專利名稱：囊素樣多肽衍生物作為復方豬瘟疫苗免疫增強劑的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物疫苗的制備領域，特別涉及囊素樣多肽衍生物在制備復方豬瘟疫苗中作為疫苗免疫增強劑的應用。
背景技術：
1986年Audhya報道從雞法氏囊中提取了天然三肽，其氨基酸組成是Lys-His-Gly-NH2,該三肽能誘導禽類和哺乳類動物的前體B細胞的分化，使B細胞選擇性分化激素，可增加人的Daudi B細胞系中cAMP、cGMP的濃度，同時證實人工合成的三肽也有相同的作用。但是，該三肽不能導致前體T細胞的分化。國內外研究業(yè)已證實，該三肽 能提高體液免疫反應，加強細胞免疫水平，而且對禽流感、豬鏈球菌等數十種畜禽弱毒疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗具有顯著的刺激抗體分泌作用。然而，天然三肽與其它天然分離得到的多肽生物活性物質一樣，在藥物開發(fā)應用方面有一定的限制。首先，構象不穩(wěn)定性天然線型肽在體外具有很好的生物活性，但是線型肽的分子柔曲造成構象易變，使其與受體結合的強度及選擇性受到影響；其次，生物利用度低較差的膜通透性、易被酶類降解、易清除、在某些情況下難溶解及易聚集的這些特性，致使多肽在消化和循環(huán)系統(tǒng)中難以以穩(wěn)定的藥理活性形式存在。有研究表明，天然三肽在體內的半衰期僅為20 min。因此，以Lys-His-Gly-NH2為免疫增強劑制備的疫苗，免疫效果不理想，在應用受到了很大的限制。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供囊素樣多肽衍生物作為復方豬瘟疫苗免疫增強劑的應用，所述囊素樣多肽能夠顯著增強復方豬瘟疫苗的免疫效果。本發(fā)明提供一種囊素樣多肽衍生物在制備復方豬瘟疫苗中作為疫苗免疫增強劑的應用，所述囊素樣多肽衍生物是由多拷貝的基本序列Lys-His-Gly通過肽鍵串聯而成，其羧基端以酰胺形式存在，結構為 (Lys-His-Gly-)nNH2，n=2、4、6、8或10。所述復方豬瘟疫苗采用如下方法制備將I. Oml豬瘟病毒培養(yǎng)液、3. 75ml質量濃度為5%的脫脂奶粉和O. 5 10. O mg囊素樣多肽衍生物混勻，然后冷凍干燥；所述豬瘟病毒培養(yǎng)液的病毒含量為每暈升大于50000個家的兔感染量。本發(fā)明將5種囊素樣多肽衍生物，作為免疫增強劑應用于復方豬瘟疫苗，獲得高效的免疫效果。動物實驗結果表明，以囊素樣多肽衍生物，作為免疫增強劑制備的復方豬瘟疫苗，抗體的轉陽率可達80%以上(免疫后28天)，顯著高于普通常規(guī)疫苗(50%_60%)；而且用新設計的囊素樣多肽衍生物作增強劑的疫苗(90%以上)也顯著優(yōu)于天然囊素三肽(80%)。另外，動物實驗結果也表明，每頭豬注射囊素樣多肽衍生物溶液I. 0-2. OmL，亦能顯著增加疫苗的免疫效果，從而提高豬預防病毒感染和抗病的能力。
具體實施方式
下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。實施例中采用國際通用的化學分子式，各分子式代表的化學名稱如下所示
BOC :叔丁氧羰基；
Cys :半胱氨酸；
DCM :二氯甲烷；
DMF N, N-二甲基甲酰胺；
DIEA N, N-二異丙基乙胺；
EDT :乙二硫醇；
FMOC :9_芴甲氧羰基；
Gly :甘氨酸；
His :組氨酸；
HOBt :1_羥基-苯并-三氮唑；
Lys :賴氨酸；
Phenol :苯酌·；
Rink-Amide MBHA Resin :2_氯胺苯醇氯化琥拍膽堿樹脂；
TBTU :1_氧-3-雙二甲胺羰基苯肼三氮唑四氟化硼鹽；
TFA :三氟乙酸；
Thioanisole :苯甲硫醚；
TIS :三異丙基硅。
實施例I 制備囊素樣多肽衍生物(固相化學合成法)
5種囊素樣多肽衍生物，下面分別命名為多肽A、多肽B、多肽C、多肽D、多肽E。其具體組成如下
多肽 A 的序列為Lys-His-Gly-Lys-His_Gly-NH2。多妝B 的序列為Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-NH2ο多肽C的序列為 Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-NH2。多肽D 的序列為Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi S-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-NH20多肽E 的序列為Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-
Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-Ly s-Hi s-Gly-NH2。(a)反應柱的前處理
在合成反應之前，用適量的DCM浸泡用于裝樹脂的反應柱3-4小時，用量以能浸沒反應柱體積的2/3為宜。(b)樹脂的活化
取 200g FMOC Rink-Amide MBHA樹脂(CAS 號40615-36-9)，用 I. 5L 的DMF浸泡 30min，壓濾去除DMF，再用含有20%哌啶的DMF浸泡15min，裝柱。用異丙醇洗滌2次，DMF洗3次。
(C)鏈接 Lys
取 IOOg 的 FMOC-Lys (B0C)_0H、92g 的 TBTU、2. OL 的 DMF 和 152mL 的 HOBt (2M)混勻，再加入52mL的DIEA混勻，加入樹脂柱中室溫、氮氣保護下反應2. Oh。反應完畢后，用異丙醇洗滌樹脂兩次，然后用DMF洗滌樹脂三次。(d)依次鏈接His和Gly
按照從C端向N端延伸多肽的順序，分別取106g的FMOC-His-OH和59g的FMOC-Gly-OH，和上述(C)的條件相同，每次反應后脫除FMOC保護基團。重復脫保護-洗滌-縮合的過程至剩余的氨基酸連接完畢，完成多肽的連接。(e) 2串聯6肽的合成(多肽A)
多肽 A 的序列為Lys-His-Gly-Lys-His_Gly-NH2。操作(d)結束后，再順次重復操作(c)和操作(d)—次,停止反應。配制TFA/Phenol/H20/Thioanisole/EDT/TIS的混合液作為切割液，其體積比為80 5 5 5 3 :2。首先用氮氣將多肽、樹脂復合物吹干，放入5L的容器中，加入IOOmL的切割液4°C密閉攪拌反應2h，再加入3. OL的冰乙醚4°C靜置2h。離心收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌、干燥，重復處理3次，然后用無菌純水溶解，放置_40°C冷凍。最后將凍結的冰狀物置真空冷凍干燥機，凍干至恒重即得(多肽A)。Cf). 4串聯12肽的合成(多肽B)
多妝 B 的序列為Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His_Gly-NH2。操作(d)結束后，再順次重復操作(c)和操作(d)三次,停止反應。配制TFA/Phenol/H20/Thioanisole/EDT/TIS的混合液作為切割液，其體積比為80 5 5 5 3 :2。首先用氮氣將多肽、樹脂復合物吹干，放入5L的容器中，加入IOOmL的切割液4°C密閉攪拌反應2h，在加入3. OL的冰乙醚4°C靜置2h。離心收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌、干燥，重復處理3次，然后用無菌純水溶解，放置_40°C冷凍。最后將凍結的冰狀物置真空冷凍干燥機，凍干至恒重即得(多肽B)。(g) . 6串聯18肽的合成(多肽C)
多肽C的序列為
Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-N
H20操作(d)結束后，再順次重復操作(C)和操作(d)五次，停止反應。配制TFA/Phenol/H20/Thioanisole/EDT/TIS的混合液作為切割液，其體積比為80 5 5 5 3 :2。首先用氮氣將多肽、樹脂復合物吹干，放入5L的容器中，加入IOOmL的切割液4°C密閉攪拌反應2h，在加入3. OL的冰乙醚4°C靜置2h。離心收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌、干燥，重復處理3次，然后用無菌純水溶解，放置_40°C冷凍。最后將凍結的冰狀物置真空冷凍干燥機，凍干至恒重即得(多肽C)。(h). 8串聯24肽的合成(多肽D)
多妝 D 的序列為Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His_Gly- LyS-HiS-Gly-LyS-HiS-Gly-LyS-HiS-Gly-LyS-HiS-Gly-NH20操作(d)結束后，再順次重復操作(c)和操作(d)七次，停止反應。配制TFA/Phenol/H20/Thioanisole/EDT/TIS的混合液作為切割液，其體積比為80 5 5 5 3 :2。首先用氮氣將多肽、樹脂復合物吹干，放入5L的容器中，加入IOOmL的切割液4°C密閉攪拌反應2h，在加入3. OL的冰乙醚4°C靜置2h。離心收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌、干燥，重復處理3次，然后用無菌純水溶解，放置_40°C冷凍。最后將凍結的冰狀物置真空冷凍干燥機，凍干至恒重即得(多肽D)。(i). 10串聯30肽的合成(多肽E)
多妝 E 的序列為Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His_Gly- Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-Lys-His-Gly-N
H20操作(d)結束后，再順次重復操作(c)和操作(d)九次，停止反應。配制TFA/Phenol/H20/Thioanisole/EDT/TIS的混合液作為切割液，其體積比為80 5 5 5 3 :2。首先用氮氣將多肽、樹脂復合物吹干，放入5L的容器中，加入IOOmL的切割液4°C密閉攪拌反應2h，在加入3. OL的冰乙醚4°C靜置2h。離心收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌、干燥，重復處理3次，然后用無菌純水溶解，放置_40°C冷凍。最后將凍結的冰狀物置真空冷凍干燥機，凍干至恒重即得(多肽E)。上述各多肽均由上海吉爾生化有限公司制備。實施例2 含有免疫增強劑的復方豬瘟疫苗的制備 (I)豬瘟病毒培養(yǎng)液的準備
委托南京天邦生物科技有限公司制備，按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)的“豬瘟活疫苗制造及檢驗規(guī)程(I )或(II)”中所述的方法和標準制備合格的豬痕病毒培養(yǎng)液，每暈升豬痕病毒培養(yǎng)液中的病毒含量> 50000個家兔感染量。(2) 5%脫脂奶粉的配制
取市售脫脂奶粉，用生理鹽水或PBS緩沖液(pH7. 2)制備成質量濃度為5%的溶液，物理方法滅菌后備用。( 3 )復方豬瘟疫苗的制備
復方豬瘟疫苗制備的具體方法為將1.0ml的豬瘟病毒培養(yǎng)液O 50000個家兔感染量)，3. 75ml質量濃度為5%的脫脂奶粉和囊素樣多肽衍生物混勻，然后冷凍干燥。將實施例I所得5種囊素樣多肽衍生物多肽A、多肽B、多肽C、多肽D、多肽E分別作為免疫增強劑，每種多肽衍生物均分別按O. 5mg、2. 5mg、10. O mg三種劑量與I. Oml豬瘟病毒培養(yǎng)液和3. 75ml脫脂奶粉溶液(5%質量濃度)混合，共制得15種配比的復方豬瘟疫苗，代號分別為 A1、A2、A3 ;B1、B2、B3 ;C1、C2、C3 ;D1、D2、D3 ;E1、E2、E3 ;冷凍干燥。實施例3含有免疫增強劑的復方豬瘟疫苗的動物免疫試驗
(I)動物制備
健康仔豬180頭，23 28日齡，購自江蘇某豬場，分圈飼養(yǎng)，每圈10頭豬。( 2 )抗體檢測試劑盒
豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒，購自愛德士生物科技股份有限公司(IDEXX)，4°C保存?zhèn)溆谩?3)配制試驗用復方豬瘟疫苗和對照試劑
試驗用復方豬瘟疫苗即為實施例2制得的代號分別為Al、A2、A3 ;B1、B2、B3 ;C1、C2、C3 ;D1、D2、D3 ;E1、E2、E3 的 15 個疫苗。同時再配制代號分別為I、J的免疫對照組復方疫苗和代號為K的非免疫空白對照組試劑。其中，復方疫苗I的制法與實施例2相同，只是作為免疫增強劑的多肽衍生物被天然提取的囊素三肽所替代；天然提取的囊素三肽由國家獸用生物制品工程技術研究中心自制，制備方法參考專利ZL200310105809. 2 “一種法氏囊素的提取方法及其在疾病治療和免疫中的應用”。復方疫苗J是以生理鹽水替代囊素樣多肽衍生物的復方豬瘟疫苗；非免疫對照試劑K則僅是生理鹽水。將實施例2所制得的15種配比的復方豬瘟疫苗和上述對照組疫苗I、J及空白對照試劑K按組別I 18依次列于表1，表I中免疫增強劑的劑量是指50頭份的量。 表I用于免疫試驗的復方豬瘟疫苗及對照
權利要求
1.一種囊素樣多肽衍生物在制備復方豬瘟疫苗中作為疫苗免疫增強劑的應用，所述囊素樣多肽衍生物是由多拷貝的基本序列Lys-His-Gly通過肽鍵串聯而成，其羧基端以酰胺形式存在，結構為(Lys-His-Gly-)n NH2, n=2、4、6、8 或 10。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于復方豬瘟疫苗采用如下方法制備將.1.Oml豬瘟病毒培養(yǎng)液、3. 75ml質量濃度為5%的脫脂奶粉和0. 5 10. 0 mg囊素樣多肽衍生物混勻，然后冷凍干燥；所述豬瘟病毒培養(yǎng)液的病毒含量為每毫升大于50000個家兔的感染量。
全文摘要
本發(fā)明提供囊素樣多肽衍生物作為復方豬瘟疫苗免疫增強劑的應用，涉及動物疫苗的制備領域。所述囊素樣多肽衍生物是由多拷貝的基本序列Lys-His-Gly通過肽鍵串聯而成，其羧基端以酰胺形式存在，結構為(Lys-His-Gly-)nNH2，n=2、4、6、8或10。所述復方豬瘟疫苗采用如下方法制備將1.0ml豬瘟病毒培養(yǎng)液、3.75ml質量濃度為5%的脫脂奶粉和0.5～10.0 mg囊素樣多肽衍生物混勻，然后冷凍干燥；所述豬瘟病毒培養(yǎng)液的病毒含量為每毫升大于50000個家的兔感染量。采用本發(fā)明的囊素樣多肽衍生物，作為免疫增強劑應用于復方豬瘟疫苗，能夠獲得高效的免疫效果。
文檔編號A61K39/187GK102698264SQ201210025738
公開日2012年10月3日 申請日期2012年2月7日 優(yōu)先權日2012年2月7日
發(fā)明者侯繼波, 盧宇, 呂芳, 張金秋, 鄧碧華 申請人:江蘇省農業(yè)科學院