專利名稱：抗hiv基因工程二價(jià)類抗體及其制備方法及抗hiv基因工程藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗HIV基因工程抗體，更具體地，涉及抗HIV基因工程二價(jià)類抗體及其制備方法及抗HIV基因工程藥物。
背景技術(shù)：
在H IV病毒的感染過(guò)程中，首先是H IV病毒包被膜與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生融合。該融合過(guò)程主要由包被糖蛋白gpl20和跨膜亞基gp41介導(dǎo)。gpl20與靶細(xì)胞上的⑶4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR5或CXCR4等)先后結(jié)合，導(dǎo)致gp41的構(gòu)型發(fā)生改變，形成6股α 2螺旋束核心結(jié)構(gòu)，將病毒包被膜與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜拉近并發(fā)生融合，完成HIV病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的感染過(guò)程。上述過(guò)程中可看出，HIV病毒造成感染的特點(diǎn)是其對(duì)CD4分子具有高度的親嗜性，可選擇性地與⑶4分子結(jié)合。目前已經(jīng)出現(xiàn)的一些抗HIV抗體也主要是通過(guò)構(gòu)建類似⑶4分子的結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)先與HIV病 毒結(jié)合，從而降低HIV病毒與靶細(xì)胞結(jié)合的可能性。但是單一結(jié)合位點(diǎn)與HIV病毒的特異性結(jié)合作用有限，對(duì)HIV病毒的防治效果不明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的抗HIV抗體與HIV病毒的特異性結(jié)合作用有限、對(duì)HIV病毒感染的防治效果不明顯的缺陷，提供一種可與HIV病毒特異性結(jié)合、有效預(yù)防和治療HIV感染的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體及其制備方法及抗HIV基因工程藥物。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn):提供一種抗HIV基因工程二價(jià)類抗體，所述二價(jià)類抗體具有人抗體的恒定區(qū)，其中，所述二價(jià)類抗體還包括與所述人抗體的恒定區(qū)連接的⑶4和CCR5。在上述抗HIV基因工程二價(jià)類抗體中，所述人抗體的恒定區(qū)還包括激活人體免疫功能的抗體Fe片段。在上述抗HIV基因工程二價(jià)類抗體中，所述人抗體的恒定區(qū)為IgG抗體的恒定區(qū)、IgA抗體的恒定區(qū)或IgM抗體的恒定區(qū)。在上述抗HIV基因工程二價(jià)類抗體中，所述⑶4和所述CCR5通過(guò)柔性連接肽與所述人抗體的恒定區(qū)柔性連接，所述柔性連接肽具有序列表中序列12的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種權(quán)利要求1或2中抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其中，所述方法包括以下步驟:A:分別獲取人抗體的恒定區(qū)基因、CD4基因和CCR5基因；B:采用真核表達(dá)載體構(gòu)建包括人抗體的恒定區(qū)基因、⑶4基因和CCR5基因的表達(dá)質(zhì)粒;C:將步驟B中形成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中進(jìn)行培養(yǎng)，穩(wěn)定表達(dá)二價(jià)類抗體；D:離心收集上清或細(xì)胞進(jìn)行純化后得到所述二價(jià)類抗體。在上述權(quán)利要求1或2中抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法中，在步驟A中，所述人抗體的恒定區(qū)基因?yàn)镮gG抗體的恒定區(qū)基因、IgA抗體的恒定區(qū)基因或IgM抗體的恒定區(qū)基因。在上述權(quán)利要求1或2中抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法中，在步驟B中，所述真核表達(dá)載體包括 PCDNA3.1/Hi s C、pCDNA5/FRT/T0 T0P0TA、pEGFP_Nl 和 pBudce4.1。在上述權(quán)利要求1或2中抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法中，在步驟C中，所述表達(dá)細(xì)胞株為293細(xì)胞、293T細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種抗HIV基因工程藥物，其中，所述抗HIV基因工程藥物含有權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體。實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案，可以獲得以下技術(shù)效果:本發(fā)明的二價(jià)類抗體同時(shí)具有可與HIV病毒上的CD4位點(diǎn)和CCR5位點(diǎn)特異性結(jié)合的CD4和CCR5，特異性結(jié)合作用顯著增強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)雙重阻止HIV病毒感染宿主細(xì)胞的作用；本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單、切實(shí)可行；具有本發(fā)明的二價(jià)類抗體的抗HIV基因工程藥物可有效作用于HIV病毒，從而有效預(yù)防和治療HIV病毒感染。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。 本發(fā)明的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體為人抗體的恒定區(qū)與⑶4和CCR5連接形成的類抗體。其中CD4和CCR5主要是替換了人抗體的可變區(qū)并與恒定區(qū)連接。這樣構(gòu)建的二價(jià)類抗體不僅具有阻止HIV病毒感染宿主細(xì)胞的雙重作用，而且由于該類抗體的主要部分為人抗體的恒定區(qū)，因此減少了異源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。另一方面，本發(fā)明的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體還具有抗體Fe片段，其可執(zhí)行病毒清除功能，進(jìn)一步完善該二價(jià)類抗體對(duì)HIV病毒造成的感染的預(yù)防和治療功效。本發(fā)明的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法包括以下步驟:A:分別獲取人抗體的恒定區(qū)基因、CD4基因和CCR5基因；B:構(gòu)建包括人抗體的恒定區(qū)基因、CD4基因和CCR5基因的表達(dá)質(zhì)粒；C:將步驟B中形成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中進(jìn)行培養(yǎng)，穩(wěn)定表達(dá)二價(jià)類抗體；D:離心收集上清或細(xì)胞進(jìn)行純化后得到二價(jià)類抗體。通過(guò)細(xì)胞株表達(dá)可獲得同時(shí)具有CD4和CCR5的二價(jià)類抗體，該方法操作簡(jiǎn)便、便于實(shí)現(xiàn)上述二價(jià)類抗體的擴(kuò)大化生產(chǎn)。進(jìn)一步地，上述步驟A具體包括以下步驟:Al:人抗體的恒定區(qū)基因的釣取:設(shè)計(jì)合適的引物，從人血細(xì)胞cDNA中釣取人抗體的恒定區(qū)基因。由于恒定區(qū)基因非常保守，人抗體的恒定區(qū)基因的釣取比較容易。在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中，很容易找到人抗體的恒定區(qū)基因序列以及引物。在選擇人抗體的恒定區(qū)基因時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選使用IgG抗體的恒定區(qū)基因、IgA抗體的恒定區(qū)基因或IgM抗體的恒定區(qū)基因(這樣最后制備得到的二價(jià)類抗體分別優(yōu)選具有IgG抗體的恒定區(qū)、IgA抗體的恒定區(qū)和IgM抗體的恒定區(qū))。以下則通過(guò)IgG抗體的恒定區(qū)基因展開(kāi)詳細(xì)敘述。優(yōu)選采用IgGl抗體，特別優(yōu)選地，使用IgGl抗體的亞類K型，以有效發(fā)揮其生物學(xué)功能并延長(zhǎng)其在人體內(nèi)的半衰期。IgGl抗體的恒定區(qū)基因的釣取:在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中查找人IgGl恒定區(qū)基因序列(見(jiàn)附件I)，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的上游和下游引物，分別為:上游引物的引物序列1:5’ -AAT CTC GAG GTC TCC TCA GCC TCC ACCAAG-3，，下游引物的引物序列2:5’ -ATC TCT GAG TTT ACC CGG AGA CAG GGAGAG-3，，分別引入了 Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)。A2:CD4基因的釣取:
在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(MGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中查找CD4基因序列(人CD4基因序列)，截取其表達(dá)在胞外的部分功能序列，并設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的上下游引物，其中下游引物中引入柔性連接序列(GAATGT TCC)，所述上游和下游引物具體為:上游引物的引物序列3:5’ -GTG GAA TTC CAG GGA AAG AAA GTGGTG-3，，下游引物的引物序列4:5’ -ATC CTC GAG GGA ACA TTC CCA GGT GCCACT ATCCTG-3，，分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)。A3:CCR5基因的釣取:在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)aMGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中查找CCR5基因序列(人CCR5基因序列)，選擇其表達(dá)在胞外的最后一個(gè)環(huán)狀區(qū)域及后面部分的功能蛋白序列，并設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的上游和下游引物，其中下游引物中引入柔性連接序列(GAATGT TCC)，所述上游和下游引物分別為:上游引物的引物序列5:5’ -GTG GAA TTC ATG ACG CAC TGC TGCATC-3’，下游引物的引物序列6:5’ -ATC CTC GAG GGA ACA TTC CAA GCC CACAGA TATTTC-3，，分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)。A4 =IgGl抗體的恒定區(qū)基因、⑶4基因和CCR5基因的PCR擴(kuò)增:從人新鮮血樣中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成人cDNA，以人cDNA為模板，以IgGl抗體的恒定區(qū)基因、CD4基因和CCR5基因各自的上游和下游引物分別擴(kuò)增，各自得到約lOOObp、500bp和200bp大小的基因片段。隨后，將擴(kuò)增得到的基因片段分別裝入T載體，經(jīng)基因測(cè)序分析證實(shí)各基因片段為所需要的目的基因。進(jìn)一步地，在執(zhí)行上述步驟B之前，首先需要構(gòu)建重組質(zhì)粒，具體步驟如下:將IgGl抗體的恒定區(qū)基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xho I和Xba I酶切后裝入同樣酶切的真核表達(dá)載體PCDNA3.1/His C中，構(gòu)建成含有IgGl抗體的恒定區(qū)基因的重組質(zhì)粒pCDNA3.1/His C_IgG。重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，可將⑶4基因和CCR5基因克隆至該重組質(zhì)粒中從而構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。為便于多方面考察本發(fā)明的二價(jià)類抗體的可行性和實(shí)際應(yīng)用方面的可靠性，除了上述P⑶NA3.1/His C真核表達(dá)載體外，還采用其他真核表達(dá)載體(例如，P⑶NA5/FRT/T0TOPO TA, pEGFP-Nl和pBudce4.1中)，這樣構(gòu)建出多種類型的二價(jià)類抗體。另外，由于基因工程抗體的表達(dá)水平主要取決于表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(表達(dá)細(xì)胞株)，因此，適用于本發(fā)明的表達(dá)細(xì)胞株的選取也比較重要。對(duì)于本研究的二價(jià)類抗體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是最佳的選擇。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有抗體折疊形成正確空間結(jié)構(gòu)所必需的分子伴侶和折疊酶，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為抗體分子正確折疊和鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵的形成提供了有利的氧化還原環(huán)境。此外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)還擁有完整的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后修飾、信號(hào)肽的剪切以及糖基化等優(yōu)勢(shì)，使表達(dá)的抗體空間結(jié)構(gòu)近似于天然，有利于發(fā)揮其生物學(xué)功能，并延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期。本發(fā)明可選用293細(xì)胞、293T細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，并優(yōu)選使用293細(xì)胞作為表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，來(lái)建立起CD4-CCR5- 二價(jià)類抗體穩(wěn)定表達(dá)的293細(xì)胞。考慮到表達(dá)的穩(wěn)定，染色體整合式表達(dá)系統(tǒng)將被采用。以下的實(shí)施例中將詳細(xì)說(shuō)明如何采用真核表達(dá)載體P⑶NA3.1/His C、p⑶NA5/FRT/TO TOPO TA、pEGFP-Nl和pBudce4.1構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并在293細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的二價(jià)類抗體的穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例1: 將經(jīng)PCR擴(kuò)增的⑶4基因和CCR5基因克隆至含有IgGl抗體的恒定區(qū)基因的重組質(zhì)粒PCDNA3.1/His C-1gG中，構(gòu)建成含有IgGl抗體的恒定區(qū)基因與CD4基因和CCR5基因柔性連接的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.l/HisC-CD4-1gG和pCDNA3.1/His C_CCR5_IgG。具體的，通過(guò)柔性連接肽實(shí)現(xiàn)上述柔性連接。柔性連接肽的氨基酸序列參見(jiàn)所附的序列表。采用人腎上皮細(xì)胞系293作為表達(dá)細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/His C_CD4_IgG和pCDNA3.1/His C_CCR5_IgG，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，48小時(shí)后收集細(xì)胞，后續(xù)提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。實(shí)施例2:設(shè)計(jì)引物，引物序列7 為:5，-CTT AAG CTT ACC ATG GGG GGT TCT-3’，從真核表達(dá)質(zhì)粒 pCDNA3.1/His C_CD4_IgG 和 pCDNA3.1/His C_CCR5_IgG 中擴(kuò)增出真核表達(dá)載體pCDNA3.1/His C帶有選擇標(biāo)簽(6XHis標(biāo)簽和XpressEpitop標(biāo)簽)的CD4_IgG和CCR5_IgG基因，將這兩個(gè)基因裝入P⑶NA5/FRT/T0 TOPO TA的真核載體中，得到表達(dá)質(zhì)粒p⑶NA5/FRT/T0T0P0 TA-CD4-1gG 和 pCDNA5/FRT/T0 TOPO TA_CCR5_IgG。采用人腎上皮細(xì)胞系Flp-1n T-Rex 293作為表達(dá)細(xì)胞株，建立穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA5/FRT/T0 TOPO TA_CD4_IgG和pCDNA5/FRT/TO TOPO TA-CCR5-1gG，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Flp-1n T-Rex 293細(xì)胞中，24小時(shí)后采用抗生素Blasticidin B進(jìn)行抗性篩選，10天后，用96孔板稀釋法篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并進(jìn)行大量細(xì)胞培養(yǎng)，后續(xù)提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。實(shí)施例3:設(shè)計(jì)引物，引物序列8 為:5，-AAT GTC GAC AGATCT GC GGT CCG GCGCGG AAC CAGTTT ACC CGG AGA CAG GGA-3’，將實(shí)施例2中的CD4_IgG和CCR5_IgG基因克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-Nl中，其中引物序列中引入凝血酶蛋白切割位點(diǎn)，以便將目的抗體與熒光蛋白切開(kāi)。利用引物序列7和引物序列8以質(zhì)粒pCDNA3.1/His C-CD4_IgG和pCDNA3.1/His C-CCR5-1gG為模板，擴(kuò)增出帶有選擇標(biāo)簽(6XHis標(biāo)簽和Xpress Epitop標(biāo)簽)的⑶4-1 gG和CCR5-1gG基因，將這兩個(gè)基因裝入載體pEGFP-Nl中，得到真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Nl-CD4-1gG 和 pEGFP_Nl-CCR5_IgG。采用人腎上皮細(xì)胞系293作為表達(dá)細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Nl-CD4-1gG和pEGFP-Nl-CCR5_IgG，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，24小時(shí)后采用抗生素G418進(jìn)行抗性篩選，10天后，用96孔板稀釋法篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并進(jìn)行大量細(xì)胞培養(yǎng)，后續(xù)提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。實(shí)施例4:設(shè)計(jì)引物，引物序列9 為:5’ -CTT AAGCTT C ATG GGG GGT TCT CATCAT-3，，引入Hind III和Xba I酶切位點(diǎn)，將⑶4_IgG基因克隆至真核表達(dá)載體pBudce4.1中的CMV啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)引物 10:5’-GCT GCGGCCGC ATG ACGCAC TGC TGC ATC AAC-3’，設(shè)計(jì)引物 11:5’-GAA GGTACC CGA GCT CAGGCC CTG ATG GGT GAC TTC GCA GGC GTA GACTT GTG TTT CTCGTAGTC TGC CAA GCC CAC AGA TAT TTC-3’，在CCR5基因中加入HIV輕鏈中一段基因，以便于后續(xù)CCR5蛋白與CD4-1gG抗體以二硫鍵形成天然的抗體結(jié)構(gòu)，然后將CCR5基因克隆到EF-1a啟動(dòng)子區(qū)域。引入Kpn I和Xho I酶切位點(diǎn)，然后利用PCR的方法將含有⑶4_IgG的CMV啟動(dòng)子區(qū)域及含有CCR5的EF-1 a啟動(dòng)子區(qū)域拼接起來(lái)，裝入p⑶NA5/FRT/T0 TOPOTA的真核載體中，得到表達(dá)質(zhì)粒pCDNA5/FRT/T0 TOPO TA_CD4-1gG_CCR5。采用人腎上皮細(xì)胞系Flp-1n T-Rex 293作為表達(dá)細(xì)胞株，建立穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA5/FRT/T0 T0P0TA-CD4-1gG_CCR5，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Flp-1n T-Rex 293細(xì)胞中，24小時(shí)后采用抗生素BlasticidinB進(jìn)行抗性篩選，10天后，用96孔板稀釋法篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并進(jìn)行大量細(xì)胞培養(yǎng)，后續(xù)提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

上述步驟D中，對(duì)實(shí)施例1-4的二價(jià)類抗體進(jìn)行純化包括通過(guò)離心收集上清或細(xì)胞，然后通過(guò)G蛋白柱層析分離出IgGl抗體，最后通過(guò)CD4或CCR5的親和層析分離出CD4-CCR5- 二價(jià)類抗體。本發(fā)明所制備得到的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體可制成抗HIV基因工程藥物，然后用于人對(duì)HIV感染的預(yù)防和治療?；蛘咭部梢酝ㄟ^(guò)特定載體將本發(fā)明所制備得到的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體導(dǎo)入人體中，在人體內(nèi)表達(dá)，從而產(chǎn)生預(yù)防和治療HIV感染的效果。另外，由于所述二價(jià)類抗體內(nèi)還包含有抗體Fe片段。因此，除了上述對(duì)HIV感染的預(yù)防和治療外，還具有HIV感染的診斷功能。綜上所述，本發(fā)明的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體由于同時(shí)具有可與HIV病毒上的⑶4位點(diǎn)和CCR5位點(diǎn)特異性結(jié)合的⑶4和CCR5，特異性結(jié)合作用顯著增強(qiáng)，并因此可以實(shí)現(xiàn)雙重阻止HIV病毒感染宿主細(xì)胞的作用；本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單、切實(shí)可行；具有本發(fā)明的二價(jià)類抗體的抗HIV基因工程藥物可有效作用于HIV病毒，從而有效預(yù)防和治療HIV病毒感染。
權(quán)利要求
1.一種抗Hiv基因工程二價(jià)類抗體，所述二價(jià)類抗體包括人抗體的恒定區(qū)，其特征在于，所述二價(jià)類抗體還包括與所述人抗體的恒定區(qū)連接的CD4和CCR5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體，其特征在于，所述人抗體的恒定區(qū)還包括激活人體免疫功能的抗體Fe片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體，其特征在于，所述人抗體的恒定區(qū)為IgG抗體的恒定區(qū)、IgA抗體的恒定區(qū)或IgM抗體的恒定區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體，其特征在于，所述CD4和所述CCR5通過(guò)柔性連接肽與所述人抗體的恒定區(qū)柔性連接，所述柔性連接肽具有序列表中的氨基酸序列。
5.一種權(quán)利要求1或2中抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: A:分別獲取人抗體的恒定區(qū)基因、CD4基因和CCR5基因； B:采用真核表達(dá)載體構(gòu)建包括人抗體的恒定區(qū)基因、CD4基因和CCR5基因的表達(dá)質(zhì)粒; C:將步驟B中形成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中進(jìn)行培養(yǎng)，穩(wěn)定表達(dá)二價(jià)類抗體； D:離心收集上清或細(xì)胞進(jìn)行純化后得到所述二價(jià)類抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的權(quán)利要求1或2中抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其特征在于，在步驟A中，所述人抗體的恒定區(qū)基因?yàn)镮gG抗體的恒定區(qū)基因、IgA抗體的恒定區(qū)基因或IgM抗體的恒定區(qū)基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的權(quán)利要求1或2中抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其特征在于，在步驟B中，所述真核表達(dá)載體包括pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/T0 TOPOTA, pEGFP-Nl 和 pBudce4.1。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的權(quán)利要求1或2中抗HIV基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其特征在于，在步驟C中，所述表達(dá)細(xì)胞株為293細(xì)胞、293T細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
9.一種抗HIV基因工程藥物，其特征在于，所述抗HIV基因工程藥物含有權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求的抗HIV基因工程二價(jià)類抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗HIV基因工程二價(jià)類抗體及其制備方法及抗HIV基因工程藥物，該抗HIV基因工程二價(jià)類抗體包括人抗體的恒定區(qū)以及與人抗體的恒定區(qū)連接的CD4和CCR5。該抗HIV基因工程抗體的制備方法包括獲取人抗體的恒定區(qū)基因、CD4基因和CCR5基因；構(gòu)建包括上述三種基因的表達(dá)質(zhì)粒；將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中進(jìn)行培養(yǎng)；分離純化后得到二價(jià)類抗體。本發(fā)明的二價(jià)類抗體同時(shí)具有可與HIV病毒上的CD4位點(diǎn)和CCR5位點(diǎn)特異性結(jié)合的CD4和CCR5，特異性結(jié)合作用顯著增強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)雙重阻止HIV病毒感染宿主細(xì)胞的作用；本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單、切實(shí)可行；具有二價(jià)類抗體的抗HIV基因工程藥物可有效作用于HIV病毒，并有效預(yù)防和治療HIV病毒感染。
文檔編號(hào)A61K39/42GK103183735SQ20111045375
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者周兆平, 鄭永唐, 易俊波, 雷明軍, 蘇慶寧 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)