含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)dna重組母質(zhì)粒、含該表達(dá)盒的微環(huán)dna及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒及其制備方法，該微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒能在宿主菌內(nèi)完成位點特異性重組，消除原核質(zhì)粒元件，形成含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA；本發(fā)明還提供了一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA及其制備方法和應(yīng)用，該微環(huán)DNA可在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定、持久地表達(dá)基因工程抗體基因，是一種高效、安全的基因治療載體；其次，本發(fā)明還提供了一種含有該微環(huán)DNA的宿主細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用；此外，本發(fā)明還提供了一種基因工程抗體及其制備方法和應(yīng)用。
【專利說明】含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒、含該 表達(dá)盒的微環(huán)DNA及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán) DNA重組母質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，和一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA及其 構(gòu)建方法和應(yīng)用，一種具有含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的宿主細(xì)胞及其應(yīng)用， 以及一種基因工程抗體及其表達(dá)方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 臨床上，重組抗體已被用來治療各種疾病，包括癌癥和自身免疫性疾病等。但是目 前基因工程抗體一般是在體外生產(chǎn)后再注射到體內(nèi)進(jìn)行治療，這種方式有多種缺點，比如： (1)生產(chǎn)、包裝、運輸、保存等環(huán)節(jié)花費大、成本高；（2)蛋白抗體藥物純度不高，污染物存在 副作用，有安全隱患；（3)抗體的半衰期短，需反復(fù)注射，有時還需要用微泵給藥法維持體 內(nèi)抗體的有效濃度，加大了抗體臨床應(yīng)用的難度，且治療費用高昂。
[0003] 基因治療采用基因轉(zhuǎn)染的方式將治療性基因轉(zhuǎn)染到人體靶細(xì)胞，是避免直接注射 蛋白抗體藥物存在的問題的有效途徑之一。在基因治療中，采用有效的載體高效、安全地將 目的基因轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)非常重要，在臨床應(yīng)用的基因治療載體中，主要有重組腺 病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和質(zhì)粒載體。其中，病毒載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染率高，但制備病毒載 體的費用高昂，且病毒載體存在插入突變的風(fēng)險和免疫原性，會帶來誘癌風(fēng)險并可能引發(fā) 患者致命的免疫反應(yīng)。傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體比病毒載體安全，但比病毒載體的轉(zhuǎn)染率低，且外源 基因只能瞬時表達(dá)，如要穩(wěn)定持久地表達(dá)，載體必須整合到宿主細(xì)胞染色體上，而載體的隨 機整合會引起插入突變或?qū)е峦庠椿虻某聊?，此外，傳統(tǒng)質(zhì)粒載體中含有細(xì)菌復(fù)制序列、 抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隱減的表達(dá)彳目號，這些序列在質(zhì)粒復(fù)制時是必 需的，但在基因治療中可能引起嚴(yán)重的生物安全性問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于此，本發(fā)明實施例第一方面提供了一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán) DNA重組母質(zhì)粒，該微環(huán)DNA母質(zhì)粒能在宿主菌內(nèi)完成微環(huán)DNA的重組過程，消除原核質(zhì)粒 元件。
[0005] 本發(fā)明實施例第二方面提供了一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組 母質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明實施例第三方面提供了一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，該微 環(huán)DNA可游離于宿主細(xì)胞基因組DNA之外穩(wěn)定持久的表達(dá)基因工程抗體基因。
[0007] 本發(fā)明實施例第四方面提供了一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的構(gòu) 建方法。
[0008] 本發(fā)明實施例第五方面提供了一種具有含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA 的宿主細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明實施例第六方面提供了 一種基因工程抗體。
[0010] 本發(fā)明實施例第七方面提供了一種基因工程抗體的表達(dá)方法。
[0011] 本發(fā)明實施例第八方面提供了一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組 母質(zhì)粒、含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA、具有含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán) DNA的宿主細(xì)胞和基因工程抗體的應(yīng)用。
[0012] 第一方面，本發(fā)明提供了一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì) 粒，所述微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒是在微環(huán)DNA空質(zhì)粒的多克隆位點（MCS)中插入基因工程抗體 基因表達(dá)盒的基因序列組合而成，其中，所述微環(huán)DNA空質(zhì)粒為p2〇C31質(zhì)?；騪MC.BESPX 質(zhì)粒，所述基因工程抗體基因表達(dá)盒包括依次連接的啟動子、編碼免疫球蛋白k鏈信號肽 的堿基序列、編碼Flag標(biāo)簽的堿基序列、基因工程抗體基因、編碼組氨酸His6標(biāo)簽的堿基 序列、終止密碼子和polyA加尾信號。
[0013] 優(yōu)選地，所述基因工程抗體基因具有編碼基因工程抗體的堿基序列，所述基因工 程抗體為雙靶向特異性抗體，所述雙靶向特異性抗體具有靶向免疫效應(yīng)細(xì)胞抗原表位的結(jié) 合位點和腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中 的一種。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞選自B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、 胃癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和 甲狀腺癌細(xì)胞中的一種。
[0016] 以上所述免疫效應(yīng)細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞為優(yōu)選的種類，實際應(yīng)用中不限于本發(fā)明 所例舉的具體的上述免疫效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雙祀向特異性抗體祀向結(jié)合所述腫瘤細(xì)胞的至少一個抗原表 位。
[0018]優(yōu)選地，所述p2 質(zhì)粒構(gòu)建方法參照ChenZYetal.，MinicircleDNA vectorsdevoidofbacterialDNAresultinpersistentandhigh-leveltransgene expressioninvivo,MolecularTherapy，2003,Volume8,Number3,495-500、ChenZY etal. ,ImprovedproductionandpurificationofminicircleDNAvectorfreeof plasmidbacterialsequencesandcapableofpersistenttransgeneexpressionin vivo,HumanGeneTherapy，2005,Volumel6，Numberl，126-131 和美國專利US7897380B2。
[0019] 優(yōu)選地，所述pMC.BESPX質(zhì)粒的全基因序列如ChenZYetal.，Arobustsystem forproductionofminicircleDNAvectros，NatureBiotechnology，2010,Volume28，Nu mberl2, 1289-1291 所述。
[0020] 優(yōu)選地，所述啟動子為巨細(xì)胞病毒CMV啟動子、勞斯肉瘤病毒RSV啟動子、泛素UBC 啟動子和延長因子EF1a啟動子。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述啟動子為巨細(xì)胞病毒CMV啟動子。
[0022] 優(yōu)選地，所述巨細(xì)胞病毒CMV啟動子的堿基序列如SEQIDN0:23所示。
[0023] 本發(fā)明采用的啟動子可以為巨細(xì)胞病毒CMV、RSV、UBC和EFla等真核表達(dá)啟動子 之一，CMV啟動子只是本發(fā)明構(gòu)建的微環(huán)DNA母質(zhì)粒的更優(yōu)選啟動子，本發(fā)明可以根據(jù)表達(dá) 宿主細(xì)胞的不同等條件選擇不同的啟動子構(gòu)建微環(huán)DNA母質(zhì)粒。
[0024] 本發(fā)明提供的免疫球蛋白k鏈信號肽有助于基因工程抗體基因的分泌。
[0025] 優(yōu)選地，所述免疫球蛋白k鏈信號肽的堿基序列如SEQIDN0:24所示。
[0026] 本發(fā)明提供的Flag標(biāo)簽有助于基因工程抗體基因的表達(dá)，且比其他常用標(biāo)簽如 c-myc、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST)、流感病毒血凝素表位（HA)或綠色熒光蛋白（GFP)等標(biāo)簽 的效果更優(yōu)。
[0027] 優(yōu)選地，所述Flag標(biāo)簽的堿基序列如SEQIDN0:25所示。
[0028] 本發(fā)明提供的組氨酸His6標(biāo)簽是6個組氨酸的多肽，其有利于抗體的提純和體外 驗證。
[0029] 優(yōu)選地，所述組氨酸His6標(biāo)簽的堿基序列如SEQIDN0:26所示。
[0030] 本發(fā)明提供的Flag標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽分別位于基因工程抗體基因的上游和下 游，在具體載體構(gòu)建過程中，其位置可以調(diào)換。
[0031] 優(yōu)選地，所述終止密碼子的堿基序列為TTA。
[0032] 優(yōu)選地，所述polyA加尾信號為牛生長激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信號。
[0033] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述polyA加尾信號為牛生長激素多聚核苷酸bpA。
[0034] 優(yōu)選地，所述牛生長激素多聚核苷酸bpA加尾信號的堿基序列如SEQIDNO:27所 /_J、i o
[0035] 本發(fā)明采用的polyA加尾信號可以為SV40等polyA加尾信號之一，bpA加尾信號 只是本發(fā)明構(gòu)建的微環(huán)DNA母質(zhì)粒的更優(yōu)選的加尾信號，本發(fā)明可以根據(jù)表達(dá)宿主細(xì)胞的 不同等條件選擇不同的加尾信號構(gòu)建微環(huán)DNA母質(zhì)粒。
[0036] 優(yōu)選地，所述基因工程抗體基因具有編碼雙特異性單鏈抗體氨基酸序列的堿基序 列，所述雙特異性單鏈抗體氨基酸序列的連接形式為（a)、（b)、（c)或（d)所示連接形式的 一種：

【權(quán)利要求】
1. 一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，其特征在于，所述微環(huán)DNA 重組母質(zhì)粒是在微環(huán)DNA空質(zhì)粒的多克隆位點中插入基因工程抗體基因表達(dá)盒的基因序 列組合而成，其中，所述微環(huán)DNA空質(zhì)粒為p2〇>C31質(zhì)?；騪MC. BESPX質(zhì)粒，所述基因工程 抗體基因表達(dá)盒包括依次連接的啟動子、編碼免疫球蛋白k鏈信號肽的堿基序列、編碼 Flag標(biāo)簽的堿基序列、基因工程抗體基因、編碼組氨酸His6標(biāo)簽的堿基序列、終止密碼子 和polyA加尾信號。
2. 如權(quán)利要求1所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，其特征在 于，所述基因工程抗體基因具有編碼基因工程抗體的堿基序列，所述基因工程抗體為雙靶 向特異性抗體，所述雙靶向特異性抗體具有靶向免疫效應(yīng)細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點和腫瘤 細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點。
3. 如權(quán)利要求2所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，其特征在 于，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的一種。
4. 如權(quán)利要求2所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，其特征 在于，所述腫瘤細(xì)胞選自B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌 細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和甲狀腺癌細(xì)胞中的一 種。
5. 如權(quán)利要求2所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，其特征在 于，所述雙靶向特異性抗體靶向結(jié)合所述腫瘤細(xì)胞的至少一個抗原表位。
6. 如權(quán)利要求1所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，其特征在 于，所述基因工程抗體基因具有編碼雙特異性單鏈抗體氨基酸序列的堿基序列，所述雙特 異性單鏈抗體氨基酸序列的連接形式為（a)、（b)、（c)或（d)所示連接形式的一種： (a) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (b) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (c) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， (d) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， 其中，所述八CD19的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述VHCD19的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述'CD3的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示序列中的一 種，所述％〇)3的氨基酸序列選自5￡0 10勵:5、5￡0 10勵:6或5￡0 10勵:7所示序列中 的一種，所述1丨111?51'1的氨基酸序列選自5￡〇10勵:8、5￡〇10勵:9或5￡〇10勵：10所示 序列中的一種，所述linker2的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
7. -種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒的制備方法，其特征在于， 包括如下步驟： (1) 提供或制備DNA片段，所述DNA片段具有依次連接的編碼免疫球蛋白k鏈信號肽 的堿基序列、編碼Flag標(biāo)簽的堿基序列、基因工程抗體基因、編碼組氨酸His6標(biāo)簽的堿基 序列和終止密碼子； (2) 將步驟（1)所得的DNA片段插入表達(dá)載體的多克隆位點，得到含基因工程抗體基 因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體的多克隆位點兩端分別具有啟動子和polyA 加尾信號； (3) 將步驟（2)所得的重組表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，得到含基因工程抗體基因表達(dá)盒的 DNA片段，然后將所述含基因工程抗體基因表達(dá)盒的DNA片段插入p2〇>C31質(zhì)?；騪MC. BESPX質(zhì)粒即得含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，其中，所述基因工程 抗體基因表達(dá)盒包括依次連接的啟動子、編碼免疫球蛋白k鏈信號肽的堿基序列、編碼 Flag標(biāo)簽的堿基序列、基因工程抗體基因、編碼組氨酸His6標(biāo)簽的堿基序列、終止密碼子 和polyA加尾信號。
8. 如權(quán)利要求7所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒的制備方 法，其特征在于，所述基因工程抗體基因具有編碼基因工程抗體的堿基序列，所述基因工程 抗體為雙靶向特異性抗體，所述雙靶向特異性抗體具有靶向免疫效應(yīng)細(xì)胞抗原表位的結(jié)合 位點和腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點。
9. 如權(quán)利要求8所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒的制備方 法，其特征在于，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的一種。
10. 如權(quán)利要求8所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒的制備 方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞選自B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì) 胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和甲狀腺 癌細(xì)胞中的一種。
11. 如權(quán)利要求8所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒的制備方 法，其特征在于，所述雙祀向特異性抗體祀向結(jié)合所述腫瘤細(xì)胞的至少一個抗原表位。
12. 如權(quán)利要求7所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒的制備方 法，其特征在于，所述基因工程抗體基因具有編碼雙特異性單鏈抗體氨基酸序列的堿基序 列，所述雙特異性單鏈抗體氨基酸序列的連接形式為（a)、（b)、（c)或（d)所示連接形式的 一種： (a) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (b) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (c) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， (d) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， 其中，所述八CD19的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述VHCD19的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述'CD3的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示序列中的一 種，所述％〇)3的氨基酸序列選自5￡0 10勵:5、5￡0 10勵:6或5￡0 10勵:7所示序列中 的一種，所述1丨111?51'1的氨基酸序列選自5￡〇10勵:8、5￡〇10勵:9或5￡〇10勵：10所示 序列中的一種，所述linker2的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
13. -種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，其特征在于，所述微環(huán)DNA為具有 attR位點和基因工程抗體基因表達(dá)盒的環(huán)狀DNA，其中，所述基因表達(dá)盒包括依次連接的 啟動子、編碼免疫球蛋白k鏈信號肽的堿基序列、編碼Flag標(biāo)簽的堿基序列、基因工程抗 體基因、編碼組氨酸His6標(biāo)簽的堿基序列、終止密碼子和polyA加尾信號。
14. 如權(quán)利要求13所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，其特征在于，所述基 因工程抗體基因具有編碼基因工程抗體的堿基序列，所述基因工程抗體為雙靶向特異性抗 體，所述雙靶向特異性抗體具有靶向免疫效應(yīng)細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點和腫瘤細(xì)胞抗原表 位的結(jié)合位點。
15. 如權(quán)利要求14所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，其特征在于，所述免 疫效應(yīng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的一種。
16. 如權(quán)利要求14所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，其特征在于，所述腫 瘤細(xì)胞選自B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì) 胞、食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和甲狀腺癌細(xì)胞中的一種。
17. 如權(quán)利要求14所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，其特征在于，所述雙 革巴向特異性抗體祀向結(jié)合所述腫瘤細(xì)胞的至少一個抗原表位。
18. 如權(quán)利要求13所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，其特征在于，所述基 因工程抗體基因具有編碼雙特異性單鏈抗體氨基酸序列的堿基序列，所述雙特異性單鏈抗 體氨基酸序列的連接形式為（a)、（b)、（c)或（d)所示連接形式的一種： (a) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (b) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (c) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， (d) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， 其中，所述八CD19的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述VHCD19的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述'CD3的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示序列中的一 種，所述％〇)3的氨基酸序列選自5￡0 10勵:5、5￡0 10勵:6或5￡0 10勵:7所示序列中 的一種，所述1丨111?51'1的氨基酸序列選自5￡〇10勵:8、5￡〇10勵:9或5￡〇10勵：10所示 序列中的一種，所述linker2的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
19. 如權(quán)利要求13所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，其特征在于，所述含 基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA由含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA母質(zhì)粒在宿 主菌內(nèi)發(fā)生位點特異性重組產(chǎn)生。
20. -種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 提供或制備含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒，所述微環(huán)DNA重組 母質(zhì)粒是在微環(huán)DNA空質(zhì)粒的多克隆位點中插入基因工程抗體基因表達(dá)盒的基因序列組 合而成，其中，所述微環(huán)DNA空質(zhì)粒為p2〇>C31質(zhì)?；騪MC. BESPX質(zhì)粒，所述基因工程抗體 基因表達(dá)盒包括依次連接的啟動子、編碼免疫球蛋白k鏈信號肽的堿基序列、編碼Flag標(biāo) 簽的堿基序列、基因工程抗體基因、編碼組氨酸His6標(biāo)簽的堿基序列、終止密碼子和polyA 加尾信號； (2) 將步驟（1)所得的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌， 在〇>C31重組酶的作用下非可逆地產(chǎn)生含有attL位點的細(xì)菌質(zhì)粒DNA環(huán)和含有attR位點 的微環(huán)DNA ; (3) 步驟（2)所得的含有attL位點的細(xì)菌質(zhì)粒DNA被I-Sce內(nèi)切酶酶切后成線性DNA 片段后，繼而在宿主菌內(nèi)降解，然后采用常規(guī)質(zhì)粒提純試劑盒提純所述含有attR位點的微 環(huán)DNA，所述微環(huán)DNA為具有attR位點和基因工程抗體基因表達(dá)盒的環(huán)狀DNA，其中，所述 基因工程抗體基因表達(dá)盒包括依次連接的啟動子、編碼免疫球蛋白k鏈信號肽的堿基序 列、編碼Flag標(biāo)簽的堿基序列、基因工程抗體基因、編碼組氨酸His6標(biāo)簽的堿基序列、終止 密碼子和polyA加尾信號。
21. 如權(quán)利要求20所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的制備方法，其特征 在于，所述基因工程抗體基因具有編碼基因工程抗體的堿基序列，所述基因工程抗體為雙 靶向特異性抗體，所述雙靶向特異性抗體具有靶向免疫效應(yīng)細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點和腫 瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點。
22. 如權(quán)利要求21所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的制備方法，其特征 在于，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的一種。
23. 如權(quán)利要求21所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的制備方法，其特征 在于，所述腫瘤細(xì)胞選自B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌 細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和甲狀腺癌細(xì)胞中的一 種。
24. 如權(quán)利要求21所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的制備方法，其特征 在于，所述雙靶向特異性抗體靶向結(jié)合所述腫瘤細(xì)胞的至少一個抗原表位。
25. 如權(quán)利要求20所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的制備方法，其特征 在于，所述基因工程抗體基因具有編碼雙特異性單鏈抗體氨基酸序列的堿基序列，所述雙 特異性單鏈抗體氨基酸序列的連接形式為（a)、（b)、（c)或（d)所示連接形式的一種： (a) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (b) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (c) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， (d) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， 其中，所述八CD19的氨基酸序列如SEQ ID NO:l所示，所述VHCD19的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述'CD3的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示序列中的一 種，所述％〇)3的氨基酸序列選自5￡0 10勵:5、5￡0 10勵:6或5￡0 10勵:7所示序列中 的一種，所述1丨111?51'1的氨基酸序列選自5￡〇10勵:8、5￡〇10勵:9或5￡〇10勵：10所示 序列中的一種，所述linker2的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
26. 如權(quán)利要求13?19任一所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA按下述一 種或多種方法進(jìn)行應(yīng)用： (1) 將所述微環(huán)DNA單獨進(jìn)行應(yīng)用； (2) 將所述微環(huán)DNA與化療、放療、手術(shù)、生物治療、免疫治療中的一種或幾種聯(lián)合應(yīng) 用； (3) 采用體內(nèi)靶向投遞的方式將所述微環(huán)DNA直接投遞到患者體內(nèi)進(jìn)行治療； (4) 先通過體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將所述微環(huán)DNA轉(zhuǎn)染免疫效應(yīng)細(xì)胞，然后將所述轉(zhuǎn)染有微環(huán) DNA的免疫效應(yīng)細(xì)胞輸回患者體內(nèi)實施治療。
27. -種宿主，其特征在于，所述宿主包含如權(quán)利要求13?19任一所述的微環(huán)DNA。
28. -種基因工程抗體，其特征在于，所述基因工程抗體基因具有編碼基因工程抗體的 堿基序列，所述基因工程抗體為雙靶向特異性抗體，所述雙靶向特異性抗體具有靶向免疫 效應(yīng)細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點和腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點。
29. 如權(quán)利要求28所述的基因工程抗體，其特征在于，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì) 胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的一種。
30. 如權(quán)利要求28所述的基因工程抗體，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞選自B淋巴細(xì)胞腫 瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì) 胞、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和甲狀腺癌細(xì)胞中的一種。
31. 如權(quán)利要求28所述的基因工程抗體，其特征在于，所述雙靶向特異性抗體靶向結(jié) 合所述腫瘤細(xì)胞的至少一個抗原表位。
32. 如權(quán)利要求28所述的基因工程抗體，其特征在于，所述基因工程為雙特異性單鏈 抗體，所述雙特異性單鏈抗體的氨基酸序列的連接形式為（a)、（b)、（c)或（d)所示連接形 式的一種： (a) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (b) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (c) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， (d) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， 其中，所述八CD19的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述VHCD19的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述'CD3的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示序列中的一 種，所述％〇)3的氨基酸序列選自5￡0 10勵:5、5￡0 10勵:6或5￡0 10勵:7所示序列中 的一種，所述1丨111?51'1的氨基酸序列選自5￡〇10勵:8、5￡〇10勵:9或5￡〇10勵：10所示 序列中的一種，所述linker2的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
33. 如權(quán)利要求28所述的基因工程抗體，其特征在于，所述基因工程抗體由含基因工 程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
34. -種基因工程抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 提供或制備含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA，所述微環(huán)DNA為具有attR位 點和基因工程抗體基因表達(dá)盒的環(huán)狀DNA，其中，所述基因工程抗體基因表達(dá)盒包括依次連 接的啟動子、編碼免疫球蛋白k鏈信號肽的堿基序列、編碼Flag標(biāo)簽的堿基序列、基因工 程抗體基因、編碼組氨酸His6標(biāo)簽的堿基序列、終止密碼子和polyA加尾信號； (2) 將步驟（1)所得的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并在宿主 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生基因工程抗體。
35. 如權(quán)利要求34所述的基因工程抗體的制備方法，其特征在于，所述基因工程抗體 基因具有編碼基因工程抗體的堿基序列，所述基因工程抗體為雙靶向特異性抗體，所述雙 靶向特異性抗體具有靶向免疫效應(yīng)細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點和腫瘤細(xì)胞抗原表位的結(jié)合 位點。
36. 如權(quán)利要求35所述的基因工程抗體的制備方法，其特征在于，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞 選自T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的一種。
37. 如權(quán)利要求35所述的基因工程抗體的制備方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞選自 B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì) 胞、乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和甲狀腺癌細(xì)胞中的一種。
38. 如權(quán)利要求35所述的基因工程抗體的制備方法，其特征在于，所述雙靶向特異性 抗體祀向結(jié)合所述腫瘤細(xì)胞的至少一個抗原表位。
39. 如權(quán)利要求34所述的基因工程抗體的制備方法，其特征在于，所述基因工程為雙 特異性單鏈抗體，所述雙特異性單鏈抗體的氨基酸序列的連接形式為（a)、（b)、（c)或（d) 所示連接形式的一種： (a) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-VLCD3-linkerl-V HCD3， (b) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V LCD3-linkerl-VHCD3， (c) VLCD19-linkerl-VHCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， (d) VHCD19-linkerl-VLCD19-linker2-V HCD3-linkerl-VLCD3， 其中，所述八CD19的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述VHCD19的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述'CD3的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示序列中的一 種，所述％〇)3的氨基酸序列選自5￡0 10勵:5、5￡0 10勵:6或5￡0 10勵:7所示序列中 的一種，所述1丨111?51'1的氨基酸序列選自5￡〇10勵:8、5￡〇10勵:9或5￡〇10勵：10所示 序列中的一種，所述linker2的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
40. 如權(quán)利要求13?19任一所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA、如權(quán)利要 求27所述的宿主或如權(quán)利要求28?33任一所述的基因工程抗體在制備預(yù)防或治療癌癥 的藥物中的應(yīng)用。
41. 如權(quán)利要求13?19任一所述的含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA、如權(quán)利要 求27所述的宿主或如權(quán)利要求28?33任一所述的基因工程抗體在制備預(yù)防或治療CD19 陽性癌細(xì)胞疾病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K16/18GK104342453SQ201310339305
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月6日
【發(fā)明者】陳志英, 馬飛, 何成宜 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院, 深圳市合一康生物科技有限公司