(jié)合至因子Xa抑制劑，由此實(shí)質(zhì)上中和所述因子Xa抑制劑而不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。本文所述衍生物缺少固有凝血活性或具有降低的固有凝血活性。本文揭示了停止或阻止目前正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的患者出血的方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102559644SQ20111044725
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者烏馬·辛哈, 盧根民, 帕特里克·安德烈, 戴維·R·菲利普斯 申請(qǐng)人:普托拉制藥有限公司