專利名稱：自體真皮成纖維細(xì)胞的劑量單位調(diào)配物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于經(jīng)過分離和制備的自體真皮成纖維細(xì)胞的劑量單位調(diào)配物，其用于在一個(gè)部位注射以供修復(fù)和/或長(zhǎng)期改善人類個(gè)體的皮膚和軟組織缺陷。
背景技術(shù)：
如美國(guó)專利第5，591，444 號(hào)、第 5，660，850 號(hào)、第 5，665，372 號(hào)以及第 5，858，390號(hào)中所述，個(gè)體皮膚中的美容和審美缺陷可以通過將自體真皮成纖維細(xì)胞的懸浮液注射到 較鄰近于缺陷的真皮和皮下組織中來矯正?？梢酝ㄟ^此方法矯正的典型缺陷包括皺皮、萎縮紋、凹陷性瘢痕、非外傷來源的皮膚凹陷、由尋常痤瘡引起的瘢痕以及唇部發(fā)育不全。所述細(xì)胞與個(gè)體組織相容，優(yōu)選地通過培養(yǎng)從個(gè)體獲取的活檢標(biāo)本而得到，并且已通過在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中繼代培養(yǎng)而擴(kuò)增。將材料(“注射物(injectate)”)注射到體內(nèi)并且尤其注射到面部以產(chǎn)生美學(xué)效果從接近十九世紀(jì)開始。舉例來說，注射石蠟來矯正面部輪廓缺陷在第I次世界大戰(zhàn)之前多年中享有一段短暫的接受期。然而，并發(fā)癥和長(zhǎng)期結(jié)果不能令人滿意的性質(zhì)導(dǎo)致放棄了實(shí)施。可注射硅酮的可用性使得這些事件在I960年代早期開始實(shí)質(zhì)上重現(xiàn)。專門制造的“醫(yī)用級(jí)”硅酮溶液，例如道康寧(Dow Corning) MDX 4. 4011，已在美國(guó)的許多經(jīng)過批準(zhǔn)的測(cè)試中心在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上加以使用。并發(fā)癥，如對(duì)硅酮的局部和全身反應(yīng)、注射物遷移以及局部組織崩塌，限制了硅酮注射液的使用。通過注射非生物性材料而獲得的不良結(jié)果促使嘗試使用外來蛋白質(zhì)(尤其牛膠原蛋白)作為注射物。雖然未經(jīng)過加工的牛膠原蛋白對(duì)于注射到人體內(nèi)來說具有過度免疫原性，但是通過酶促降解而去除牛膠原蛋白的C端和N端肽會(huì)得到一種材料(“去端肽膠原蛋白(atelocollagen)”)，如果患者經(jīng)過預(yù)篩選以排除那些具有免疫反應(yīng)性的患者，那么所述材料可按有限量使用。雖然被廣泛使用，但是所述材料與約90%的個(gè)體中產(chǎn)生抗牛抗體以及約1-3%的個(gè)體中的明顯免疫并發(fā)癥相關(guān)聯(lián)。德魯斯特F. (DeLustro, F.)等人，1987，整形與改造外科學(xué)(Plastic and Reconstructive Surgery)79:581。呈溶液形式的去端肽膠原蛋白經(jīng)證實(shí)不能完全令人滿意，這是因?yàn)樗霾牧显谙鄬?duì)較短時(shí)間內(nèi)被個(gè)體從注射部位吸收而不被主體材料替換。通過戊二醛交聯(lián)、隨后通過細(xì)篩過濾并剪切來延長(zhǎng)在體內(nèi)的滯留。然而，增加以及不規(guī)律的粘度使得所述材料難以使用。完全來源于個(gè)體自身組織樣品的注射用的人類膠原蛋白是可用的，但是沒有證據(jù)表明人類膠原蛋白注射液比牛膠原蛋白注射液更持久。這些問題通過開發(fā)自體成纖維細(xì)胞制劑來解決。然而，有了問題的解決方案并不代表有了已通過反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證并通過臨床試驗(yàn)確認(rèn)，并且已遵照美國(guó)食品藥品管理局(U. S. Food and Drug Administration)的要求制造并包裝,按規(guī)定劑量穩(wěn)定存儲(chǔ)的產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供自體真皮成纖維細(xì)胞的規(guī)定劑量單位調(diào)配物，用于注射到患者體內(nèi)以供修復(fù)和長(zhǎng)期改善皮膚缺陷。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于提供含有干細(xì)胞、前驅(qū)細(xì)胞或部分分化的細(xì)胞的劑量單位調(diào)配物，其可用于修復(fù)和長(zhǎng)期改善皮膚缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
劑量單位由自體細(xì)胞療法產(chǎn)品組成，所述產(chǎn)品由針對(duì)待治療的每個(gè)個(gè)體所生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞構(gòu)成。使用現(xiàn)行良好制造規(guī)范(CGMP)和標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)程序從每個(gè)個(gè)體自身皮膚的活檢體生長(zhǎng)的自體成纖維細(xì)胞的懸浮液在含有具有至少98%成纖維細(xì)胞純度以及至少85%成活力的低溫保存的成纖維細(xì)胞或其前驅(qū)體的小瓶中供應(yīng)，用于以I. 0-2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度分三次，約間隔五周投予I到6mL、優(yōu)選2mL的細(xì)胞，每線性厘米長(zhǎng)度注射O. 05到O. 5mL。通過在無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培育經(jīng)過擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞一段時(shí)間，使得經(jīng)過繼代培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含培養(yǎng)基中所存在的免疫原性蛋白質(zhì)。當(dāng)注射到鼻唇溝皺紋(鼻側(cè)上延伸到嘴角的皺褶)中時(shí)，認(rèn)為自體成纖維細(xì)胞會(huì)增加細(xì)胞外基質(zhì)組分(包括膠原蛋白)的合成，從而減輕這些皺紋的嚴(yán)重程度。已證實(shí)投藥劑量和時(shí)機(jī)對(duì)達(dá)成臨床上顯著的成果至關(guān)重要。雖然在美國(guó)(US)有若干種經(jīng)過批準(zhǔn)的療法用于治療鼻唇溝皺紋，如Restylane'JuWderm 以及RadieSSes\但是成纖維細(xì)胞懸浮液并不屬于與這些產(chǎn)品相同的藥理學(xué)類 另O。這些產(chǎn)品是注射到面部組織中以通過暫時(shí)為面部組織增加體積來平復(fù)皺紋和溝的結(jié)構(gòu)填充劑。成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物通過一種極為不同的提議作用機(jī)理而起作用。本文所述的劑量調(diào)配物單位適用于治療皺皮、鼻唇和唇頰溝、口周紋、外眼角紋、眶周紋以及眉間紋。成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物還適用于提供用于組織修復(fù)和再生的多能細(xì)胞。


圖I為標(biāo)準(zhǔn)化制造工藝流程圖。圖2為來自伯恩(Byrne) 2008人類分子遺傳學(xué)(Hum. Mol. Gen. ) 17:R37_R41的示意圖，其展示使用外遺傳重編程可使源自皮膚的成纖維細(xì)胞去分化成多能干細(xì)胞的方式，所述多能干細(xì)胞接著可分化成神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、β胰島細(xì)胞以及造血細(xì)胞。圖3為可使成纖維細(xì)胞去分化成多能細(xì)胞的方法的示意圖細(xì)胞融合(科文(Cowan)等人，2005)、直接重編程(高橋(Takahashi)等人，2007)以及體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(伯恩(Byrne)等人,2007)。圖4為用于醫(yī)師客觀評(píng)估的痤瘡瘢痕嚴(yán)重程度的活動(dòng)期分級(jí)，即“評(píng)估者活動(dòng)期痤瘡癒痕評(píng)估量表(Evaluator Live Acne Scar AssessmentScale)”中的圖解,所述量表采用在直接和切線照明下相對(duì)瘢痕外觀的比較性評(píng)估。
具體實(shí)施例方式已開發(fā)出一種自體成纖維細(xì)胞產(chǎn)品。所述細(xì)胞療法產(chǎn)品是由使用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)程序從每個(gè)個(gè)體自身皮膚的活檢體生長(zhǎng)的自體成纖維細(xì)胞的懸浮液構(gòu)成。從患者耳后區(qū)域提取皮膚組織(真皮和表皮層)的活檢體并且經(jīng)由次日送達(dá)在2-8°C下運(yùn)送到制造設(shè)施。將經(jīng)由酶消化從組織分離的成纖維細(xì)胞擴(kuò)增到足以注射到患者的目標(biāo)治療區(qū)域中的量。細(xì)胞療法產(chǎn)品由經(jīng)過擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞組成，這些成纖維細(xì)胞被調(diào)配成目標(biāo)細(xì)胞療法產(chǎn)品的細(xì)胞濃度且在冷凍小瓶中低溫保存，稱為冷凍小瓶裝散裝原料藥。最終細(xì)胞療法產(chǎn)品由解凍的散裝細(xì)胞療法產(chǎn)品-經(jīng)過解凍、洗滌并且準(zhǔn)備用于患者注射的冷凍小瓶細(xì)胞組成。
最初銷售批準(zhǔn)是用于治療中度到重度鼻唇溝皺紋。當(dāng)前臨床開發(fā)集中于治療真皮輪廓畸形、聲帶瘢痕、牙齦退縮、限制性燒傷瘢痕以及痤瘡瘢痕。如下文所論述，視待治療的病狀而定，劑量和投藥方案有所不同。雖然確切機(jī)理未知，但是認(rèn)為構(gòu)成成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物的活性組分的自體成纖維細(xì)胞當(dāng)注射到患者皮膚中時(shí)會(huì)增加細(xì)胞外基質(zhì)組分(如膠原蛋白)的合成，由此增強(qiáng)皮膚完整性并且最終使得細(xì)紋和皺紋減少。本文中使用以下定義ATM分析測(cè)試法AZFICEL-T自體培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的USAN名稱散裝收集物(BULK HARVEST)在最終收集之后、在低溫保存培養(yǎng)基中調(diào)配之前的材料CGMP現(xiàn)行良好制造規(guī)范 CS細(xì)胞堆疊DMEM 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modification ofEagle’ sMedium)DMSO 二甲亞砜注射用藥品(DRUG PR0DUCT-INJECTI0N)經(jīng)過洗滌并于DMEM中重新調(diào)配、裝入小瓶并且準(zhǔn)備運(yùn)送到臨床場(chǎng)所的材料冷凍小瓶裝原料藥(DRUG SUBSTANCE-CRYOVIAL)在低溫保存培養(yǎng)基中調(diào)配并且等分裝入冷凍小瓶中的材料EDTA乙二胺四乙酸FACS 突光激活細(xì)胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting)FBS胎牛血清GA 慶大霉素(Gentamicin)和兩性霉素 B (Amphotericin B)IMDM 伊斯科夫改良達(dá)爾伯克培養(yǎng)基(Iscove’s ModifiedDulbecco's Medium)IND新藥研究申請(qǐng)PBS磷酸鹽緩沖鹽水PCA個(gè)人細(xì)胞分析QC質(zhì)量控制USP 美國(guó)藥典(United States Pharmacopeia)I.劑量單位調(diào)配物A細(xì)胞來源I.自體真皮成纖維細(xì)胞調(diào)配物中的細(xì)胞當(dāng)以培養(yǎng)的單層形式生長(zhǎng)時(shí)展示典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。具體來說，細(xì)胞可展示具有細(xì)長(zhǎng)延伸的狹長(zhǎng)的梭狀或紡錘狀外觀，或細(xì)胞可表現(xiàn)為可具有細(xì)胞質(zhì)前導(dǎo)邊緣的較大的扁平狀星形細(xì)胞。還可以觀察到這些形態(tài)的混合物。所述細(xì)胞表達(dá)正常成纖維細(xì)胞的特征性蛋白質(zhì)，包括成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD90 (Thy-l)、35kDa細(xì)胞表面糖蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(膠原蛋白)。成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物是由使用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)程序從每個(gè)個(gè)體自身皮膚的活檢體生長(zhǎng)的自體成纖維細(xì)胞的懸浮液構(gòu)成的自體細(xì)胞療法產(chǎn)品。從患者耳后區(qū)域提取皮膚組織(真皮和表皮層)的活檢體。
2.前驅(qū)細(xì)胞成纖維細(xì)胞還可以用于產(chǎn)生供組織修復(fù)或再生用的其他細(xì)胞類型。通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)衍生遺傳上與患者相同的胚胎干(ES)細(xì)胞保持了治愈或減輕許多退化性疾病的癥狀的潛力，同時(shí)避免了關(guān)于被宿主免疫系統(tǒng)排斥的問題。伯恩(Byrne)等人，自然(Nature) 2007年11月22日；450(7169) :497-502使用經(jīng)過修改的SCNT方法從成人皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生恒河猴(rhesus macaque)胚泡，并且從這些胚胎中成功分離出兩個(gè)ES細(xì)胞系。DNA分析確認(rèn)了細(xì)胞核DNA與供體體細(xì)胞相同并且線粒體DNA來源于卵母細(xì)胞。兩個(gè)細(xì)胞系都展現(xiàn)正常的ES細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)關(guān)鍵的干細(xì)胞標(biāo)志物，在轉(zhuǎn)錄方面類似于對(duì)照ES細(xì)胞且在試管內(nèi)和活體內(nèi)分化成多種細(xì)胞類型。還參看斯丕曼(Sparman)等人，干細(xì)胞(Stem Cells)2009;27(6) : 1255-64。圖 2 為來自伯恩(Byrne)2008 人類分子遺傳學(xué)(Hum.Mol. Gen. ) 17:R37-R41的示意圖，其展示使用外遺傳重編程可使源自皮膚的成纖維細(xì)胞去分化成多能干細(xì)胞的方式，所述多能干細(xì)胞接著可分化成神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、β胰島細(xì)胞以及造血細(xì)胞。參看霍切林格(Hochedlinger)等人，發(fā)育(Development. ) 2009年2月;136 (4) : 509-23以及卡納瓦蒂(Kanawaty)等人，生物學(xué)論文集(Bioessays· ) 2009年
2月;31(2):134-8。圖3為可使成纖維細(xì)胞去分化成多能細(xì)胞的方法的示意圖細(xì)胞融合(科文(Cowan)等人，科學(xué)(Science. ) 2005 年 8 月 26; 309 (5739) : 1369-73)、直接重編程(高橋(Takahashi)等人，細(xì)胞(Cell. )200730; 131 (5) : 861-72)以及體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(伯恩(Byrne)等人，2007)。高橋(Takahashi)等人展示了從具有以下相同的四個(gè)因子的成人真皮成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生iPS細(xì)胞0ct3/4、Sox2、Klf4以及c_Myc。人類iPS細(xì)胞在形態(tài)、增殖、表面抗原、基因表達(dá)、多能細(xì)胞特異性基因的外遺傳狀態(tài)以及端粒酶活性方面類似于人類胚胎干(ES)細(xì)胞。此外，這些細(xì)胞可在試管內(nèi)以及在畸胎瘤內(nèi)分化成具有三個(gè)胚層的細(xì)胞類型。這些發(fā)現(xiàn)展示了 iPS細(xì)胞可從成人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。B.制備細(xì)胞原料藥中的自體成纖維細(xì)胞是通過從接受者自身皮膚的活檢體中長(zhǎng)出，隨后使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在培養(yǎng)基中擴(kuò)增而得到。從個(gè)體耳后區(qū)域提取皮膚組織(真皮和表皮層)的活檢體。初始材料由使用標(biāo)準(zhǔn)無菌規(guī)范收集的三個(gè)3mm打孔皮膚活檢體構(gòu)成。所述活檢體是由治療醫(yī)師收集，放置到含有無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的小瓶中。活檢體在2-8°C下冷藏的運(yùn)送器材中運(yùn)送回制造設(shè)施。在抵達(dá)制造設(shè)施之后，檢查活檢體并且在驗(yàn)收后直接轉(zhuǎn)移到制造區(qū)域。在工藝開始之后，接著洗滌活檢體組織，隨后進(jìn)行酶消化。洗滌之后，在未切碎的情況下加入釋放酶消化酶溶液(Liberase DigestiveEnzyme Solution),并且在37. 0±2°C下培育活檢體組織一小時(shí)。活檢體組織消化的時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵的工藝參數(shù)，它會(huì)影響培養(yǎng)中的細(xì)胞的成活力和生長(zhǎng)速率。釋放酶是一種膠原蛋白酶/中性蛋白酶混合物，它是從龍沙沃克斯維爾公司(Lonza ffalkersville, Inc.)(沃克斯維爾(Walkersville),馬里蘭州(MD))以調(diào)配形式獲得，以及從羅氏診斷公司(Roche Diagnostics Corp.)(印第安納波利斯(Indianapolis),印第安納州(IN))以未調(diào)配形式獲得?；蛘?，可使用其他可商購(gòu)的膠原蛋白酶，如賽瓦膠原蛋白酶 NB6 (Serva Collagenase NB6)(海德堡(Helidelburg),德國(guó)(Germany))。消化之后，加入起始生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MDM，GA，10%胎牛血清(FBS))來中和所述酶，通過離心使細(xì)胞集結(jié)并且再懸浮于5. OmL起始生長(zhǎng)培養(yǎng)基中?；蛘撸贿M(jìn)行離心，僅僅通過加入起始生長(zhǎng)培養(yǎng)基就使酶完全滅活。加入起始生長(zhǎng)培養(yǎng)基，隨后將細(xì)胞懸浮液接種到T-175細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中以起始細(xì)胞生長(zhǎng)并擴(kuò)增?？墒褂肨-75、T-150、T-185或T-225燒瓶代替T-75燒瓶。在37±2. (TC以及5. 0±1. 0%C02下培育細(xì)胞并且每三到五天供給新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。工藝中的所有供料都是通過去除一半的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基并且用新鮮培養(yǎng)基替換相同體積來進(jìn)行的?；蛘?，可進(jìn)行完全供料。細(xì)胞在繼代培養(yǎng)之前在T-175燒瓶中所保持的時(shí)間不應(yīng)超過30天。在整個(gè)工藝中監(jiān)控匯合以確保在培養(yǎng)分裂(culture splitting)期間有足夠的接種密度。當(dāng)在T-175燒瓶中細(xì)胞匯合度大于或等于40%時(shí)，通過去除耗盡的培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞并且用胰蛋白酶-EDTA處理以將燒瓶中的粘附細(xì)胞釋放到溶液中來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)。接著對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理并且接種到T-500燒瓶中以進(jìn)行連續(xù)的細(xì)胞擴(kuò)增?；蛘?，可使用一個(gè)或兩個(gè)T-300燒瓶、一層細(xì)胞堆疊(1CS)、一層細(xì)胞工廠(ICF)或兩層細(xì)胞堆疊(2CS)代替T-500燒瓶。在每個(gè)繼代中并在收集之前評(píng)估形態(tài)以監(jiān)控整個(gè)工藝中的培養(yǎng)物純度。通過比較所觀察的樣品與目測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行形態(tài)檢查來評(píng)估形態(tài)。所述細(xì)胞當(dāng)以培養(yǎng)的 單層形式生長(zhǎng)時(shí)展示典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞可展示具有細(xì)長(zhǎng)延伸的狹長(zhǎng)的梭狀或紡錘狀外觀，或表現(xiàn)為可具有細(xì)胞質(zhì)前導(dǎo)邊緣的較大的扁平狀星形細(xì)胞。還可以觀察到這些形態(tài)的混合物。在匯合度較小的區(qū)域中的成纖維細(xì)胞可具有類似形狀，但隨機(jī)定向。還評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)物中角化細(xì)胞的存在。角化細(xì)胞似乎呈圓形以及不規(guī)則形狀，并且在較高匯合度下它們似乎組織成鵝卵石構(gòu)形。在較低匯合度下，角化細(xì)胞可在小群落中觀察到。在37±2. (TC以及5. 0± I. 0%C02下培育細(xì)胞并且每三到五天在T-500燒瓶中并且每五到七天在十層細(xì)胞堆疊(10CS)中供料。細(xì)胞在繼代培養(yǎng)之前在T-500燒瓶中所保持的時(shí)間不應(yīng)超過10天。散裝原料藥安全性的質(zhì)量控制(QC)出廠測(cè)試包括無菌和內(nèi)毒素測(cè)試。當(dāng)在T-500燒瓶中細(xì)胞匯合度> 95%時(shí)，將細(xì)胞繼代培養(yǎng)到IOCS培養(yǎng)容器中?；蛘?，可使用兩個(gè)五層細(xì)胞堆疊(5CS)或十層細(xì)胞工廠(10CF)代替10CS。通過去除耗盡的培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞并且用胰蛋白酶-EDTA處理以將燒瓶中的粘附細(xì)胞釋放到溶液中來進(jìn)行繼代培養(yǎng)達(dá)到10CS。接著將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10CS。加入額外的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基來中和胰蛋白酶并且將來自T-500燒瓶的細(xì)胞吸移到含有新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基的2L瓶中。將2L瓶的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到IOCS中且跨越所有層進(jìn)行接種。接著在37±2. (TC以及5. 0±1. 0%C02下培育細(xì)胞并且每五到七天供給新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。細(xì)胞在繼代培養(yǎng)之前在IOCS中所保持的時(shí)間不應(yīng)超過20天。通過在無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培育經(jīng)過擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞一段時(shí)間，使得經(jīng)過繼代培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含培養(yǎng)基中所存在的免疫原性蛋白質(zhì)。初級(jí)收集當(dāng)在IOCS中細(xì)胞匯合度為95%或更高時(shí)，收集細(xì)胞。通過去除耗盡的培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞，用胰蛋白酶-EDTA處理以將粘附細(xì)胞釋放到溶液中，并且加入額外的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶來進(jìn)行收集。通過離心收集細(xì)胞，再懸浮，并且進(jìn)行工藝中QC測(cè)試以測(cè)定總活細(xì)胞計(jì)數(shù)以及細(xì)胞成活力。對(duì)于治療鼻唇溝，總細(xì)胞計(jì)數(shù)必須為3· 4X IO8個(gè)細(xì)胞且成活力必須為85%或更高?；蛘?，用于其他適應(yīng)癥的總細(xì)胞產(chǎn)量可在3. 4X IO8至IX IO9個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)。收集時(shí)的細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力為用以確保有足夠量的活細(xì)胞用于調(diào)配原料藥的關(guān)鍵參數(shù)。如果總活細(xì)胞計(jì)數(shù)足以用于預(yù)期治療，那么就測(cè)試細(xì)胞等分試樣和耗盡的培養(yǎng)基的支原體污染。進(jìn)行支原體測(cè)試。調(diào)配所收集的細(xì)胞并且低溫保存。如果從初級(jí)IOCS收集接收到細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果之后需要額外的細(xì)胞，那么就進(jìn)行額外的繼代培養(yǎng)達(dá)到多個(gè)細(xì)胞堆疊(至多四個(gè)10CS)(圖I中的步驟5a)。對(duì)于額外的繼代培養(yǎng)，將來自初級(jí)收集的細(xì)胞加入到含有新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基的2L培養(yǎng)基瓶中。將再懸浮的細(xì)胞加入到多個(gè)細(xì)胞堆疊中且在37 ±2. (TC以及5. O ± I. 0%C02下培育。除了在細(xì)胞收集之前細(xì)胞匯合度必須為80%或更高以外，如上文所述對(duì)細(xì)胞堆疊進(jìn)行供料并收集。收集程序與上文關(guān)于初級(jí)收集所述相同。從細(xì)胞和耗盡的培養(yǎng)基收集支原體樣品，并且如上文關(guān)于初級(jí)收集所述進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力測(cè)定。所述方法減少或消除了免疫原性蛋白質(zhì)，從而避免其從動(dòng)物源性試劑引入。為減少工藝殘留，將細(xì)胞在無蛋白質(zhì)冷凍培養(yǎng)基中低溫保存，接著在準(zhǔn)備用于最終注射之前解凍并且洗滌以進(jìn)一步減少剩余殘留。
如果在完成收集并且低溫保存來自額外繼代培養(yǎng)的細(xì)胞(圖I中的步驟5a)之后需要額外的原料藥，那么就解凍經(jīng)過冷凍的冷凍小瓶裝原料藥的等分試樣并且用于接種5CS或IOCS培養(yǎng)容器(圖I中的步驟7a)?；蛘?，可使用四層細(xì)胞工廠(4CF)、兩個(gè)4CF或兩個(gè)5CS代替5CS或10CS。將經(jīng)過冷凍的細(xì)胞冷凍小瓶解凍，洗滌，加入到含有新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基的2L培養(yǎng)基瓶中，并且如上文所述進(jìn)行培養(yǎng)，收集并且低溫保存。加入細(xì)胞懸浮液。在細(xì)胞收集之前細(xì)胞匯合度必須為80%或更高。C.制備細(xì)胞懸浮液在完成培養(yǎng)物擴(kuò)增時(shí)，收集細(xì)胞并洗滌，接著調(diào)配成含有1.0-2. 7X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升，目標(biāo)為2. 2X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升?；蛘撸稍谡{(diào)配物范圍內(nèi)調(diào)整目標(biāo)以適應(yīng)不同適應(yīng)癥劑量。原料藥由懸浮于低溫保存培養(yǎng)基中的活的自體人類成纖維細(xì)胞的群體組成，所述低溫保存培養(yǎng)基由伊斯科夫改良達(dá)爾伯克培養(yǎng)基(MDM)和Profeeze-CDM (龍沙公司(Lonza)，沃克斯維爾(Walkerville)，馬里蘭州(MD))加7. 5% 二甲亞砜(DMSO)組成。或者，可使用較低DMSO濃度代替7. 5%或CryoStor CS5，或可使用CryoStor CS 10 (美國(guó)生物科技公司(BioLifeSolutions),巴薩爾(Bothell),華盛頓州(WA))代替 IMDM/Profreeze/DMS0。冷凍工藝由以下勻變程序的控制速率冷凍步驟組成步驟I :在4. (TC下等待步驟2 1. 0°C /minC/m 到-4. 0°C (樣品探針)步驟3 25. 0°C /minC/m 到 _40°C (腔室探針)步驟4 10. (TC /minC/m 到-12. (TC (腔室探針)步驟5 :1. (TC /minC/m 到 _40°C (腔室探針)步驟6 10. 0°C /minC/m 到 _90°C (腔室探針)步驟7:結(jié)束在完成控制速率冷凍步驟之后，將散裝原料藥小瓶轉(zhuǎn)移到低溫冷凍器中以在蒸氣相中存儲(chǔ)。在低溫冷凍之后，提交原料藥進(jìn)行質(zhì)量控制測(cè)試。原料藥規(guī)格還包括在低溫保存之前進(jìn)行以及再次針對(duì)冷凍小瓶裝原料藥進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞成活力測(cè)試。對(duì)于產(chǎn)品出廠，細(xì)胞成活力必須為85%或更高。使用自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)(加瓦技術(shù)公司(GuavaTechnologies))進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力測(cè)定，所述系統(tǒng)利用可滲透和不可滲透的熒光DNA嵌入染料的組合來檢測(cè)并區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。或者，可使用采用錐蟲藍(lán)排除法的手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析代替上述自動(dòng)化細(xì)胞法?；蛘撸墒褂闷渌詣?dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力方法，包括Cedex (羅氏伊諾斯AG公司(Roche InnovatisAG),比勒費(fèi)爾德(Bielefield),德國(guó)(Germany))、ViaCell (貝克曼庫(kù)爾特公司(Beckman Coulter),貝瑞阿(Brea),加利福尼亞州(CA))、NuceloCounter (新布倫茲威克科學(xué)儀器公司(NewBrunswickScientific),埃迪遜(Edison),新澤西州(NJ))、Countless (英杰，生命技術(shù)公司分部(Invitrogen, division of Life Technologies),卡爾斯巴德(Carlsbad),加利福尼亞州(CA))或Cellometer (萊科洛生物科學(xué)公司(Nexcelom Biosciences),勞倫斯(Lawrence)，馬薩諸塞州(MA))。冷凍小瓶裝原料藥樣品在出廠前必須滿足I. 0-2. 7X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞計(jì)數(shù)規(guī)格。在出廠測(cè)試期間還進(jìn)行無菌和內(nèi)毒素測(cè)試。除了細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力以外，還進(jìn)行原料藥的純度/身份分析并且必須確認(rèn)懸浮液含有98%或更多的成纖維細(xì)胞。常見細(xì)胞污染物包括角化細(xì)胞。純度/身份分析采用針對(duì)CD90和CD 104 (分別為成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物)的熒光標(biāo)記抗體來量化成纖維細(xì)胞群體的純度百分比。⑶90 (Thy-I)為35kDa細(xì)胞表面糖蛋白。已顯示針對(duì)⑶90蛋白質(zhì)的抗體對(duì)人類成纖維細(xì)胞展現(xiàn)高特異性。⑶104整合素β4鏈為205kDa跨膜·糖蛋白，它與整合素α6鏈(⑶49f)締合形成α6/β4復(fù)合物。已顯示此復(fù)合物充當(dāng)角化細(xì)胞的分子標(biāo)志物(亞當(dāng)斯(Adams)和瓦特(Watt) 1991)。針對(duì)⑶104蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合于100%的人類角化細(xì)胞。通過將樣品與維康特染料試劑(Viacount Dye Reagent)—起培育并且使用Guava PCA系統(tǒng)分析樣品來測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力。所述試劑由兩種染料構(gòu)成，即，將所有有核細(xì)胞染色的膜可滲透性染料以及只將受損細(xì)胞或垂死細(xì)胞染色的膜不可滲透性染料。此染料組合的使用使得Guava PCA系統(tǒng)能夠估算樣品中所存在的細(xì)胞的總數(shù)，并且確定哪些細(xì)胞存活、凋亡或死亡。所述方法為專門開發(fā)的，特定用于確定自體培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的純度/身份。具體程序如下程序制備25% (ff/V)疊氮化鈉的PBS溶液制備FACS (熒光激活細(xì)胞分詵)緩沖液在IOOOmL 納根瓶(Nalgene bottle)中，將 966mL PBS、30mL FBS 以及 4mL 25% 疊氮化鈉的PBS溶液組合。制備1% (v/v) HuS 的 PBS 溶液每個(gè)測(cè)試樣品制備ImL l%HuS的PBS溶液。向標(biāo)記為1%HuS等分試樣的I. 5mL管中加入990 μ L PBSo將10 μ L人類血清加入到標(biāo)記為1%HuS的管中。樣品接收和制備核實(shí)在結(jié)果通過當(dāng)日已進(jìn)行每日Guava檢查。使用Guava PCA對(duì)測(cè)試小瓶進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力分析。記錄所獲得的平均細(xì)胞計(jì)數(shù)值。對(duì)于每個(gè)樣品組，每個(gè)測(cè)試小瓶標(biāo)記如下四個(gè)1. 5mL微量離心管“⑶90 ”、“⑶104”、“小鼠”(對(duì)應(yīng)于小鼠IgGl同型對(duì)照)以及“大鼠”(對(duì)應(yīng)于大鼠IgG2b同型對(duì)照)。使用平均細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算用于等分的細(xì)胞的適當(dāng)體積，以使得每個(gè)管接收IXlO5個(gè)活細(xì)胞。實(shí)例
如果平均活細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果記載為I. 5X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升，那么I X IO5除以
I.5X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升即為適當(dāng)體積。此體積(mL)乘以1000以將單位轉(zhuǎn)換成yL。I X 105/1. 5 X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升=0. 0066mLX 1000=7 μ L細(xì)胞溶液等分試樣。將足量FACS緩沖液加入到每個(gè)管中使得總體積將為ImL。實(shí)例如果所加入的細(xì)胞溶液為7yL，那么從ImL或IOOOyL減去7yL。加入1000 μ L-7 μ L=993 μ L FACS 緩沖液。通過在渦旋設(shè)置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合測(cè)試小瓶?！⑦m量細(xì)胞溶液加入到FACS緩沖液中。通過在渦旋設(shè)置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。通過以3，OOOrpm離心3分鐘使每個(gè)樣品管中的細(xì)胞集結(jié)。如果難以形成集結(jié)粒，那么再次以3，OOOrpm使管離心3分鐘。如果在第二次離心之后集結(jié)粒形成足夠，那么繼續(xù)進(jìn)行上清液抽吸。借助于吸移管，將上清液抽吸到含有20%漂白劑的去離子水溶液的廢物容器中。在每個(gè)管中留下約50 μ L上清液以使無意地抽吸細(xì)胞的情況降至最低。加入200 μ L l%HuS的PBS溶液。通過在渦旋設(shè)置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。在2-8 °C下將管培育25分鐘±5分鐘。將5. O μ L抗體或同型對(duì)照加入到各別管中。通過在渦旋設(shè)置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。在2-8 °C下將管培育25分鐘±5分鐘。避光。將800 μ L FACS緩沖液加入到每個(gè)管中。通過在渦旋設(shè)置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。借助于吸移管，抽吸上清液并且在每個(gè)管中留下約50 μ L上清液以使無意地抽吸細(xì)胞的情況降至最低。加入400 μ L FACS緩沖液。通過在渦旋設(shè)置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。使用GuavaPCA采集樣品打開CytoSoft 2. I. 5并且點(diǎn)擊主菜單中的“Guava Express”。點(diǎn)擊“新數(shù)據(jù)集(New Data Set)”并且遵循屏幕命令來生成新文件。確保在用以采集Guava Express采集屏幕的部分的事件(Events To Acquiresection of the Guava Express Acquisitionscreen)中輸入2000。調(diào)整關(guān)于小鼠IgGl同型對(duì)照的設(shè)置。在樣品信息控制面板內(nèi)輸入樣品部分、批次以及同型對(duì)照或抗體(例如“DR01200502001小鼠”)以標(biāo)識(shí)樣品ID字段中的每個(gè)樣品。在渦旋設(shè)置8上使小鼠IgGl同型對(duì)照管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到Guava PCA中并且點(diǎn)擊“設(shè)置(Settings)”。將出現(xiàn)消息窗P，選擇“調(diào)整設(shè)置(Adjust Settings)”。將出現(xiàn)另一個(gè)消息窗口，提示裝載對(duì)照樣品，選擇“確定(OK) ”。應(yīng)出現(xiàn)“調(diào)整設(shè)置”屏幕并且系統(tǒng)將自動(dòng)設(shè)置閾值以排除背景熒光。選擇一個(gè)FSC增益強(qiáng)度(Gain intensity)以將規(guī)定細(xì)胞群集的中心定位在FSC相對(duì)于成活力(PMl)圖(例如“x2”)的X軸上的右下方象限中在10e3之上。定位FSC相對(duì)于成活力(PMl)圖上的FSC閾值條以排除碎片。將PM2調(diào)整到300V。將PMl調(diào)整到300-400V之間，以使得陰性對(duì)照群體定位在FSC相對(duì)于PMl以及PMl相對(duì)于PM2點(diǎn)陣圖上的IOeO與IOel之間。采集小鼠IgGl同型對(duì)照在渦旋設(shè)置8上使小鼠IgGl同型對(duì)照管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到Guava PCA中并且點(diǎn)擊“采集下一個(gè)樣品(Acquire Next Sample)”。確保將所有默認(rèn)的門控選項(xiàng)設(shè)置成非門控(ungated)。在PMl熒光相對(duì)于計(jì)數(shù)的柱狀圖上，在默認(rèn)位置處設(shè)置標(biāo)記。點(diǎn)擊標(biāo)記進(jìn)行設(shè)置，以使得PMl門控樣品的柱狀圖事件的百分比為約I. 0%。 采集⑶90樣品在樣品信息控制面板內(nèi)輸入樣品部分、批次以及同型對(duì)照或抗體(例如“DR01200502001CD90”)以標(biāo)識(shí)樣品ID字段中的每個(gè)樣品。核實(shí)將PMl熒光標(biāo)記設(shè)置成與小鼠IgGl同型對(duì)照樣品相同的設(shè)置。調(diào)整關(guān)于大鼠IgG2b同型對(duì)照的設(shè)置在渦旋設(shè)置8上使大鼠IgGl同型對(duì)照管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到Guava PCA中并且點(diǎn)擊“設(shè)置”。應(yīng)出現(xiàn)“調(diào)整設(shè)置”屏幕并且系統(tǒng)將自動(dòng)設(shè)置閾值以排除背景熒光。選擇一個(gè)FSC增益強(qiáng)度以將規(guī)定細(xì)胞群集的中心定位在FSC相對(duì)于成活力(PMl)圖(例如“x2”)的X軸上的右下方象限中在IO3之上。定位FSC相對(duì)于成活力(PMl)圖上的FSC閾值條以排除碎片。將PM2調(diào)整到300V。將PMl調(diào)整到300-400V之間，以使得陰性對(duì)照群體定位在FSC相對(duì)于PMl以及PMl相對(duì)于PM2點(diǎn)陣圖上的IOeO與IOel之間。米集大鼠,IrGI同型對(duì)照樣品在渦旋設(shè)置8上使大鼠IgGl同型對(duì)照管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到Guava PCA中并且點(diǎn)擊“采集下一個(gè)樣品”。將所有門控選項(xiàng)設(shè)置成非門控。在PMl熒光相對(duì)于計(jì)數(shù)的柱狀圖上，在默認(rèn)位置處設(shè)置標(biāo)記。點(diǎn)擊標(biāo)記進(jìn)行設(shè)置，以使得PMl門控樣品的柱狀圖事件的百分比為約1.0%。標(biāo)記的位置以數(shù)值顯示在“標(biāo)記位置”框中。采集⑶104樣品在渦旋設(shè)置8上使⑶104管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到GuavaPCA中并且點(diǎn)擊“采集下一個(gè)樣品”。核實(shí)將PMl熒光標(biāo)記設(shè)置成與大鼠IgGl同型對(duì)照樣品相同的設(shè)置。使用Guava PCA分析樣品點(diǎn)擊“執(zhí)行(Go)”從采集屏幕進(jìn)行分析。點(diǎn)擊“打印(Print)”，接著點(diǎn)擊“確定(0K)”。在每個(gè)印刷報(bào)告上簽上姓名和日期。純度計(jì)算:PMl事件計(jì)數(shù)[用⑶90 (⑶90)標(biāo)記的總事件]-PMl事件計(jì)數(shù)[用抗⑶90 (小鼠IgGl)標(biāo)記的總事件]=用⑶90標(biāo)記的總事件(針對(duì)背景/非特異性熒光歸一化)(例如1918個(gè)事件-20個(gè)事件=1898個(gè)事件)。PMl事件計(jì)數(shù)[用⑶104 (⑶104)標(biāo)記的總事件]-PMl事件計(jì)數(shù)[用抗⑶104(大鼠IgG2b)標(biāo)記的總事件]=用⑶104標(biāo)記的總事件(針對(duì)背景/非特異性熒光歸一化)(例如31個(gè)事件-23個(gè)事件=8個(gè)事件)。用⑶90標(biāo)記的總事件(針對(duì)背景/非特異性熒光歸一化)+用⑶104標(biāo)記的總事件(針對(duì)背景/非特異性熒光歸一化)=總歸一化標(biāo)記事件(例如1898個(gè)事件+8個(gè)事件=1906個(gè)事件)。如下計(jì)算純度％ 1898個(gè)總CD90事件/1906個(gè)總歸一化標(biāo)記事件X 100=99. 58，或 100%。系統(tǒng)適宜性和規(guī)格在開始分析之前必須進(jìn)行成功的珠粒檢查(Bead Check)。總粒子計(jì)數(shù)必須采集2000。所有樣品的純度百分比必須彡98%。替代的制造方法或者，可將細(xì)胞從T-175燒瓶(或替代物)或T-500燒瓶(或替代物)繼代培養(yǎng)到含有微載體作為細(xì)胞生長(zhǎng)表面的旋轉(zhuǎn)燒瓶中。微載體為小珠狀結(jié)構(gòu)，它用作懸浮培養(yǎng)中的貼壁依賴性細(xì)胞的生長(zhǎng)表面。所述微載體經(jīng)過設(shè)計(jì)以在小體積中產(chǎn)生大細(xì)胞產(chǎn)量。 在此設(shè)備中，將體積在50mL-300mL范圍內(nèi)的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入到500mL、IL或2L無菌一次性旋轉(zhuǎn)燒瓶中。將無菌微載體加入到旋轉(zhuǎn)燒瓶中。在37±2.0°C以及
5.0±1. 0%C02培育箱中使培養(yǎng)物保持靜態(tài)或放置在處于低RPM (15-30RRM)下的攪拌板上較短的一段時(shí)間(1-24小時(shí))以使得細(xì)胞粘附于載體。附著期之后，提高旋轉(zhuǎn)板的速度(30-120RPM)。每一到五天或當(dāng)根據(jù)顏色變化培養(yǎng)基似乎耗盡時(shí)為細(xì)胞供給新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。以有規(guī)律的時(shí)間間隔通過對(duì)微載體進(jìn)行采樣，分離細(xì)胞并且進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力分析來收集細(xì)胞。使用每個(gè)載體的細(xì)胞濃度來確定何時(shí)按比例放大培養(yǎng)。當(dāng)產(chǎn)生足夠的細(xì)胞時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞并且使用胰蛋白酶-EDTA從微載體中收集細(xì)胞，并且在更大量的微載體以及更大體積的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(300mL-2L)中接種回旋轉(zhuǎn)燒瓶中?；蛘?，可將額外的微載體以及完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基直接加入到含有現(xiàn)有微載體培養(yǎng)物的旋轉(zhuǎn)燒瓶中，允許在不使用胰蛋白酶處理和重新接種的情況下進(jìn)行細(xì)胞的直接珠粒間轉(zhuǎn)移。或者，如果從初始T-175或T-500燒瓶中產(chǎn)生足夠的細(xì)胞，那么可將細(xì)胞直接接種到按比例放大量的微載體中。附著期之后，提高旋轉(zhuǎn)板的速度(30-120RPM)。每一到五天或當(dāng)根據(jù)顏色變化培養(yǎng)基似乎耗盡時(shí)為細(xì)胞供給新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。當(dāng)濃度達(dá)到預(yù)期適應(yīng)癥所需的細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞并且使用胰蛋白酶-EDTA收集細(xì)胞。注射用藥品的所有出廠測(cè)試、低溫保存以及制備將遵循部分C和D中所述的工藝。一次性旋轉(zhuǎn)燒瓶中所用的微載體可由以下材料制成聚合物共混體(polyblend),如BioNOC II (賽宇生物工程公司(CescoBioengineering),由貝爾克生物技術(shù)公司(Bellco Biotechnology)配送，瓦恩蘭(Vineland),新澤西州(NJ))以及FibraCei (新布倫茲威克科學(xué)儀器公司(New Brunswick Scientific),埃迪遜(Edison),新澤西州(NJ));明膠,如 Cultispher-G(派賽爾生物公司(Percell Biolytica),阿斯托(Astrop),瑞典(Sweden));纖維素,如Cytopore (通用電氣醫(yī)療健康集團(tuán)(GE Healthcare),皮斯卡塔韋(Piscataway),新澤西州(NJ));或經(jīng)過涂布/未經(jīng)過涂布的聚苯乙烯，如2D MicroHex (能肯公司(Nunc),威斯巴登(Weisbaden),德國(guó)(Germany));Cytodexfe(通用電氣醫(yī)療健康集團(tuán)(GE Healthcare),皮斯卡塔韋(Piscataway),新澤西州(NJ))或 Hy-Q Sphere (賽默飛世爾科技公司(ThermoScientific Hyclone),洛根(Logan),猶他州(UT))?；蛘撸稍诰酆衔锕不祗w2D微載體(如BioNOCn 以及FibraCel )上，使用自動(dòng)波紋系統(tǒng)(如FibraStage (新布倫茲威克科學(xué)儀器公司(New Brunswick Scientific),埃迪遜(Edison),新澤西州(NJ))或BelloCell (賽宇生物工程公司(Cesco Bioengineering),由貝爾克生物技術(shù)公司(Bellco Biotechnology)配送，瓦恩蘭(Vineland),新澤西州(NJ)))代替旋轉(zhuǎn)燒瓶設(shè)備加工細(xì)胞。將細(xì)胞從T-175 (或替代物)或T-500燒瓶(或替代物)繼代培養(yǎng)到含有微載體和適當(dāng)量的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基的波紋瓶中，并且放置到系統(tǒng)中。所述系統(tǒng)將培養(yǎng)基泵送到微載體之上以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行供料，并且吸走培養(yǎng)基以允許在重復(fù)固定周期中進(jìn)行氧化。以與上文所述相同的順序?qū)?xì)胞進(jìn)行監(jiān)控，供料，洗滌并收集?；蛘?，可使用自動(dòng)化系統(tǒng)加工細(xì)胞。在消化活檢體組織之后或在完成第一次繼代培養(yǎng)(T-175燒瓶或替代物)之后，可將細(xì)胞接種到自動(dòng)化裝置中。一種方法為自動(dòng)化細(xì)胞擴(kuò)增(ACE)系統(tǒng)，它是一系列可商購(gòu)的或?qū)ｉT制造的連接在一起形成細(xì)胞生長(zhǎng)平臺(tái)的組件，在所述平臺(tái)中細(xì)胞可在無人為干預(yù)下擴(kuò)增。細(xì)胞在細(xì)胞塔中擴(kuò)增，所述細(xì)胞塔由能夠支持貼壁依賴性細(xì)胞附著的圓盤堆疊組成。所述系統(tǒng)自動(dòng)循環(huán)培養(yǎng)基且進(jìn)行胰蛋白酶處理以便在完成細(xì)胞擴(kuò)增階段后加以收集?；蛘?，可將ACE系統(tǒng)按比例縮小成單批次單元型式，其包含由以下組成的一次性組件細(xì)胞生長(zhǎng)表面、遞送管道、培養(yǎng)基和試劑，以及安置用于加熱/冷卻、培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移以及執(zhí)行自動(dòng)化編程周期的機(jī)構(gòu)以及計(jì)算機(jī)處理容量的永久基座。驗(yàn)收后，將每個(gè)經(jīng)過無菌照·射的ACE —次性單元從它的包裝中打開并且通過懸掛預(yù)先填充的袋子并將袋子通過無菌連接器連接到現(xiàn)有管道來裝載培養(yǎng)基和試劑。工藝如下繼續(xù)進(jìn)行在生物安全柜(BSC)中，將來自已經(jīng)過酶消化的活檢體的細(xì)胞的懸浮液引入到已經(jīng)填充有含有抗生素的起始生長(zhǎng)培養(yǎng)基的“前生長(zhǎng)腔室”(細(xì)胞塔頂部的小單元)中。將一次性物品從BSC轉(zhuǎn)移到已處于適當(dāng)位置處的永久ACE單元中。約三天后，對(duì)前生長(zhǎng)腔室內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理并且引入到預(yù)填充有完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基的細(xì)胞塔本身中。此處，通過CO2注射引起的“鼓泡作用”迫使培養(yǎng)基以使得細(xì)胞螺旋向下并且以均勻分布的方式沉降在圓盤表面上的速率循環(huán)。持續(xù)約七天，使細(xì)胞倍增。此時(shí)，檢查匯合度(在寫作當(dāng)時(shí)方法未知)以核實(shí)培養(yǎng)物正在生長(zhǎng)中。此時(shí)，還將完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基用新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換。每七天替換CGM，持續(xù)三到四周。在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，再一次檢查匯合度以核實(shí)有充分生長(zhǎng)，從而可能得到用于預(yù)期治療的所需量的細(xì)胞。如果培養(yǎng)物充分匯合，那么就將其收集。從容器中排出耗盡的培養(yǎng)基(上清液)。接著將PBS泵送到容器中(用以洗滌培養(yǎng)基，來自細(xì)胞的FBS)并且?guī)缀趿⒓磁懦?。將胰蛋白?EDTA泵送到容器中以使細(xì)胞從生長(zhǎng)表面脫離。將胰蛋白酶/細(xì)胞混合物從容器中排出并且進(jìn)入旋轉(zhuǎn)分離器。將低溫保存劑泵送到容器中以從圓盤表面沖洗去任何殘余細(xì)胞，并且同樣送到旋轉(zhuǎn)分離器。旋轉(zhuǎn)分離器收集細(xì)胞，接著使細(xì)胞均勻地再懸浮于運(yùn)送/注射培養(yǎng)基中。從旋轉(zhuǎn)分離器，細(xì)胞將通過自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置發(fā)送或收集樣品以通過實(shí)驗(yàn)室分析進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力測(cè)試。一旦已計(jì)數(shù)到特定數(shù)目的細(xì)胞并且已達(dá)到適當(dāng)細(xì)胞濃度，即將所收集的細(xì)胞遞送到收集小瓶中，可移出所述收集小瓶以將樣品等分用于低溫冷凍。或者，可使用自動(dòng)化機(jī)器人系統(tǒng)在工藝的整個(gè)長(zhǎng)度或在一部分中進(jìn)行細(xì)胞供料、繼代培養(yǎng)以及收集?？蓪⒓?xì)胞在消化并接種到T-175燒瓶(或替代物)中之后直接引入到機(jī)器人裝置中。所述裝置可具有培育細(xì)胞、進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活力分析以及進(jìn)行供料并轉(zhuǎn)移到更大培養(yǎng)容器中的能力。所述系統(tǒng)還可以具有計(jì)算機(jī)化編目功能以追蹤個(gè)別批次。對(duì)于機(jī)器人選項(xiàng)可使用現(xiàn)有技術(shù)或定制系統(tǒng)。
P.劑量單位用于制備最終劑量單位的冷凍小瓶裝原料藥由成纖維細(xì)胞組成，所述成纖維細(xì)胞是從最終培養(yǎng)容器中收集，調(diào)配成所需細(xì)胞濃度并且在冷凍小瓶中低溫保存。將冷凍小瓶裝原料藥存儲(chǔ)在由MDM和Profreeze 加7. 5%DMS0組成的低溫保存培養(yǎng)基中，達(dá)到
2.2X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的目標(biāo)。在經(jīng)歷控制速率冷凍周期之后，將冷凍小瓶裝原料藥冷凍存儲(chǔ)在液氮冷凍器的氣相中。將所收集的細(xì)胞匯集，在包括Profreeze、DMSO以及MDM培養(yǎng)基的低溫保存培養(yǎng)基中調(diào)配，等分到冷凍小瓶中，并且通過控制速率冷凍而作為冷凍小瓶裝原料藥材料冷凍存儲(chǔ)在液氣中。對(duì)瓶蓋和小瓶進(jìn)行輻射滅菌并且從制造商處無菌接收。從冷凍存儲(chǔ)中移出治療所需要的所需體積的散裝材料，解凍并匯集。用4X散裝體積的PBS洗滌細(xì)胞并且以150Xg離心10分鐘(5±3°C)。此后通過再懸浮用4X散裝體積的DMEM洗滌并且以150Xg離心 10分鐘(5±3°C)。使經(jīng)過洗滌的細(xì)胞再懸浮于不含酚紅的DMEM中，達(dá)到1.0-2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的目標(biāo)濃度。或者，可用Hypothermosol -FRS (美國(guó)生物科技公司(BioLifeSolutions),巴薩爾(Bothell),華盛頓州(WA))進(jìn)行第二次4X洗漆以及最終再懸浮。接著在生物安全柜中將最終無菌冷凍小瓶容器手動(dòng)填充到I. 2毫升/容器的體積。在2-8°C下存儲(chǔ)注射用藥品直到在2-8°C下冷藏的運(yùn)送器材中運(yùn)送到投藥場(chǎng)所為止。或者，可從低溫存儲(chǔ)中移出原料藥小瓶并且直接運(yùn)送到投藥場(chǎng)所以供稀釋和投藥。在直接注射概念中，收集細(xì)胞并且制備用于在較高細(xì)胞濃度(3. 0-4. O X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升，與2. 2X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的當(dāng)前目標(biāo)相比)下低溫保存。在等待注射時(shí)，將冷凍的小瓶在干冰上或液氮杜瓦瓶(dewar)中運(yùn)送到研究場(chǎng)所。在投藥場(chǎng)所用手或用加熱塊將小瓶解凍，并且在研究場(chǎng)所使用典型的注射稀釋劑對(duì)冷凍細(xì)胞進(jìn)行1:1比率稀釋，所述注射稀釋劑如抑菌水、無菌水、氯化鈉或磷酸鹽緩沖鹽水?；蛘?，可使用DMEM作為稀釋劑。此概念消除了對(duì)洗滌并制備新鮮的注射懸浮液用于連夜運(yùn)送到研究場(chǎng)所的需要?；蛘?，可將從燒瓶或細(xì)胞堆疊中新鮮收集的細(xì)胞在DMEM中調(diào)整到1.0-2. OXlO7個(gè)細(xì)胞/毫升的目標(biāo)濃度，經(jīng)歷上文所述的所有散裝收集物和冷凍小瓶裝原料藥測(cè)試，并且作為最終注射產(chǎn)品在2-8°C下冷藏的運(yùn)送器材中連夜新鮮運(yùn)送到投藥場(chǎng)所。在此種情況下，可在收集上游進(jìn)行無菌和支原體測(cè)試以在運(yùn)送之前留有出結(jié)果的時(shí)間。II.投藥方法A.制備劑量單位azficel-T Azficel_T注射用藥品由每個(gè)患者自身所生存的自體成纖維細(xì)胞調(diào)配在不含酚紅的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中的懸浮液組成。Azficel-T成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物以兩個(gè)2mL小瓶供應(yīng)，每個(gè)小瓶含有I. 2mL的I. 0-2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的藥品。打算將無菌細(xì)胞懸浮液用于真皮內(nèi)注射。最初，在由FDA規(guī)范Azficel-T成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物之前，Azficel-成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物的細(xì)胞劑量是基于由臨床醫(yī)師投予的細(xì)胞數(shù)。成功地使用每1.2-1. 4mL注射液I. 5-7. OX IO7個(gè)細(xì)胞的劑量范圍。粘度成為濃度高于此范圍的成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物注射液的問題。此劑量范圍轉(zhuǎn)換成I. 1-5. SXlO7A細(xì)胞/毫升。在IND下進(jìn)行的第一臨床研究中，調(diào)配0. 5-3. O X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升。在第二臨床研究中，調(diào)配I. 0-3. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升。所有后續(xù)臨床研究的標(biāo)準(zhǔn)出廠規(guī)格為I. 0-2. OX IO7
個(gè)細(xì)胞/毫升。在稍后的臨床研究IT-R-005和IT-R-006中，提供在兩個(gè)2. OmL冷凍小瓶中的每個(gè)小瓶中調(diào)配成I. 0-2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的I. 2mL成纖維細(xì)胞的溶液。在所提供的2. 4mL中，打算將2. OmL用于以每線性厘米長(zhǎng)度O. ImL的劑量注射，用于面部?jī)蓚?cè)總共20cm的最大預(yù)測(cè)鼻唇溝長(zhǎng)度。打算過量O. 2mL以確保可從小瓶中獲得I. OmL，從而治療至多10線性厘米長(zhǎng)度的鼻唇溝。B.投予劑量單位將小瓶加溫到室溫并且輕輕倒置以使沉降的細(xì)胞再懸浮。使用配備有可拆卸針或固定針的小單位注射器從容器中抽出細(xì)胞懸浮液。推薦使用短而尖的針和小單位注射器(例如O. 5mL胰島素注射器)來實(shí)現(xiàn)較佳的注射控制并且降低發(fā)炎風(fēng)險(xiǎn)。產(chǎn)品的真皮內(nèi)注射 需要29號(hào)或30號(hào)針。然而，可使用具有更大孔的21號(hào)可拆卸針的注射器以幫助從容器中抽出產(chǎn)品。一旦抽出，即可將21號(hào)針切換成30號(hào)針并且投予產(chǎn)品。一個(gè)批次由三次注射治療組成。對(duì)于治療鼻唇溝皺紋，單次注射治療(批次)需要兩個(gè)含有I. 2毫升/小瓶的azficelAzficel-T成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物的2mL小瓶。C.待治療的病狀皮膚的老化過程由內(nèi)在和外在兩種因素引發(fā)。促成內(nèi)在或自然老化的因素為結(jié)構(gòu)性和功能性因素。在結(jié)構(gòu)方面，表皮變得較薄，角質(zhì)細(xì)胞粘附性較小并且真皮-表皮接合處變平。在功能方面，成纖維細(xì)胞的數(shù)目和生物合成能力減小并且真皮變得萎縮并且相對(duì)無細(xì)胞以及無血管。暴露于紫外光輻射是外在老化或光老化的主要原因。外在老化特征為彈性缺失、粗糙度和干燥度增加、不規(guī)則的色素沉著、深皺紋形成、革質(zhì)外觀、形成皰疤以及傷口愈合減退?？梢姷睦匣庥^，尤其面部皺紋和溝，為患者設(shè)法要減少的常見結(jié)果。治療面部紋路、皺紋以及溝的選項(xiàng)包括外科手術(shù)、神經(jīng)毒素、填充劑、激光、非剝脫性療法、微晶磨皮術(shù)(microdermabrasion)以及化學(xué)去皮。這些治療中有許多在治療老化征象中的安全性、功效以及作用持續(xù)時(shí)間方面有所不同。相信本文所述的調(diào)配物會(huì)增加真皮中產(chǎn)生膠原蛋白的細(xì)胞的數(shù)目，其可能對(duì)改善皮膚具有多因子作用。使用自體人類成纖維細(xì)胞來治療輪廓畸形是由威廉K.波斯(WilliamK. Boss) , MD,哈肯薩克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)整形科副主席(Vice Chairman of theDepartment of Plastic Surgery at HackensackUniversity Medical Center)首創(chuàng)。他在真皮修復(fù)區(qū)域中所進(jìn)行的工作始于1992年。他從患者手腕中移出一小片皮膚，培養(yǎng)來自活檢體的自體成纖維細(xì)胞，將自體細(xì)胞注射到患者手腕皮膚中的皺褶中，并且觀察到皺褶隨著時(shí)間推移而消失。他連續(xù)數(shù)年觀察所述區(qū)域并且注意到測(cè)試部位的皺褶保持被修正。對(duì)此單次治療無不良反應(yīng)。在1995年3月進(jìn)行小型臨床試驗(yàn)。最初，將自體培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分兩到三次注射到約12名個(gè)體的所選皺皮和瘢痕中。追蹤12個(gè)月之后，在每個(gè)個(gè)體中都注意到進(jìn)行性的改善。波斯博士(Dr. Boss)和馬科博士(Dr. Marko)報(bào)導(dǎo)了治療超過100名患者，在超過2年半的觀察期內(nèi)未觀察到過敏反應(yīng)或不良反應(yīng)的征象。在1995年12月，自體成纖維細(xì)胞在美國(guó)可商購(gòu)得到。美國(guó)商業(yè)經(jīng)歷包括在皮膚學(xué)、面部整形外科以及再造整形外科領(lǐng)域中的約100名臨床醫(yī)師，他們治療具有面部皺皮、瘢痕、唇部發(fā)育不全、燒傷以及其他問題的患者。報(bào)導(dǎo)了近1，OOO名患者的患者經(jīng)歷，其中354名被納入到信息回顧報(bào)告的功效群體中。在加州大學(xué)洛杉肌分校(Universityof California Los Angeles, UCLA)對(duì) 10名健康成人進(jìn)行使用成纖維細(xì)胞懸浮液的真皮內(nèi)注射用于治療顯著的面部皺皮以及凹陷的面部瘢痕的試點(diǎn)研究。以3周的時(shí)間間隔進(jìn)行兩(2)個(gè)注射期之后，十名患者中有九名注意到治療實(shí)現(xiàn)的60-100%改善；臨床醫(yī)師觀察到類似觀察結(jié)果。通過光學(xué)測(cè)量(激光)證實(shí)所有經(jīng)過治療的畸形的尺寸減小10-85%。在顯微鏡下，有證據(jù)表明真皮層的厚度和密度增加。研究已顯示，將成纖維細(xì)胞懸浮液注射到真皮的輪廓缺陷中可使受損真皮和皮下組織得到修正。皮膚的真皮含有成纖維細(xì)胞，其主要負(fù)責(zé)分泌細(xì)胞外基質(zhì)組分，如膠原蛋白和彈性蛋白，所述組分為皮膚提供機(jī)械強(qiáng)度和完整性。雖然確切的機(jī)理未知，但是成纖維細(xì)胞懸浮液含有自體成纖維細(xì)胞，所述成纖維細(xì)胞當(dāng)注射到患者皮膚中時(shí)會(huì)增加細(xì)胞外基質(zhì)組分的合成，由此增強(qiáng)皮膚完整性，最終使得細(xì)紋和皺紋減少。所述療法的效果并非即時(shí) 的，而是提供紋路和皺紋的外觀隨著時(shí)間推移的逐漸改善。成纖維細(xì)胞懸浮液最初在1995年由威廉波斯博士(Dr. WilliamBoss)進(jìn)行的臨床研究中評(píng)估，接著從1995年12月到1999年2月在美國(guó)作為面部輪廓畸形的美容治療而投放市場(chǎng)。1999年2月之后，F(xiàn)DA被要求在PHS法案下規(guī)范所有體細(xì)胞療法。依據(jù)成纖維細(xì)胞懸浮液將歸入新的細(xì)胞和組織法規(guī)下的FDA通告，商業(yè)流通停止并且開始依據(jù)8641號(hào)新藥研究申請(qǐng)(IND)進(jìn)行臨床開發(fā)。在兩項(xiàng)II期研究(研究IT-R-001和 IT-R-007)以及五項(xiàng) III 期研究(研究 IT-R-002、IT-R-003A、IT-R-003B、IT-R-005 以及IT-R-006)中進(jìn)行關(guān)于治療面部皺紋和皺褶的研究。研究IT-R-003A、IT-R-003B、IT-R-005以及IT-R-006提供穩(wěn)固的、受到良好控制的資料，其展示成纖維細(xì)胞懸浮液的安全性和功效概況。在痤瘡瘢痕的治療中研究成纖維細(xì)胞懸浮液(研究IT-A-008 ；13455號(hào)IND)。在研究IT-A-008期間99名個(gè)體接受成纖維細(xì)胞懸浮液治療。亦開發(fā)成纖維細(xì)胞懸浮液用于其他適應(yīng)癥，包括治療限制性燒傷瘢痕(13308號(hào)IND)、聲帶瘢痕(9892號(hào)IND)以及牙齦修復(fù)(10805 號(hào) IND)ο更早期的001和002試驗(yàn)提供支持性的探索性資料，其指導(dǎo)003A/B和005/006試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。研究IT-R-001為成纖維細(xì)胞懸浮液用于治療皺皮(治療鼻唇和唇頰溝、口周紋、眉間紋、痤瘡瘢痕以及前額)的II期雙盲、隨機(jī)化以及安慰劑對(duì)照的研究。在研究的急性期，每個(gè)個(gè)體接受成纖維細(xì)胞懸浮液(O. 5 X IO7,1. O X IO7或2. O X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升)或安慰劑的三次治療，投藥間隔約兩周。在研究的急性期個(gè)體(40)用成纖維細(xì)胞懸浮液(N=30)或安慰劑(N=IO)治療。研究IT-R-002為成纖維細(xì)胞懸浮液用于治療面部輪廓畸形和瘢痕的III期雙盲、隨機(jī)化以及安慰劑對(duì)照的研究。在此研究的急性期，每個(gè)個(gè)體接受含有2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的成纖維細(xì)胞懸浮液或安慰劑的三次治療，每14±7天進(jìn)行投藥。在研究的急性期個(gè)體(151)用成纖維細(xì)胞懸浮液(N=112)或安慰劑(N=39)治療。在兩個(gè)研究中，在試驗(yàn)的急性期個(gè)體(213)用成纖維細(xì)胞懸浮液(N=IOO)或安慰劑(N=113)治療。雖然研究IT-R-003B對(duì)兩個(gè)聯(lián)合初級(jí)終點(diǎn)顯示出功效，但是研究IT-R-003A中的一個(gè)聯(lián)合初級(jí)終點(diǎn)未能滿足統(tǒng)計(jì)顯著性準(zhǔn)則(對(duì)于研究者評(píng)估)，因而產(chǎn)生兩個(gè)新的方案作為成纖維細(xì)胞懸浮液的關(guān)鍵III期試驗(yàn)(研究IT-R-005和IT-R-006)。相信003A中錯(cuò)失終點(diǎn)的原因在于包括了次最佳的給藥。細(xì)胞濃度保持相同，但是所遞送的體積增加。鑒別出其他原因，包括培訓(xùn)技術(shù)以及一系列注射之間的時(shí)間。研究IT-R-005和IT-R-006為成纖維細(xì)胞懸浮液在治療鼻唇溝皺紋中的功效和安全性的III期多中心、雙盲、隨機(jī)化、安慰劑對(duì)照的研究。依據(jù)服從FDA SPA協(xié)議的相同方案進(jìn)行這些研究。在這些研究的急性期，每個(gè)個(gè)體接受含有I. 0-2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的成纖維細(xì)胞懸浮液或安慰劑的三次治療，每5周±1周進(jìn)行投藥。在研究IT-R-005中，83名個(gè)體用成纖維細(xì)胞懸浮液治療并且92名個(gè)體用安慰劑治療。在研究IT-R-006中，98名個(gè)體用成纖維細(xì)胞懸浮液治療并且99名個(gè)體用安慰劑治療。研究IT-R-007為成纖維細(xì)胞懸浮液在治療面部皺紋和皺褶中的安全性和功效的II期多中心、開放標(biāo)記研究，所述研究經(jīng)過設(shè)計(jì)以獲得關(guān)于使用成纖維細(xì)胞懸浮液用于除鼻唇溝以外的用途的安全性和功效資料。在此研究的急性期，每個(gè)個(gè)體接受至多6mL的含有I. 0-2. O X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的成纖維細(xì)胞懸浮液的兩次治療，每5周± 10天進(jìn)行投藥。在研究的急性期期間，45名個(gè)體用成纖維細(xì)胞懸浮液治療。此研究將個(gè)體暴露于總劑量為·005/006研究中所用的總劑量的三倍的成纖維細(xì)胞懸浮液。入選到成纖維細(xì)胞的III期關(guān)鍵功效試驗(yàn)，即研究IT-R-005和IT-R-006(005/006)中的個(gè)體群體主要為年齡在50歲與60歲之間的女性白種人。個(gè)體年齡在23-82歲的范圍內(nèi)，平均年齡為56. I歲。入選到研究中時(shí)個(gè)體的鼻唇溝皺紋的嚴(yán)重程度在評(píng)估者皺紋嚴(yán)重程度評(píng)估量表上的3-5級(jí)范圍內(nèi)，右側(cè)皺紋的平均評(píng)分為3. 7并且左側(cè)皺紋的平均評(píng)分為3.6。入選到III期IT-R-003A和IT-R_003B(003A/B)研究中的群體類似于005/006中的群體。女性占003A/B研究中群體的94%并且群體的95%為白種人。在兩項(xiàng)研究中個(gè)體的平均年齡為54. I歲。雖然003A/B方案在設(shè)計(jì)方面極類似于005/006方案，但是003A/003B允許皺紋嚴(yán)重程度在更寬范圍內(nèi)的個(gè)體入選，在入選時(shí)初級(jí)鼻唇溝畸形的評(píng)分在評(píng)估者量表上的2-5級(jí)范圍內(nèi)，但是平均嚴(yán)重程度評(píng)分類似地為3. 9。所有關(guān)鍵功效研究都使用由個(gè)體自我評(píng)估手段以及臨床研究者進(jìn)行的評(píng)估組成的聯(lián)合初級(jí)終點(diǎn)。 在005/006研究中，聯(lián)合初級(jí)功效終點(diǎn)為個(gè)體皺紋評(píng)估使用5點(diǎn)皺紋評(píng)估量表在隨訪6時(shí)對(duì)面部下端部分的皺紋進(jìn)行的個(gè)體活動(dòng)期綜合評(píng)估，其中反應(yīng)定義為與基線相比時(shí)量表上兩個(gè)點(diǎn)或更佳的改善。評(píng)估者皺紋嚴(yán)重程度評(píng)估使用6點(diǎn)順序皺紋嚴(yán)重程度量表使用光導(dǎo)在隨訪6時(shí)對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的兩側(cè)鼻唇溝皺紋進(jìn)行的不知情評(píng)估者活動(dòng)期評(píng)估，其中反應(yīng)定義為與基線相比量表上兩個(gè)點(diǎn)或更佳的改善。選擇這些終點(diǎn)以提供公正評(píng)估(由不知情醫(yī)師評(píng)級(jí))以及臨床相關(guān)性(個(gè)體對(duì)其自身外貌的看法)。評(píng)估者皺紋嚴(yán)重程度評(píng)估所用的量表為用于評(píng)估鼻唇溝(NLF)的6點(diǎn)順序皺紋嚴(yán)重程度量表，所述量表由藍(lán)博(Lemperle)等人，整形和再造外科學(xué)(Plast Reconstr Surg. ) 2001108 (6) : 1735-50 開發(fā)并驗(yàn)證。藍(lán)博量表(Lemperlescale)已經(jīng)過驗(yàn)證以檢測(cè)鼻唇溝皺紋的嚴(yán)重程度的一個(gè)點(diǎn)的改善。然而，因?yàn)橥庥^的評(píng)估可能是主觀的并且傾向于可變化，因此此終點(diǎn)的成功定義為每個(gè)NLF的兩個(gè)點(diǎn)的改善，SP，對(duì)于指定患者，左側(cè)與右側(cè)NLF在評(píng)估者的評(píng)估中都必需有兩個(gè)點(diǎn)的改善以便被視為反應(yīng)者。藍(lán)博量表為皮膚學(xué)領(lǐng)域中公認(rèn)的度量標(biāo)準(zhǔn)，且已成功地用于經(jīng)過FDA批準(zhǔn)的產(chǎn)品在類似適應(yīng)癥中的關(guān)鍵臨床試驗(yàn)中。個(gè)體皺紋評(píng)估所用的量表是基于由科恩(Cohen)和霍姆斯(Holmes),整形和再造外科學(xué)(Plast Reconstr Surg. ) 200415; 114(4) :964-76使用的公開量表。如同評(píng)估者評(píng)估一樣，確立兩個(gè)點(diǎn)的改善作為對(duì)治療的成功反應(yīng)的準(zhǔn)則。003A/B研究經(jīng)設(shè)計(jì)成具有類似的聯(lián)合初級(jí)終點(diǎn)，但是使用不同于005/006研究的個(gè)體評(píng)估工具。如003A/B方案中所規(guī)定。聯(lián)合初級(jí)功效終點(diǎn)為使用研究者的6點(diǎn)順序量表以及個(gè)體的VAS評(píng)估在6個(gè)月隨訪時(shí)在初級(jí)鼻唇溝中成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物注射液的功效。方案中所提及的6點(diǎn)順序量表為 005/006研究中所用的相同藍(lán)博量表，不過005/006研究為量表上的每個(gè)點(diǎn)提供比003A/B研究中所用的更具描述性的文本。視覺類比量表用于個(gè)體評(píng)估。此量表要求個(gè)體通過在IOcm線上放置記號(hào)而將每個(gè)輪廓畸形從O(無缺陷)到100 (極嚴(yán)重缺陷)分級(jí)。雖然兩項(xiàng)研究使用此評(píng)估工具都滿足改善的統(tǒng)計(jì)顯著性，但是在005/006研究中VAS量表用順序個(gè)體皺紋評(píng)估量表替換以改善個(gè)體評(píng)估資料的臨床相關(guān)性以及可解釋性。005/006兩項(xiàng)研究的結(jié)果展示IT治療的個(gè)體與安慰劑治療的個(gè)體之間的反應(yīng)有極其顯著的差異，如兩個(gè)聯(lián)合初級(jí)終點(diǎn)所度量。在003A/B研究中，對(duì)于四個(gè)終點(diǎn)中的三個(gè)終點(diǎn)觀察到IT治療的個(gè)體與安慰劑治療的個(gè)體之間的反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)顯著差異。在研究IT-R-003A中，IT治療的個(gè)體通過評(píng)估者評(píng)估而評(píng)為反應(yīng)者的百分比高于安慰劑治療的個(gè)體，但是差異并不滿足統(tǒng)計(jì)顯著性。使用相同研究方案同時(shí)進(jìn)行研究IT-R-005和IT-R-006，因此在研究設(shè)計(jì)方面沒有差異。還在獨(dú)立的方案下同時(shí)進(jìn)行研究IT-R-003A和IT-R-003B。盡管如此，在每個(gè)研究組內(nèi)結(jié)果仍有差異。在005/006研究中成功地滿足所有初級(jí)終點(diǎn)，但是其中005研究報(bào)導(dǎo)了在成纖維細(xì)胞懸浮液治療組中的反應(yīng)者比率對(duì)于個(gè)體和評(píng)估者評(píng)估分別為57%和33%，006研究報(bào)導(dǎo)了反應(yīng)者比率對(duì)于相同量度為46%和19%。在003A研究中，在評(píng)估者評(píng)估中IT治療組中21%的個(gè)體被評(píng)為反應(yīng)者,而在成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物組中48%的個(gè)體根據(jù)此量度在研究IT-R-003B中有反應(yīng)。在005/006研究中，在兩個(gè)試驗(yàn)之間的患者人口統(tǒng)計(jì)(性別、種族、年齡或基線嚴(yán)重程度)方面沒有顯著差異。然而，在每個(gè)研究?jī)?nèi)在部位之間觀察到反應(yīng)率的可變性。隨后，對(duì)參與的所有研究者進(jìn)行培訓(xùn)以使用相同技術(shù)進(jìn)行鼻唇溝注射，且期望證明他們可以產(chǎn)生如對(duì)于注射到乳頭狀真皮中所期望產(chǎn)生的“水皰”。此在IT-R-003試驗(yàn)之前不進(jìn)行。還觀察到評(píng)估方法的差異。部位差異當(dāng)與這些觀察結(jié)果相結(jié)合時(shí)得出結(jié)論部位之間的許多不一致性可能由于在注射技術(shù)與評(píng)估方面都缺乏普通培訓(xùn)而引起。在回顧并分析來自003A/B研究的資料之后設(shè)計(jì)005/006研究。作為此回顧的結(jié)果，與003A/B研究相比作出許多修改以設(shè)計(jì)005/006方案。表6中提供可能促成觀察到的初級(jí)終點(diǎn)結(jié)果的差異的修改的概述。劑量和給藥方案的影響面部皺皮和鼻唇溝用于治療鼻唇溝的所選劑量(至多2mL的I. 0-2. O X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升，每線性厘米長(zhǎng)度投予O. ImL)不但基于在IND 8641下進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中產(chǎn)生的資料，而且基于在美國(guó)和國(guó)外通過商業(yè)上使用成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物所獲得的信息。研究IT-R-OOl為安慰劑對(duì)照的II期劑量范圍研究，其評(píng)估O. 5、I. O以及2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的成纖維細(xì)胞懸浮液(每線性厘米長(zhǎng)度O. ImL)相對(duì)于安慰劑在治療面部皺皮中的安全性和初步功效。在最高劑量組(2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升)中，基線到初始注射之后四個(gè)月(研究IT-R-001的初級(jí)功效時(shí)間點(diǎn))得到最佳結(jié)果。因此，此為所有后續(xù)研究中所用的細(xì)胞密度。在003A/B研究中，每線性厘米長(zhǎng)度的劑量與針對(duì)此適應(yīng)癥的其他azficel-T成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物研究中所用的劑量相同(每線性厘米長(zhǎng)度O. lmL)。然而，每個(gè)治療的總劑量在總共IOcm的總治療區(qū)域上被限制為lmL。此差異是因?yàn)檠芯?03A/B不可用于治療有時(shí)稱為近中唇溝皺紋的皺紋，其為從嘴角朝下巴向下延伸的溝或皺紋。在005/006中將總劑量增加到2mL，以允許治療近中唇溝皺紋，因?yàn)樗３Ｅc鼻唇溝皺紋相連并且因此為促成整體審美效果的組分。雖然所允許的總劑量并不是003A/B方案與005/006方案之間的唯一差異，但是所投予的產(chǎn)品體積的此增加被視為從005/006研究獲得的成功結(jié)果的促成因素?！せ谘芯空邚?03A/B研究提供的反饋以及005/006試驗(yàn)的結(jié)果來確定5周±1周的推薦給藥時(shí)間間隔。003A/B研究者建議使用艾斯麗質(zhì)(Isolagen)，它在那些研究中的治療之間的時(shí)間(7到14天)不足以允許由一次注射誘發(fā)的發(fā)炎在施予下一次注射之前消退。此發(fā)炎持續(xù)時(shí)間只有在注射過程中才被注意到并且未被報(bào)導(dǎo)為不良事件。當(dāng)在方案所允許的更長(zhǎng)時(shí)間間隔下施予連續(xù)注射時(shí)，研究者報(bào)導(dǎo)注射部位更有可能似乎更接近于正常皮膚，此引起對(duì)注射深度和體積的更大控制。此使得在005/006研究中延長(zhǎng)注射之間的時(shí)間間隔，首先延長(zhǎng)到4周，接著延長(zhǎng)到5周±1周。此變化也被視為成功的005/006研究結(jié)果的促成因素。在005/006研究中對(duì)意向治療群體(Intent to Treat Population)的初級(jí)功效分析評(píng)估成纖維細(xì)胞懸浮液與安慰劑治療組之間的治療反應(yīng)，如聯(lián)合初級(jí)功效終點(diǎn)所度量。對(duì)于隨訪6時(shí)的評(píng)估者皺紋嚴(yán)重程度評(píng)估(聯(lián)合初級(jí)功效終點(diǎn))，26%的IT隨機(jī)化個(gè)體相對(duì)于7%的安慰劑隨機(jī)化個(gè)體顯示兩側(cè)鼻唇溝皺紋有兩個(gè)點(diǎn)的改善。當(dāng)只將實(shí)際上接受成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物或安慰劑的至少一次治療的那些個(gè)體納入到分析中(修正型意向治療(MITT)群體)時(shí)，在評(píng)估者皺紋嚴(yán)重程度評(píng)估上兩個(gè)點(diǎn)反應(yīng)的百分比在IT治療的個(gè)體中為30%，相比之下安慰劑治療的個(gè)體為8%。在評(píng)估者皺紋嚴(yán)重程度評(píng)估上MITT群體中的一個(gè)點(diǎn)反應(yīng)率在成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物治療的個(gè)體中為64%并且在安慰劑治療的個(gè)體中為36%。最后，在使用IT時(shí)所觀察的微秒的作用起始的示范中，由評(píng)估者和個(gè)體對(duì)功效進(jìn)行的照相評(píng)估顯示在IT治療的個(gè)體與安慰劑治療的個(gè)體之間的治療反應(yīng)中有高度統(tǒng)計(jì)顯著差異。當(dāng)評(píng)估者將基線時(shí)獲取的個(gè)體照片與最后功效隨訪時(shí)獲取的照片并列比較時(shí)，MITT群體中57%的IT治療個(gè)體以及此群體中只有20%的安慰劑治療個(gè)體被評(píng)為有改善。在個(gè)體的照相評(píng)估(個(gè)體改善評(píng)估)上，當(dāng)個(gè)體將其自身的基線照片與在最后功效隨訪時(shí)獲取的照片比較時(shí)，67%的IT治療個(gè)體以及26%的安慰劑治療個(gè)體顯示出改善。使用此評(píng)估手段所獲得的反應(yīng)率相比于活動(dòng)期評(píng)估結(jié)果有所增加，顯示微秒的、逐漸的作用起始，其在將外觀與基線比較之前可能不為個(gè)體或評(píng)估者所顯見。總之，出于上文所論述的原因，用于治療鼻唇溝皺紋的優(yōu)選劑量為在每個(gè)治療期將I到2mL的劑量調(diào)配物以每線性厘米長(zhǎng)度O. ImL的劑量分布注射到皺紋的淺表乳頭狀真皮中，優(yōu)選持續(xù)三個(gè)治療期，隔開五周加減七到十天。用于治療多個(gè)面部區(qū)域(即“全面部”)中的皺皮的優(yōu)選劑量為在每個(gè)治療期將5到6mL的劑量調(diào)配物根據(jù)圖4中的治療圖以每線性厘米長(zhǎng)度O. 05mL的劑量分布注射到淺表乳頭狀真皮中，優(yōu)選持續(xù)一個(gè)或兩個(gè)治療期，隔開五周加減七到十天。癉瘡瘢痕可使用經(jīng)過驗(yàn)證的方法以及醫(yī)師客觀評(píng)估的痤瘡瘢痕嚴(yán)重程度的活 動(dòng)期分級(jí)的量表，即“評(píng)估者活動(dòng)期痤瘡瘢痕評(píng)估量表”來確定用于治療痤瘡瘢痕的適當(dāng)劑量，所述量表采用在直接和切線照明下相對(duì)瘢痕外觀的比較性評(píng)估，參考圖2。表I.評(píng)估者活動(dòng)期痤瘡瘢痕評(píng)估量表
等級(jí)術(shù)語___
0透明在治療區(qū)域中未見凹陷?？梢婞S斑部變色。
在直接照明下可容易地注意到單個(gè)凹陷(深)。
1極輕微所見的大多數(shù)或所有凹陷只有在切線照明下
Γ 才顯而易見(淺)。---
在直接照明不可容易地注意到極少到數(shù)個(gè)、但
2輕度少于一半的所有凹陷(深所見的大多數(shù)凹 __陷只有在切線照明下才顯而易見(淺)。
3中度多于一半的凹陷在直接照明下顯見(深)。
—4 I 重度 I在直接照明下可見所有或兒乎所有傷痕(深)。由林頓(Layton)等人在利茲總醫(yī)院(Leeds General Inf irmary)進(jìn)行的研究中，通過萎縮性和肥厚性/瘢痕瘤性瘢痕的傷痕計(jì)數(shù)來評(píng)估痤瘡瘢痕的嚴(yán)重程度。萎縮性瘢痕-形態(tài)上定義為黃斑部萎縮性或?yàn)V泡性黃斑部萎縮性冰錐狀物-轉(zhuǎn)化為I到6范圍內(nèi)的評(píng)分，分別代表1-5個(gè)、6-10個(gè)、11-25個(gè)、26-50個(gè)、51-100個(gè)以及多于100個(gè)瘢痕。冰錐狀瘢痕描述為具有不規(guī)則邊沿、鋸齒狀邊緣以及尖銳邊界的瘢痕，其陡峭的側(cè)邊通向纖維性基底。黃斑部萎縮性瘢痕為柔軟而可擴(kuò)大的，其中基底常常容易皺褶。濾泡性黃斑部萎縮性瘢痕描述為小的白色濾泡周丘疹或斑丘疹。作者因?yàn)轳：哿鲂院头屎裥择：圯^大程度的損形而各別地對(duì)其進(jìn)行定量。2、4以及6的評(píng)分配置分別代表I到3個(gè)、4到7個(gè)或多于7個(gè)此類型瘢痕。瘢痕瘤性瘢痕描述為堅(jiān)硬的并且延伸超出起始發(fā)炎性痤瘡傷痕的邊界的瘢痕,而肥厚性瘢痕定義為較少凸起并且適應(yīng)初級(jí)痤瘡傷痕的區(qū)域。接著通過加上來自萎縮性和肥厚性種類的評(píng)分來獲得總瘢痕評(píng)分。此類總評(píng)分可各別地針對(duì)面部、胸部以及背部來計(jì)算以提供用于瘢痕評(píng)估的綜合系統(tǒng)，并且還提供用于評(píng)估有效劑量和治療方案的方式。在優(yōu)選實(shí)施例中，通過在每個(gè)治療期將2到12mL的成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物以每平方厘米瘢痕區(qū)O. ImL的劑量分布注射到淺表乳頭狀真皮中來治療痤瘡瘢痕，持續(xù)一到三個(gè)治療期，隔開十四天加減三天。_] 魅到達(dá)深層真皮的燒傷的潛在嚴(yán)重的長(zhǎng)期后果為損傷后瘢痕。因嚴(yán)重?zé)齻纬上拗菩择：劭赡茏璧K受影響區(qū)域的正?；顒?dòng)并且限制活動(dòng)范圍(彎曲、內(nèi)收及/或伸展)。事實(shí)上，“影響功能的燒傷瘢痕和攣縮仍為燒傷最讓人沮喪的后期併發(fā)癥”(烏加烏(Iwuagwu)，整形和再造外科學(xué)(Plast Reconstr Surg. ) 1999 年 4 月;103 (4) : 1198-204)。這些瘢痕可通過引起疼痛以及功能性降低而對(duì)生活質(zhì)量有顯著的負(fù)面影響。視位置而定，限制性燒傷瘢痕可能引起上肢的顯著損傷以及功能喪失。成纖維細(xì)胞劑量調(diào)配物尤其適用于治療上肢的限制性燒傷瘢痕，具體來說降低個(gè)體所經(jīng)歷的損傷以及相關(guān)殘疾的程度。用于治療限制性燒傷瘢痕的優(yōu)選劑量為在每個(gè)治療期將I到IOmL的劑量調(diào)配物以每平方厘米瘢痕區(qū)O. 1-0. 5mL的劑量分布注射到經(jīng)過觸診的限制帶中，優(yōu)選地持續(xù)一到五次治療，隔開二到六周。來自英國(guó)的病例報(bào)告，其中可使用先前可用的成纖維細(xì)胞調(diào)配物，顯示成功用于 燒傷瘢痕和傷口而無不良作用。倫敦的克里斯·英格爾菲爾德博士(Dr. Chris Inglefield)報(bào)導(dǎo)了在頸部、下面部、眼睛和耳朵的部分有多處燒傷的男性的病例。所述個(gè)體先前已接受成纖維細(xì)胞調(diào)配物用于面部皺皮并且因此在他被燒傷之時(shí)存儲(chǔ)細(xì)胞。此使得他能夠在他初始受傷的六周內(nèi)接受面部燒傷治療。他在受傷之后三個(gè)月成功地接受三次額外治療。每次治療都在局部麻醉下進(jìn)行并且包含通過30-40次注射所給予的3-4ml細(xì)胞。個(gè)體先前已用皮膚移植治療。所述個(gè)體在首次治療的三周內(nèi)報(bào)告他的面部和頸部的活動(dòng)有所改善并且他的皮膚的肌理和柔韌性有所改善。印第安納大學(xué)的W.格雷戈里·切爾諾夫博士(Dr. W. GregoryChernoff)也已經(jīng)在十個(gè)難愈合性激光燒傷傷口中使用成纖維細(xì)胞調(diào)配物。盡管這些傷口在用成纖維細(xì)胞治療之前持續(xù)三到九個(gè)月未愈合，但是他注意到在最終注射細(xì)胞之后六周完全愈合(波斯(Boss)等人，2000 臨床整形外科學(xué)(Clinical Plastic Surgery) 27:613-626)。在美國(guó)，兩名燒傷受害者已經(jīng)從以贈(zèng)送方式使用的成纖維細(xì)胞調(diào)配物中獲益，他們的難愈合性燒傷傷口有很大改善。奧克拉荷馬市爆炸案(Oklahoma City Bombing)的受害者悲慘地在爆炸中留下瘢痕。在持續(xù)數(shù)月的外科手術(shù)、激光重修表面以及其他治療以挽救她的生命并且改善她的外貌之后，用成纖維細(xì)胞對(duì)她進(jìn)行治療以幫助已失敗的皮膚移植以及還留在她面部和頸部的其他難愈合性傷口。治療后，難愈合性傷口閉合并愈合。另外，她注意到她的瘢痕外觀有所改善。以贈(zèng)送方式使用為基礎(chǔ)，用成纖維細(xì)胞調(diào)配物治療因激光燒傷而在前額和顴骨區(qū)上具有12個(gè)難愈合性傷口的另一名個(gè)體。她在被治療時(shí)的唯一替代物為牛皮移植物。在治療后，大多數(shù)傷口在注射六周內(nèi)愈合。以下病例報(bào)告表明成纖維細(xì)胞調(diào)配物可能不只是改善亞急性或愈合性燒傷傷口，而且還改善長(zhǎng)久存在的已良好愈合但使人衰弱的限制性燒傷瘢痕。英國(guó)倫敦的克里斯 英格爾菲爾德博士(Dr. Chris Inglefield)報(bào)導(dǎo)了在呈遞之前兩年持續(xù)具有多處燒傷的一名女性的病例，導(dǎo)致較大的面部瘢痕，限制了她左側(cè)面部的表情。個(gè)體的損傷具有嚴(yán)重的負(fù)面心理后果并且她感覺到已經(jīng)“喪失了自我”。所述個(gè)體的面部接受三次治療，每次3mL。在六到八周內(nèi)，所述個(gè)體、她的家人以及治療醫(yī)師注意到顯著的改善，使得她的母親感覺到她的大女兒“回來了”。她面部活動(dòng)的能力和皮膚肌理以及外觀一樣都有改善。同一個(gè)體接著在她的手部接受針對(duì)收縮性瘢痕以及難愈合性傷口的療法。在療法之前，個(gè)體在她的珠寶制作過程中難以操控小的物體。在治療之后的四周內(nèi)，傷口已愈合并且她執(zhí)行珠寶制作任務(wù)的能力改善。英國(guó)利茲的馬克 帕爾默博士(Dr. Mark Palmer)報(bào)導(dǎo)了針對(duì)頸部、肩部以及上臂上持續(xù)10年的長(zhǎng)期傷口進(jìn)行治療的另一名個(gè)體。在治療之前，個(gè)體的頸部和肩部的活動(dòng)范圍嚴(yán)重受限并且她的長(zhǎng)期疼痛需要每天用鴉片劑止痛。所述個(gè)體在她的頸部區(qū)域中接受總共兩次4mL治療。甚至在首次治療之后，個(gè)體便報(bào)告活動(dòng)范圍以及皮膚肌理有所改善。通過第二次治療，個(gè)體的活動(dòng)范圍接近正常并且注意到瘢痕外觀和肌理的驚人變化。同一個(gè)體隨后接受上臂瘢痕的治療。在治療之前，這些瘢痕已嚴(yán)重致殘，使得她由于疼痛而不能舉起她的手臂超過90°。在對(duì)兩個(gè)收縮性瘢痕帶進(jìn)行單次治療(每個(gè)帶
I.5mL)之后截止到三個(gè)月，瘢痕已經(jīng)幾乎消失并且個(gè)體已恢復(fù)180°的活動(dòng)范圍而沒有疼 痛。
權(quán)利要求
1.一種劑量調(diào)配物，其包含I. OX IO7到2. 7 X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升，其中至少98%的所述細(xì)胞是自體人類成纖維細(xì)胞或其前驅(qū)體，其中至少85%為存活的；以及可選的低溫保存培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求I所述的劑量調(diào)配物，其包含由伊斯科夫改良達(dá)爾伯克培養(yǎng)基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM)和 ProfreezeTM 加 7. 5% 二甲亞諷(DMSO)組成的低溫保存培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求I所述的劑量調(diào)配物，其中98%或更多的所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求I所述的劑量調(diào)配物，其包含1、2、3或6mL。
5.一種治療皮膚缺陷的方法，其包括在待治療的部位注射有效量的包含I. OX IO7到2. 7X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的劑量調(diào)配物,其中至少98%的所述細(xì)胞是自體人類成纖維細(xì)胞或其前驅(qū)體，其中至少85%為存活的，所述方法分兩次或三次治療進(jìn)行，所述治療隔開四周或五周加減七到十天。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其用于治療皺皮、鼻唇和唇頰溝、口周紋、外眼角紋、眶周紋以及眉間紋。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其包括每線性厘米長(zhǎng)度注射O.05到O. 5mL的所述劑量調(diào)配物。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其包括在每次治療中注射2到6mL。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其用于治療鼻唇溝皺紋，所述方法包括每個(gè)治療期投予I到2mL的所述劑量調(diào)配物，所述劑量調(diào)配物以每線性厘米長(zhǎng)度O. ImL的劑量分布注射到所述皺紋的淺表乳頭狀真皮中，所述方法持續(xù)三個(gè)治療期，所述治療期隔開五周加減七到十天。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其用于治療多個(gè)面部區(qū)域中的皺皮，所述方法包括每個(gè)治療期將5到6mL以每線性厘米長(zhǎng)度O. 05mL的劑量分布注射到淺表乳頭狀真皮中，所述方法持續(xù)一個(gè)或兩個(gè)治療期，所述治療期隔開五周加減七到十天。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其用于治療痤瘡瘢痕，所述方法包括每個(gè)治療期將2到12mL以每平方厘米瘢痕區(qū)O. ImL的劑量分布注射到淺表乳頭狀真皮中，所述方法持續(xù)一到三個(gè)治療期，所述治療期隔開十四天加減三天。
12.如權(quán)利要求5所述的方法，其用于治療限制性燒傷瘢痕，所述方法包括每個(gè)治療期將I至IOmL以每平方厘米瘢痕區(qū)O. 1-0. 5mL的劑量分布注射到所述燒傷瘢痕的經(jīng)過觸診的限制帶中，所述方法持續(xù)一到五次治療，所述治療隔開兩周到六周。
13.一種提供用于組織修復(fù)或再生的多能細(xì)胞的方法，其包括 提供包含I. OX IO7到2. 7 X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的劑量調(diào)配物，其中至少98%的所述細(xì)胞是自體人類成纖維細(xì)胞或其前驅(qū)體，其中至少85%為存活的；以及提供用于使所述細(xì)胞去分化的方式。
14.如權(quán)利要求13所述的方法,其中所述細(xì)胞是通過細(xì)胞編程、細(xì)胞融合或體細(xì)胞轉(zhuǎn)移而去分化的。
15.一種多能細(xì)胞調(diào)配物，它是通過使包含I. O X IO7到2. 7 X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的劑量調(diào)配物去分化而制備的，在所述劑量調(diào)配物中至少98%的所述細(xì)胞是自體人類成纖維細(xì)胞或其前驅(qū)體，其中至少85%為存活的。
全文摘要
劑量單位由自體細(xì)胞療法產(chǎn)品組成，所述產(chǎn)品由針對(duì)待治療的每個(gè)個(gè)體所生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞構(gòu)成。使用現(xiàn)行良好制造規(guī)范(CGMP)和標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)程序從每個(gè)個(gè)體自身皮膚的活檢體生長(zhǎng)的自體成纖維細(xì)胞的懸浮液在含有具有至少98%成纖維細(xì)胞純度以及至少85%成活力的低溫保存的成纖維細(xì)胞或其前驅(qū)體的小瓶中供應(yīng)，用于以1.0-2.0×107個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度投予1到6mL、優(yōu)選2mL的細(xì)胞。當(dāng)注射到鼻唇溝皺紋(鼻側(cè)上延伸到嘴角的皺褶)中時(shí)，認(rèn)為自體成纖維細(xì)胞會(huì)增加細(xì)胞外基質(zhì)組分(包括膠原蛋白)的合成，從而減輕這些皺紋的嚴(yán)重程度。已證實(shí)投藥劑量和時(shí)機(jī)對(duì)達(dá)成臨床上顯著的成果至關(guān)重要。
文檔編號(hào)A61K35/36GK102905711SQ201180023038
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者約翰·馬斯洛斯基 申請(qǐng)人:法布羅賽爾科技公司