缺氧誘導(dǎo)因子(hif)活性報告細(xì)胞系的制作方法
【專利說明】缺氧誘導(dǎo)因子（HIF)活性報告細(xì)胞系 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的缺氧誘導(dǎo)因子（HIF)應(yīng)答報告基因構(gòu)建體的構(gòu)建，所述基因 構(gòu)建體（genetic constructs)以及含有所述構(gòu)建體的載體。此外，本發(fā)明涉及一種含有 HIF應(yīng)答報告構(gòu)建體的穩(wěn)定的細(xì)胞系，以及利用本發(fā)明的構(gòu)建體和細(xì)胞系鑒別HIF活性的 調(diào)節(jié)劑的方法和應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 組織缺氧的早期反應(yīng)是誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF)，一個基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn) 錄激活因子介導(dǎo)基因表達(dá)的變化以應(yīng)答細(xì)胞的中氧氣濃度的變化。當(dāng)肺部受到損害或血流 量減少時可能會發(fā)生缺氧，減少氧的狀態(tài)。缺血，減少血流量，可以通過動脈或靜脈被血凝 塊（血栓）的阻塞或通過任何外來循環(huán)物質(zhì)（栓子）引起，或由一個血管障礙如動脈粥樣 硬化引起。
[0004] 基于細(xì)胞的測定已經(jīng)加速了現(xiàn)代藥物的開發(fā)。目前，這些測定方法被用于引導(dǎo)鑒 另IJ、藥物劑量優(yōu)化以及靶標(biāo)確認(rèn)。小規(guī)模但高通量技術(shù)的使用使這些基于細(xì)胞的測定更有 效以及廉價地用于藥物篩選。這些測定優(yōu)選于其它的體外方法，因為它們對感興趣的藥物 靶標(biāo)給予直接的細(xì)胞功能反應(yīng)。這允許更清楚的了解靶標(biāo)的生理和藥理反應(yīng)。
[0005] 目前，對HIF活性的定量測定的需求是巨大的。這是由于這樣的事實，即除了參與 增殖、凋亡到癌癥發(fā)展的多種細(xì)胞調(diào)控，HIF也被證明是參與干細(xì)胞更新（renewal)和分化 (Keith and Simon,，2007)。干細(xì)胞研宄在過去十年中的推進(jìn)提升了有一個更強大的基于 細(xì)胞的測定系統(tǒng)的需求，以測量HIF活性特別是HIF相關(guān)的藥物篩選中HIF的活性。不幸 的是，當(dāng)前可用的系統(tǒng)是非常低效的，昂貴的，耗時的，最重要的是提供的靈敏度有限。對細(xì) 胞系的選擇也是限制性的。
[0006] 基于細(xì)胞的HIF測定系統(tǒng)的發(fā)展已前被報告過（Woldemichael等，2006 Ji等， 2008)。然而，到現(xiàn)在為止只有兩個HIF測定細(xì)胞系是可商購的。一個是來自于Invitrogen 公司，名為"CellSens〇r?:HRE-BLA ME-180 細(xì)胞系"(cat#K1644)。另一種是來自 Panomics 公司，名稱為"穩(wěn)定細(xì)胞系：NIH3T3/HIF-luc'（cat#RC0017)。SABiosciences，一個 Qiagen 公司，還銷售HIF測定試劑盒，然而，它們的試劑盒為現(xiàn)成轉(zhuǎn)導(dǎo)的慢病毒顆?；颥F(xiàn)成的轉(zhuǎn)染 的質(zhì)粒的形式。最近，Emory大學(xué)和Rochester大學(xué)也在技術(shù)轉(zhuǎn)讓目錄中報告他們的HIF活 性測定報告細(xì)胞系的開發(fā)。市售cellSensor HRE-BLA(Invitrogen)缺氧對常氧的信號比 值僅僅是13倍。而由Li等人（2008)開發(fā)的另一個系統(tǒng)只提供了 14倍的差異。在基于細(xì) 胞的測定法的信噪比不利的情況下，這種低誘導(dǎo)能力可能使這些系統(tǒng)不能以高通量形式應(yīng) 用于藥物篩選。
[0007] 鑒于上述已知的HIF活性的報告構(gòu)建體，本發(fā)明的目的是提供一種HIF應(yīng)答系統(tǒng)， 它顯示出較高的HIF活化的誘導(dǎo)性和特異性，特別是應(yīng)答缺氧。因此，本發(fā)明的再一個目的 是提供一種新穎的裝置，用于HIF應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑的藥物篩選，例如適合應(yīng)用于高通量形式 的系統(tǒng)。
[0008] 解決上述問題的第一個方面是一種基因構(gòu)建體，所述基因構(gòu)建體整合有受缺氧誘 導(dǎo)因子（HIF)應(yīng)答啟動子控制的報告基因，其中所述HIF應(yīng)答啟動子包括至少一種衍生自 促紅細(xì)胞生成素（EPO)基因的缺氧應(yīng)答元件（HRE)。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體應(yīng)指由多個功能元件構(gòu)成，以允許表達(dá)一個報告基因的 核酸分子。在本發(fā)明的上下文中所用的核酸可以是單鏈或雙鏈；可以是DNA或本領(lǐng)域中已 知的其它核酸分子。
[0010]啟動子是指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列。典型的啟動子位于基因的5'區(qū)域，靠近 結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點。本發(fā)明的啟動子包括HRE元件（多個）。此外，啟動子可以包括 上游元件。這樣的元件包括UARS和任選的其它影響結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄的核酸序列，如合成的 上游元件或增強子。
[0011] 一個核心啟動子或最小啟動子包含用于可操作連接的編碼序列的表達(dá)所必需的 核苷酸序列，包括TATA盒和轉(zhuǎn)錄起點。通過此定義，在缺乏特定的序列時核心啟動子可以 具有或可以不具有可測定的活性，其可增強活性或賦予組織特異性活性。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因構(gòu)建體的啟動子至少包括4個HRE。在該構(gòu) 建體中的HRE優(yōu)選為串聯(lián)重復(fù)的方式，最優(yōu)選的，其中所述啟動子位于報告基因的上游。報 告基因的上游是指該啟動子序列位于報告基因起始密碼子的5'端，甚至更優(yōu)選地，其中， 本發(fā)明的HRE位于報告基因起始密碼子上游TATA盒的5'端。在一個優(yōu)選的實施方案中， 本發(fā)明的構(gòu)建體在圖2中示意性地描繪。
[0013] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及其中的HRE是從人類EPO的啟動子區(qū)衍生的構(gòu) 建體。
[0014] 在本發(fā)明的上下文中本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何報告基因可以被使用和可操作 地連接于上述的HRE元件。常用的報告基因誘導(dǎo)視覺識別的特性通常涉及熒光和發(fā)光蛋白 質(zhì)。實例包括編碼水母綠熒光蛋白（GFP)的基因，其導(dǎo)致表達(dá)GFP的細(xì)胞在藍(lán)色光下發(fā)出 綠光，螢光素酶，其催化與螢光素的反應(yīng)以產(chǎn)生光，以及來自基因 DsRed的紅色熒光蛋白。 在細(xì)菌中的一個常見報告基因是大腸桿菌IacZ基因，其編碼的蛋白質(zhì)為β -半乳糖苷酶。 這種酶會導(dǎo)致細(xì)菌表達(dá)該基因，它在包含底物類似物X-gal的培養(yǎng)基上生長時，出現(xiàn)藍(lán)色。 一個可選擇的標(biāo)志物的一個例子，這也是在細(xì)菌中的報告基因，是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT) 基因，其賦予對抗生素氯霉素的抗性。類似的標(biāo)志物已知為脊椎動物細(xì)胞系工作。最優(yōu)選 的在本發(fā)明的上下文中是使用螢光素酶，最優(yōu)選其中所述報告基因是螢火蟲熒光素酶。
[0015] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種基因構(gòu)建體，其包括在TATA盒上游 的確切的4倍的人類EPO HRE序列和報告基因。
[0016] 本發(fā)明的上述目的另一個方面是通過包含該基因構(gòu)建體的載體或如本文所述的 核酸序列的載體解決的。在本發(fā)明的含義中，載體是核酸，其能夠被導(dǎo)入到細(xì)胞中。優(yōu)選的 是由所引入核酸編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入載體時表達(dá)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā) 明的載體包括重組載體，質(zhì)粒，噬菌粒，噬菌體，粘粒，病毒，特別是但不限于：病毒衍生的擴 增子的載體。
[0017] 本發(fā)明的上述目的的另一個方面由一個包含所述基因構(gòu)建體或載體的細(xì)胞系解 決，如在本發(fā)明的各種實施例中所說明的。所述基因構(gòu)建體或載體可以瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (或轉(zhuǎn)導(dǎo)）引入所述細(xì)胞中。優(yōu)選的是，用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是脊椎動物，最優(yōu)選哺乳動物或人 細(xì)胞。
[0018] 在一個實施方案中，優(yōu)選的是，本發(fā)明的細(xì)胞系包括一個穩(wěn)定整合的本發(fā)明所述 的基因構(gòu)建體和/或載體。
[0019] 在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞系是一個骨肉瘤細(xì)胞系，優(yōu)選其中所述細(xì) 胞系是的Saos_2。
[0020] 在本發(fā)明中，發(fā)明人使用了人類骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2,而另一些則使用的ME-180 子宮頸癌細(xì)胞系（Invitrogen公司）和NIH-3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系（Panomics公司）。 也使用了一種老鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（研宄工具的目錄，Emory University)。在本研宄中 篩選了幾種人類癌細(xì)胞系，包括乳腺癌MCF7,宮頸癌HeLa，腎癌786-0和骨肉瘤Saos-2細(xì) 胞系。在缺氧誘導(dǎo)下由我們的報告構(gòu)建體制造的熒光素酶信號在Saos-2細(xì)胞中最高?；?于這些新的發(fā)現(xiàn)，使用Saos-2進(jìn)行具有穩(wěn)定的缺氧報告構(gòu)建細(xì)胞系的開發(fā)。
[0021] 還通過測定在細(xì)胞中的HIF應(yīng)答的方法解決上述問題，包括以下步驟：
[0022] a.將根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項的基因構(gòu)建體導(dǎo)入到所述細(xì)胞中，
[0023] b.在缺氧條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，
[0024] c.可選的，在常氧下培養(yǎng)對照細(xì)胞，
[0025] d.確保所述報告基因的表達(dá)與所述細(xì)胞中的HIF應(yīng)答的相對應(yīng)。
[0026] 在這個方面，在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞是骨肉瘤細(xì)胞。
[0027] 此外，本發(fā)明的實施方式涉及上述方法，其中所述基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染到所述 細(xì)胞，優(yōu)選其中所述的基因構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞中。
[0028] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"缺氧"應(yīng)指氧（O2)濃度的氣氛介于0和5% O2之間， 優(yōu)選0. 01至1 %的O2，更優(yōu)選為0. 01和之間0. 3% O2。在一個最優(yōu)選的實施方案中缺氧是 指氧的濃度約〇. 3 % O2。
[0029] 另一方面，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"常氧"應(yīng)表示氧的濃度介于5至21% O2，優(yōu) 選為10~21% O2，更優(yōu)選10至20% O2。在一個最優(yōu)選的實施方案中，"常氧"指的是正常 大氣中的氧濃度。
[0030] 本發(fā)明的問題進(jìn)一步通過用于識別的HIF應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑的篩選方法解決，包括， 執(zhí)行本發(fā)明的上述方法，并將所述細(xì)胞與被懷疑是HIF信號調(diào)節(jié)劑的化合物接觸，其中，相 比于未處理的對照基因，報告基因表達(dá)的升高表明所述化合物是缺氧誘導(dǎo)因子應(yīng)答的激動 劑，并且其中相比于未處理的對照基因，報告基因表達(dá)的降低表明該化合物是缺氧誘導(dǎo)因 子應(yīng)答的拮抗劑。
[0031] 用于本發(fā)明的上下文中的合適的試驗化合物為包括在化合物文庫中的小分子?？?替代地，蛋白質(zhì)或肽都可以使用。
[0032] 而且，核酸分子可以用作本文所述的篩選方法的候選化合物。在這些中，抑制性 RNAs是特別令人感興趣的。其可能是RNA詰抗劑（antagomirs)，單鏈RNA，雙鏈RNA或反義 RNAs。抑制劑RNA分子可以在適用于高通量形式篩選方法的庫中購得。
[0033] 此外，本發(fā)明提供了由上述篩選方法得到的調(diào)節(jié)缺氧應(yīng)答的化合物。
[0034] 在另一個方面，本發(fā)明涉及一種用于在細(xì)胞中測試HIF應(yīng)答的試劑盒，包含基因 構(gòu)建體、或載體、或根據(jù)本發(fā)明的任何本文所述的實施方案的一個細(xì)胞的試劑盒。
[0035] 任選的，本發(fā)明的試劑盒可以包括如何執(zhí)行本發(fā)明的方法的說明書和/或緩沖劑 和/或用于執(zhí)行HIF應(yīng)答測試的溶液。
[0036] 此外，本發(fā)明涉及如本文中所示的本發(fā)明的材料的應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明的基因 構(gòu)建體、載體、細(xì)胞或試劑盒在HIF介導(dǎo)的應(yīng)答或缺氧誘導(dǎo)的應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑的篩選方法中 的應(yīng)用。
[0037] 雖然本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)其某些優(yōu)選實施例進(jìn)行了特異性的描述，在概括的解釋和等 效構(gòu)型的原則和范圍內(nèi)，以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而并非意在限制本發(fā)明。
【附圖說明】
[0038] 圖1 :從ATCC獲得的Saos-2細(xì)胞顯示典型的上皮