專利名稱：功能化修飾的碳納米管在抗卵巢腫瘤中的熱消融作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及功能化碳納米管的制備及其熱消融作用的應(yīng)用，功能化修飾的碳納米管連接了特異性抗體能夠識(shí)別多耐藥腫瘤細(xì)胞，利用碳納米管在近紅外光區(qū)的吸光致熱效應(yīng)，殺死腫瘤細(xì)胞。是一種靶向非侵入治療腫瘤的新方法。
背景技術(shù)：
卵巢癌作為危害全世界婦女健康的首要腫瘤，研究卵巢癌多藥耐藥性的治療、尤其是晚期卵巢癌的治療一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的課題。多藥耐藥性(MDR)是影響腫瘤化療效果的一大障礙。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，每年約49萬(wàn)例惡性腫瘤患者死亡，其中90%以上存在著腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥(I)。多藥耐藥的提出早在20世紀(jì)70年代，隨著對(duì)MDR發(fā)生機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)MDR的形成是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，如多藥耐藥基因(MDRl)及其所編碼的細(xì)胞膜P糖蛋白(P-gp)表達(dá)增加、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性增強(qiáng)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性降低、多藥耐藥相關(guān)蛋白增加等；其中以多藥耐藥基因(MDRl)及其所編碼的細(xì)胞膜P糖蛋白(P-gp)表達(dá)增加介導(dǎo)的耐藥最為主要最為常見(jiàn)(2)。在過(guò)去二十多年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者探求各種逆轉(zhuǎn)MDRl的方法，如反義寡核苷酸技術(shù)、核酶技術(shù)等，取得了一定的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果及臨床經(jīng)驗(yàn)，但是這些初步研究尚在探索階段，多藥耐藥仍是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因。目前，晚期卵巢腫瘤的五年生存率僅為15% 30%。因此，不斷研究新的克服MDRl的有效途徑，提高患者治愈率和生存率不僅是當(dāng)前腫瘤治療迫切需要解決的重要課題，也具有重大的臨床應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。2.碳納米管的吸光致熱效應(yīng)碳納米管(CNTs)自1991年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)(3)，以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)以及優(yōu)異的熱學(xué)、電學(xué)和力學(xué)性質(zhì)如較大的比表面積、良好的傳熱性、導(dǎo)電性及較高的機(jī)械強(qiáng)度引起廣泛關(guān)注，成為納米材料領(lǐng)域的研究熱 點(diǎn)。近年來(lái)CNTs應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)特別是在藥物載體上的研究逐漸成為新熱點(diǎn)(4-7)。CNTs在近紅外光區(qū)有較強(qiáng)的吸收熱能的特點(diǎn)，并能快速釋放能量，形成局部熱效應(yīng)。Kam等(8)報(bào)道CNTs在近紅外光下可以快速釋放多余的能量，形成細(xì)胞內(nèi)高溫狀態(tài)而使得細(xì)胞破壞。除了近紅外光，碳納米管還可以吸收無(wú)線電波并放出熱量從而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行破壞。Gannon等(9)研究了碳管對(duì)無(wú)線電波的吸收而引起的熱效應(yīng)在不同癌細(xì)胞中的作用，并向動(dòng)物的肝臟腫瘤注射經(jīng)修飾的CNTs，用無(wú)線電波對(duì)碳管進(jìn)行加熱，成功地殺滅了腫瘤細(xì)胞，而對(duì)附近的健康細(xì)胞只造成了很少量的傷害。CNTs體外活細(xì)胞以及動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，碳管對(duì)正常細(xì)胞及組織的沒(méi)有明顯的影響，這使得CNTs將來(lái)在人體上應(yīng)用成為可能(7)。3.通過(guò)修飾提高碳納米管細(xì)胞穿透能力。碳納米管不溶于有機(jī)溶劑和水，從而限制了它在藥物載體領(lǐng)域的應(yīng)用。而功能化修飾碳納米管則可改善其溶解性，并可提高其生物相容性，使碳納米管在藥物載體領(lǐng)域得以應(yīng)用。針對(duì)碳納米管是否可以攜帶生物活性分子進(jìn)入細(xì)胞這一問(wèn)題，Pantarotto等
(10)采用異硫氰酸突光素(isothi ocyanato fluorescein,FITC)標(biāo)記了衍生化修飾單壁碳納米管及肽偶聯(lián)單壁碳納米管，考察了這兩種修飾碳納米管(functi onalized carbonnanotubes, f-CNTs)的細(xì)胞穿透能力，發(fā)現(xiàn)它們均可穿透細(xì)胞膜:CNT1主要進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),而多肽修飾的CNT2可進(jìn)入細(xì)胞核。細(xì)胞攝取納米材料還有尺寸臨界點(diǎn)。Fagan等(11)以DNA包裹單壁碳納米管，制備了未影響單壁碳納米管表面電子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定分散溶液體系，考察細(xì)胞攝取碳納米管的尺寸差異。研究表明，細(xì)胞對(duì)攝取碳納米管的長(zhǎng)度有選擇，(180±17)rim是攝取分界點(diǎn)。他們猜測(cè)不同細(xì)胞攝取碳納米管還可能有不同長(zhǎng)度選擇范圍。Ito等(12)采用碳納米管作為紅細(xì)胞生成素(erythr poietin, EPO) 口服制劑載體,發(fā)現(xiàn)短的碳納米管可運(yùn)載更多EPO到靶細(xì)胞。Liu等(13)利用PEG修飾CNT，制得水溶性的CNT并載帶紫杉醇，與紫杉醇相比，CNT載帶提高了穿透性以及在血液循環(huán)中的貯留時(shí)間，對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞有很好的抑制作用，且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有明顯毒副作用。Kostarelos等(14)研究表明修飾碳納米管對(duì)不同細(xì)胞的穿透范圍較寬，他們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞會(huì)選擇性地?cái)z取不同基團(tuán)修飾的碳納米管，即不同基團(tuán)修飾的碳納米管可穿透不同的細(xì)胞。4.到目前為止，應(yīng)用納米材料在卵巢癌診治中的研究主要集中在載體功能方面，國(guó)內(nèi)外沒(méi)有關(guān)于碳納米管吸光致熱效應(yīng)在卵巢癌中研究的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計(jì)以P-gp為靶點(diǎn)，特異性地增加耐藥卵巢癌細(xì)胞中CNTs的蓄積，再利用近紅外線光輻射，以達(dá)到殺傷卵巢癌細(xì)胞的研究思路。本研究擬合成一系列化學(xué)接枝法，將聚乙二醇(PEG)生物素連接到 CNTs 上形成 DSPE-PEG (2000) -biotin-CNTs (B-CNTs)，一方面可以增加CNTs的水溶性,另一方面連接更多更多的抗P-gp單抗(mAb),最后形成mAb-CNTs復(fù)合體。針對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞株高表達(dá)P-gp而特異性的與這些細(xì)胞相結(jié)合，使碳納米管選擇性地定向蓄積于腫瘤組織，應(yīng)用CNTs吸光致熱效應(yīng)而至細(xì)胞破壞。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
在碳納米管上連接細(xì)胞膜P糖蛋白特異性抗體(抗P-gp單抗)特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，利用碳納米管在近紅外光區(qū)的吸光致熱效應(yīng)，使得腫瘤細(xì)胞的熱消融。
所述功能化修飾碳納米管的制備過(guò)程為:
1.CNTs的制備與純化。
多壁碳納米管(自制，管徑25nm左右)。采用混酸氧化的方法純化cNTs。即將0.3g未純化的碳納米管加入到24mL體積比為3: I的濃硫酸和濃硝酸混合液中，超聲振蕩8小時(shí)，再通過(guò)抽濾并用去離子水反復(fù)沖洗，使濾液pH值至中性，將抽濾得到的碳納米管置于80°C的恒溫箱中烘干，干燥完全后將其研磨成粉末，即得到純化后的碳納米管樣品。
2.CNTs 的修飾，利用 DSPE-PEG (2000)-biotin 修飾，形成 B-CNTS。
①按照配比將CNTs與DSPE-PEG (2000)-biotin溶液加入到干燥的燒瓶中，超聲分散.混合物在室溫下攪拌，產(chǎn)物反復(fù)洗后離心.得到B-CNTS。
3.抗P-gb單抗的修飾，利用neutralite avidin(NA)修飾，形成抗P-gp-NA(mAb-NA)。
商業(yè)化的P-gb單抗和neutralite avidin進(jìn)行純化。IOmg的單抗與Traut反應(yīng)液共培養(yǎng)I小時(shí)，再加入IOmgNA,最后用MBS液終止，通過(guò)電泳膠純化。
4.制備抗 Pgp-NA-B-CNTs (mAb-CNTs)復(fù)合物。
將B-CNTs和mAb-NA進(jìn)行1: 2 (wt/wt)混合，室溫下震蕩35min，然后進(jìn)行離心。沉淀物用PBS溶解，得到mAb-CNTs復(fù)合體。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
I利用碳納米管吸光致熱效應(yīng)對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞的殺傷，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
2將biotin-avidin連接作用對(duì)碳納米管進(jìn)行修飾,將大大提高碳納米管與特異性單抗的結(jié)合能力，提高對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞的靶向性治療作用。
3本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證利用碳納米管吸收近紅外激光致熱效應(yīng)能夠?qū)β殉舶┠[瘤細(xì)胞起到殺傷作用。并且證明未照射激光的碳納米管對(duì)細(xì)胞的毒性作用不明顯。


:圖1-5為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的卵巢癌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖1為空白對(duì)照未加入碳納米管，未照射近紅外射線；
圖2碳納米管濃度為0，近紅外線照射，功率為30J/cm2，照射時(shí)間為600ms ；
圖3碳納米管濃度為50ug/ml，近紅外線照射，功率為30 J/cm2，照射時(shí)間為600ms ；
圖4為陰性對(duì)照，碳納米管濃度為80ug/ml，未照射激光；
圖5碳納米管濃度為80ug/ml，照射激光功率為30J/cm2，照射時(shí)間為600ms。
附表權(quán)利要求
1.功能化修飾的碳納米管在抗卵巢腫瘤中的熱消融作用的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征為，所述碳納米管為氧化碳納米管，直徑為Ι-lOOnm，長(zhǎng)度50_500nm的單壁或者多壁碳納米管粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，功能化修飾的碳納米管為，將聚乙二醇(PEG)生物素連接到CNTs上形成DSPE-PEG(2000)-biotin-CNTs，即水溶性的碳納米管。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚乙二醇(PEG)生物素DSPE-PEG(2000)-biotin全稱為:1, 2-distearoy1-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleneglycol)-2000] (ammonium salt)，分子式為 C142H28tlN5O56PS,分子量為 3016.781，精確質(zhì)量為3014.867。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述靶向功能化修飾的碳納米管為DSPE-PEG(2000)-biotin-CNTs共價(jià)連接了抗P-gp單抗，p_gp為多藥耐藥基因(MDRl)所編碼的細(xì)胞膜P糖蛋白(P-gp)，抗P-gp單抗即為抗細(xì)胞膜P糖蛋白的單抗隆抗體，形成mAb-CNTs復(fù)合物。
6.一種權(quán)利要求1所述功能化修飾的碳納米管的制備方法，其特征在于:(1).CNTs的制備與純化。
多壁碳納米管(自制，管徑25nm左右)。采用混酸氧化的方法純化cNTs。即將0.3g未純化的碳納米管加入到24mL體積比為3: I的濃硫酸和濃硝酸混合液中，超聲振蕩8小時(shí)，再通過(guò)抽濾并用去離子水反復(fù)沖洗，使濾液PH值至中性，將抽濾得到的碳納米管置于80°C的恒溫箱中烘干，干燥完全后將其研磨成粉末，即得到純化后的碳納米管樣品。(2).CNTs 的修飾，利用 DSPE-PEG (2000)-biotin 修飾，形成 B-CNTS。
①按照配比將CNTs與DSPE-PEG(2000)-biotin溶液加入到干燥的燒瓶中，超聲分散.混合物在室溫下攪拌，產(chǎn)物反復(fù)洗后離心.得到B-CNTS。
(3).抗P-gb單抗的修飾，利用neutraliteavidin(NA)修飾，形成抗P-gp-NA(mAb-NA)。
商業(yè)化的P-gb單抗和neutralite avidin進(jìn)行純化。IOmg的單抗與Traut反應(yīng)液共培養(yǎng)I小時(shí)，再加入IOmgNA,最后用MBS液終止，通過(guò)電泳膠純化。
(4).制備抗Pgp-NA-B-CNTs (mAb-CNTs)復(fù)合物。
將B-CNTs和mAb -NA進(jìn)行1: 2 (wt/wt)混合，室溫下震蕩35min，然后進(jìn)行離心。沉淀物用PBS溶解，得到mAb-CNTs復(fù)合體。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤靶向功能化碳納米管及其制備。多藥耐藥基因及其所編碼的細(xì)胞膜P糖蛋白(P-gp)是影響卵巢癌化療效果的一大障礙。目前仍然沒(méi)有殺傷耐藥癌細(xì)胞的有效方法。碳納米管(CNTs)在近紅外光區(qū)有較強(qiáng)的吸收熱能的特點(diǎn)，并能快速釋放能量，形成局部熱效應(yīng)。本發(fā)明設(shè)計(jì)以P-gp為靶點(diǎn)，通過(guò)修飾，增加耐藥癌細(xì)胞中碳納米管的蓄積，利用近紅外線光輻射，形成胞內(nèi)高溫狀態(tài)而使得細(xì)胞破壞，以達(dá)到殺滅癌細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61N5/06GK103191526SQ20121000129
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者汪宏波, 張曉莉 申請(qǐng)人:汪宏波, 張曉莉