一株具有抑菌活性的植物乳桿菌ab-3及其應(yīng)用
【專利說明】-株具有抑菌活性的植物乳桿菌AB-3及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株分離自四川泡菜中的植物乳桿菌菌株（Lactobaci1lus plantarum)AB-3,以及該植物乳桿菌在發(fā)酵食品、抑制致病菌以及在生物農(nóng)藥和果蔬保鮮 劑中的應(yīng)用。 【技術(shù)背景】
[0002] 植物的所有侵染性病害中，真菌性病害數(shù)量最為繁多，約占所有病害數(shù)量的70% 以上。甜瓜疫霉病是由甜瓜疫霉菌（PhytophthoradrechsleriTucker)感染甜瓜植株引 起的真菌病害，甜瓜疫霉病是甜瓜生產(chǎn)上重要病害，一旦發(fā)病則難于控制。葉、莖和果實(shí)均 可被侵染。目前，化學(xué)防治是控制甜瓜疫霉病的主要措施，但是長期使用化學(xué)農(nóng)藥會使病原 菌產(chǎn)生抗藥性，而且其化學(xué)殘留和污染環(huán)境等弊端不符合現(xiàn)代社會所提倡的綠色無公害產(chǎn) 品。
[0003] 甜瓜枯萎病由尖鐮孢菌甜瓜?；停▽侔胫鷣嗛T真菌）引致的植物病害，發(fā)病 突然，癥狀包括嚴(yán)重的點(diǎn)斑、凋萎或葉、花、果、莖或整株植物的死亡。類似地，目前通常采用 化學(xué)防治手段。
[0004] 因此，現(xiàn)有技術(shù)中缺乏這類作物病害的綠色、無公害防治方法，即生物防治，例如 采用益生菌治理病蟲害，實(shí)現(xiàn)資源豐富、選擇性強(qiáng)、無殘留、無污染、成本低、兼防兼治、增產(chǎn) 增收、保持生態(tài)平衡、能起到長效的意義。其中具有天然安全性的乳酸菌是生物防治的研宄 熱點(diǎn)。
[0005] 乳酸菌的抑菌機(jī)理主要表現(xiàn)在以下五個(gè)方面：一是乳酸菌產(chǎn)生乙酸、丙酸、乳酸和 苯乳酸等有機(jī)酸，使環(huán)境中的pH值顯著降低且保持酸性，抑制不耐酸有害菌的生長繁殖； 二是乳酸菌產(chǎn)生抗生素或細(xì)菌素的蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，對有害菌有抑制或殺滅作用；三是 乳酸菌產(chǎn)生的過氧化氫能激活過氧化氫酶一硫氰酸系統(tǒng)，抑制或殺滅有害菌；四是乳酸菌 產(chǎn)生的二氧化碳可抑制部分霉菌和革蘭氏陰性菌；五是乳酸菌通過拮抗作用與有害菌競爭 營養(yǎng)物質(zhì)，從而達(dá)到抑菌作用。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一株具有抗甜瓜疫霉活性的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AB-3,該植物乳桿菌已于2014年9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCCNo. 9655。
[0007] 本發(fā)明還提供含有上述所述的植物乳桿菌的組合物。
[0008] 本發(fā)明還提供上述植物乳桿菌抑制致病菌的應(yīng)用，所述制致病菌包括：
[0009] (1)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和弗氏志賀氏菌；和
[0010] (2)甜瓜疫霉菌、婁地青霉、甜瓜枯萎菌和蘋果炭疽。
[0011] 本發(fā)明還提供上述植物乳桿菌在發(fā)酵乳、食品添加劑或保健食品中的應(yīng)用，以及 在植物生物農(nóng)藥或果蔬保鮮劑中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供所述菌株（L.plantarumAB-3)抑制甜瓜疫霉菌、婁地青 霉、甜瓜枯萎和蘋果炭疽活性的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供所述菌株（L.plantarumAB-3)抑大腸桿菌、鼠傷寒沙門 氏菌和弗氏志賀氏菌的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的植物乳桿菌（L.plantarum)AB-3是經(jīng)過篩選的、從四川泡菜中分離出的 具有抗菌活性的乳酸菌。
[0015]a.菌株分離方法：
[0016] 先將從四川采集的泡菜樣品做前處理，再梯度稀釋后（1(T4,1(T5,KT6)涂布于含有 放線菌酮（〇?lwt%，0XID公司）和硫酸粘菌素（0?lwt%，0XID公司）的MRS瓊脂平板培養(yǎng) 基或者M(jìn)17瓊脂平板培養(yǎng)基（0XID公司）上，30°C厭氧培養(yǎng)48h~72h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接 于TPY增菌培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)24h~48h，劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基（0XID)，30°C培養(yǎng) 24h~48h，觀察記錄菌落形態(tài)和革蘭氏染色細(xì)胞形態(tài)特征，并同時(shí)進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)。 將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌，暫定為乳酸菌。將菌株接種于MRS液體培養(yǎng) 基中，37°C培養(yǎng)24h~48h后，做進(jìn)一步鑒定和保存。
[0017]b?分子生物學(xué)鑒定：
[0018] 將供試菌株接種于TPY增菌培養(yǎng)液中，30°C恒溫培養(yǎng)24h，經(jīng)TPY傳代培養(yǎng)2~3 代后，取2mL對數(shù)生長末期的菌體培養(yǎng)物置于無菌EP管內(nèi)離心，經(jīng)8000Xg離心3min(4°C) 后收集菌體，棄上清，采用乳酸菌專用CTAB凍融法提取菌株的基因組DNA。
[0019] 采用通用引物，正向引物是27f(對應(yīng)于Escherichiacoil8-27位堿基）： 5 ' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3 反向引物是 1495r(對應(yīng)于Escherichiacoil 1495-1515位堿基）：5' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以菌體DNA為擴(kuò)增模板PCR擴(kuò)增 16S rRNA基因區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行16SrRNA基因序列測定，然后通過基因序列比對和 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研宄進(jìn)行種屬鑒定，確定為植物乳桿菌，其系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖見圖3。
[0020] c?形態(tài)學(xué)特性：
[0021] 觀察所得植物乳桿菌L.plantarumAB-3的形態(tài)，具有以下特征：細(xì)胞呈直桿狀， 有圓形末端，長3. 0-8. 0ym，寬0? 9-1. 2ym，呈單個(gè)、成對，或短鏈狀出現(xiàn)（見圖1)，有些菌 能減少硝酸鹽，偶爾有些菌株表現(xiàn)出擬過氧化氫酶活性。
[0022] d.菌落形態(tài)特性：
[0023] 觀察所得植物乳桿菌L.plantarumAB-3,其在MRS培養(yǎng)基上生長形成乳白色菌 落，不透明，圓形，表面光滑，中央凸起，直徑約為1.2-1. 5mm(見圖2)。
[0024] 植物乳桿菌抑菌性能測定
[0025]e.植物乳桿菌上清液的制備方法：
[0026] 以廣泛采集的347株植物乳桿菌作為篩選本發(fā)明的具有抑制致病菌活性植物乳 桿菌的來源，該347株植物乳桿菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)"乳品生物技術(shù)與工程"教育部重點(diǎn)實(shí) 驗(yàn)室提供，它們分別分離自內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏、甘肅、云南、四川以及蒙古國地區(qū)的傳 統(tǒng)發(fā)酵食品中。把凍存管中的保藏液接種到5mL的MRS培養(yǎng)基中，震蕩混勻，37°C恒溫培養(yǎng) 24h，以2%的接種量連續(xù)活化三代，取第三代的發(fā)酵液（37°C恒溫培養(yǎng)24h)以4000Xg離 心lOmin，取上清，上清液經(jīng)0. 22ym微膜過濾，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0027]f.打孔法測定植物乳桿菌AB-3的抗甜瓜疫霉菌活性：
[0028] 將在PDA培養(yǎng)基（0X0ID公司）上活化好的甜瓜疫霉菌用PBS緩沖液洗下來制成 105cfu/mL的孢子菌懸液，把菌懸液按1% (V/V)接入PDA培養(yǎng)基中，震蕩混勻，然后把含菌 培養(yǎng)基倒到培養(yǎng)皿中，制成含菌平板。
[0029] 在每個(gè)平板上用7_打孔器均勻打出2個(gè)小孔并標(biāo)注植物乳桿菌的菌號，每孔加 入100yL相對應(yīng)植物乳桿菌MRS發(fā)酵上清液，于4°C冰箱中擴(kuò)散12h后37°C培養(yǎng)恒溫48h， 觀測抑菌圈的大小。選取小孔周圍有明顯和較大抑菌圈（抑菌圈>30. 00mm)的植物乳桿菌 作復(fù)篩菌株。
[0030]g.植物乳桿菌AB-3對婁地青霉、甜瓜枯萎和蘋果炭疽的抑制活性測定
[0031] 用打孔法檢測該菌對婁地青霉、甜瓜枯萎和蘋果炭疽的抑制活性，與抑制甜瓜疫 霉菌的試驗(yàn)相同，把霉菌孢子懸液加到PDA培養(yǎng)基中，制成菌板，利用打孔法加入相應(yīng)的植 物乳桿菌的MRS上清液，最后檢測抑菌圈直徑。
[0032]h.不同濃度的發(fā)酵上清液對抑菌活性的影響：
[0033] 植物乳桿菌發(fā)酵液經(jīng)真空冷凍濃縮將其濃度分別濃縮為原濃度的2倍和4倍以及 通過等體積稀釋法將原發(fā)酵液濃度稀釋2倍。以未處理的發(fā)酵上清作對照，通過打孔法，測 量抑菌圈直徑并觀察抑菌效果。
[0034]i.不同發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響
[0035] 將植物乳桿菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，活化2代后，將第3代的菌 株分別接種于多個(gè)MRS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，從0小時(shí)開始，每兩小時(shí)取出三個(gè)平行樣， 在600nm下測定植物乳桿菌的0D值，制作菌株的生長曲線，并按照上述瓊脂擴(kuò)散法測定各 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵上清液的抑菌效果。
[0036] j.不同溫度對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響
[0037] 將篩選得到植物乳桿菌的發(fā)酵上清液分別在50、60、70、80、100 °C水浴中加熱 lOmin，以未處理的植物乳桿菌發(fā)酵上清液為對照，利用上述的打孔法測定菌株上清液經(jīng)不 同濃度處理后的抑菌活性。
[0038] k.不同pH對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響
[0039] 將篩選得到植物乳桿菌的發(fā)酵上清液分別用lmol/L的NaOH和lmol/L的HC1溶 液調(diào)pH至2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0、10. 0。以未處理的植物乳桿菌發(fā)酵上清為 對照，利用上述的打孔法測定不同pH條件下發(fā)酵上清液的抑菌活性。
[0040] 1.蛋白酶處理對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響
[0041] 將植物乳桿菌發(fā)酵上清液分別用lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0,分別加入 lmg/mL胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K，于37°C水浴處理2h，然后在100°C下煮沸滅活 3min終止酶反應(yīng)，再將pH調(diào)節(jié)至原來發(fā)酵上清液的pH，以未處理的植物乳桿菌發(fā)酵上清液 為對照，利用上述的瓊脂擴(kuò)散法測定不同pH條件下發(fā)酵上清液的抑菌活性。
[0042] m.常溫貯藏對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響
[0043] 將篩選得到菌株的發(fā)酵上清液分別在常溫下放置3d、5d、10d、15d、20d，以未處理 的植物乳桿菌發(fā)酵上清液為對照，利用上述的打孔法測定不同貯藏時(shí)間發(fā)酵上清的抑菌 率。
[0044]n.L.plantarumAB-3對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和弗氏志賀氏菌的抑制活性測 定。
[0045] 以本實(shí)驗(yàn)室保藏的大腸桿菌0157:H7(Escherchiacoli0157:H7)、鼠傷沙門氏 菌（SalmonellatyphimuriumATCC13311)和弗氏志賀氏菌（ShigellaflexneriCMCC 51592)等3株腸道致病菌為指示菌，三株菌分別用不同的液體培養(yǎng)基活化，LB液體培養(yǎng)基 用于腸桿菌〇157:H7的活化和傳代；NB液體培養(yǎng)基用于鼠傷沙門氏菌、弗氏志賀氏菌的活 化和傳代，都以2 %的量傳代活化三代用于抑菌試驗(yàn)。
[0046] 將指示菌菌懸液稀釋到106cfu/mL以1:100的量加到冷至45°C的滅菌MRS培養(yǎng)基 中，搖勻后定量加入20mL/平皿，冷卻制成含菌平板