專利名稱：具有腫瘤細胞殺傷活性的端粒蛋白多肽片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有腫瘤細胞殺傷活性的端粒蛋白多肽片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
端粒是細胞染色體末端標(biāo)志，由端粒DNA和端粒蛋白組成。端粒蛋白包括Potl、TPPl、Tin2、TRFl、TRF2和RAPl。這六種蛋白在端粒DNA上相互作用，形成多種形式端粒蛋白復(fù)合體，對保護端粒DNA不被細胞錯誤識別為染色體損傷斷端和引發(fā)染色體末端DNA損傷反應(yīng)有重要作用。端粒蛋白復(fù)合體的功能性結(jié)構(gòu)受端粒DNA序列長度調(diào)控。人體正常細胞由于缺乏端粒酶活性，端粒DNA長度隨細胞分裂次數(shù)增多而發(fā)生逐漸縮短，最終導(dǎo)致端粒蛋白復(fù)合體功能性結(jié)構(gòu)喪失，引發(fā)細胞染色體末端DNA損傷反應(yīng),誘導(dǎo)細胞衰老或凋亡。因此人體正常細胞只具備有限次數(shù)的分裂倍增能力，不能無限繁殖。相反，阻斷端粒DNA隨細胞分裂而縮短的趨勢，獲得永久性端粒蛋白染色體末端保護能力，是所有人類細胞癌變 的一個重要步驟，是腫瘤細胞形成永生化惡性生長能力的共同基礎(chǔ)。大量研究已經(jīng)證明誘導(dǎo)端粒蛋白復(fù)合體功能障礙具有廣譜、完全的腫瘤抑制效應(yīng)，是治療人類腫瘤性疾病的一條潛在途徑。但關(guān)鍵問題是尋找出能夠特異性攻擊腫瘤細胞的端粒蛋白復(fù)合體而不影響正常細胞端粒蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能的治療靶標(biāo)和藥物。在已經(jīng)鑒定出的六種端粒組成型結(jié)構(gòu)蛋白中，Potl是主要用于抑制ATR在端粒上介導(dǎo)的單鏈DNA損傷反應(yīng)活化的專業(yè)化端粒保護性蛋白(Drik H, et al. Telomereprotection by mammalian Potl requires interaction with TppLNat struct. Mol.Biol. 14(2007) :754-761.以及 Zimmerman S，UM Martens. Telomeres and telomerase astargets for cancer therapy. Cell Mol Life Sci 2007 (64) :906-21. ) 全長 Potl 蛋白由634個氨基酸組成，分為兩個主要功能結(jié)構(gòu)域，一是N-端OB fold結(jié)構(gòu)域與端粒單鏈DNA的特異高親和力結(jié)合；另一個是C-端與另一種端粒結(jié)構(gòu)蛋白TPPl結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Potl與TPPl相互作用是介導(dǎo)Potl端粒定位的主要機制。但有關(guān)Potl在端粒上如何抑制ATR的作用機制并不清楚。以往研究發(fā)現(xiàn)去除Potl N端的OB fold結(jié)構(gòu)域并不影響剩余的Potl片段(Potlaal21-634)在細胞中的端粒定位，同時在腫瘤細胞中表達Potlaal21_634片段能促進端粒酶延長端粒DNA和穩(wěn)定腫瘤細胞端粒的效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有廣譜特異腫瘤細胞殺傷活性的端粒蛋白多肽片段及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的多肽，名稱為PotlClOO，由Potl蛋白C-末端的114個氨基酸殘基組成,具體來說，PotlClOO是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與腫瘤細胞殺傷活性相關(guān)的由序列I衍生的多肽。
由所述多肽PotlClOO衍生的蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明中，所述蛋白質(zhì)具體為由序列表中序列4所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)，是在所述多肽PoticiOO的N端連接上綠色熒光蛋白(EGFP)后所形成的融合蛋白(命名為EGFP-Pot 1C100 )。其中，序列I由114個氨基酸組成；序列4由355個氨基酸組成，其中第242-355位對應(yīng)序列I。編碼所述多肽PotlClOO或所述融合蛋白EGFP-PotlClOO的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本發(fā)明的一個實施例中，所述核酸分子具體為編碼所述多肽的基因(命名為·PotlClOO)或編碼所述融合蛋白EGFP-PotlClOO的基因(命名為EGFP-PotlClOO);所述基因是如下I) -4)中任一所述的DNA分子I)編碼序列為序列表中序列2的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)編碼序列為序列表中序列5所示的DNA分子；4)序列表中序列5所示的DNA分子。其中，序列2由345個核苷酸組成，編碼序列表中序列I所示的多肽；序列5由1068個核苷酸組成，編碼序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)。序列5的第1-717位為EGFP蛋白的編碼基因(不含終止密碼子)，對應(yīng)序列表中序列3，第718-723位為Bgl II的識別序列，第724-1068位為PotlClOO基因(不含起始密碼子)，對應(yīng)序列表中序列2。含有上述核酸分子的重組載體、表達盒、重組細胞、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。在本發(fā)明中，所述重組表達載體中啟動所述EGFP-PotlC100基因或所述PotlClOO基因轉(zhuǎn)錄的啟動子具體為MCMV啟動子。更為具體的，所述重組表達載體可為在pDC316載體或pDC315載體的多克隆位點處插入所述EGFP-PotlC100基因或所述PotlClOO基因得到的重組質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組表達載體具體為在pDC316載體的多克隆位點處插入所述PotlClOO基因以及EGFP蛋白的編碼基因得到的同時表達所述PotlClOO多肽和所述EGFP蛋白的重組質(zhì)粒(命名為pDC316-EGFP-Pot 1C100)。其中，插入所述PotlClOO基因(不含起始密碼子)的多克隆位點具體為BlII和Sal I ;插入所述EGFP蛋白的編碼基因的多克隆位點具體為EcoR I和Bgl II。即所述重組表達載體具體為在PDC316載體的多克隆位點EcoR I和Sal I之間插入所述EGFP-PotlClOO基因(序列5)。所述表達盒由能夠啟動所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因表達的啟動子，所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組病毒具體為攜帶并表達所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因的重組腺病毒。在本發(fā)明中，所述重組腺病毒是基于Ad-MAX包裝系統(tǒng)構(gòu)建得到的，具體可按照包括如下步驟將所述重組表達載體(在PDC316載體或pDC315載體(與pDC316載體相比，僅多克隆位點存在差異)的多克隆位點處插入所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因得到的重組質(zhì)粒)與骨架質(zhì)粒PBH Glox ΔΕ1, 3Cre共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞得到重組細胞甲；培養(yǎng)所述重組細胞甲，獲得所述重組腺病毒。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組表達載體具體為所述重組表達載體pDC316-EGFP-PotlC100 ;所述腺病毒包裝細胞具體為HEK293 細胞。當(dāng)然，基于其他腺病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建得到的表達所述PotlClOO多肽的重組腺病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述多肽，或核酸分子，或重組載體，或表達盒，或重組細胞，或重組菌，或重組病毒在制備下述任一產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍(I)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的產(chǎn)品；(2)抑制腫瘤細胞生長的產(chǎn)品；(3)抗腫瘤產(chǎn)品；活性成分為上述多肽，或核酸分子，或重組載體，或表達盒，或重組細胞，或重組菌，或重組病毒的如下產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護范圍(I)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的產(chǎn)品；(2)抑制腫瘤細胞生長的產(chǎn)品；(3)抗腫瘤產(chǎn)品；上述所有的所述腫瘤細胞均為端粒酶陽性的腫瘤細胞，如肝癌細胞、宮頸癌細胞、肺癌細胞、腎癌細胞等；所述腫瘤均為端粒酶陽性的腫瘤，如肝癌、宮頸癌、肺癌、腎癌等。實驗證明，表達本發(fā)明所提供多肽的重組腺病毒能夠抑制端粒酶陽性的腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤體內(nèi)外生長。這表明本發(fā)明的多肽具有廣譜、特異性端粒酶陽性腫瘤細胞殺傷活性，同時該多肽對正常人體細胞的生長和生存沒有影響。這將對新型廣譜特異性抗腫瘤藥物的研發(fā)具有重要意義。


圖I為Adv-Pot 1C100/EGFP感染(MOI :200)端粒酶陽性的腫瘤細胞后對細胞生長的抑制作用的分析。其中，Adv-PotlClOO即表示Adv-Pot 1C100/EGFP。圖2為Adv-Pot 1C100/EGFP感染(MOI :500)端粒酶陰性的腫瘤細胞和正常的的二倍體細胞株后對細胞生長的抑制作用的分析。其中，Adv-PotlClOO即表示Adv-PotlClOO/EGFP0圖3為Adv-PotlClOO感染腫瘤細胞后引起細胞凋亡情況的分析。其中，GFP即表示 Adv-EGFP ；PotlC100 即表示 Adv-Pot 1C100/EGFP。圖4為重組腺病毒載體Adv-Pot 1C100/EGFP的抗腫瘤小鼠實驗結(jié)果。其中，A為SMMC7721組；B為BEL-7402組；C為HeLa組；D為!fepG2組。A-D中，每只小鼠為一個重復(fù)；每只小鼠左側(cè)腫瘤為Adv-Pot 1C100/EGFP注射組；右側(cè)腫瘤為Adv-EGFP注射組。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。端粒酶陽性的腫瘤細胞株=HeLa (人子宮頸癌細胞株)、HepG2 (人肝癌細胞株)、、SMMC7721 (人肝癌細胞株，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心購，資源號3111c0001ccc000087)、BEL-7402 (人肝癌細胞株，中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫購，資源號3142c0001000000035)、A549 (人肺癌細胞株，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心購，資源號3111c0001ccc000002)和A498 (人腎癌細胞株，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心購，資源號3111c0001ccc000171)端粒酶陰性的腫瘤細胞株U2os (骨肉瘤細胞株，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心購，資源號3111c0001ccc000028)正常的人二倍體細胞株WI-38 (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心購，資源號3111c0001ccc000210)、2BS (中國藥品生物制品檢定所購，資源號 3111c0002000000003)和 BJ (購自 ATCC, CRL-2522)SPF級無胸腺裸鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，所有裸鼠均為雌性，4-6周齡。實施例I、重組腺病毒載體Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP的制備重組腺病毒載體Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP是基于Ad-MAX包裝系統(tǒng)構(gòu)建的，由五加合公司制備，具體過程如下一、用于包裝重組腺病毒的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建為了研究的方便，實現(xiàn)可視化標(biāo)記，將EGFP蛋白的編碼基因引入到穿梭質(zhì)粒中，具體如下以EGFP蛋白的編碼基因(序列表中序列3)為模板，用引物EGFP-up和EGFP-down進行PCR擴增，獲得兩端含有限制性內(nèi)切酶識別位點EcoR I和Bgl II的DNA片段，用EcoRI和Bgl II進行雙酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的PDC316載體(本元正陽公司，PD-01-28)大片段相連，對得到的重組質(zhì)粒進行測序，經(jīng)測序鑒定在EcoRI和Bgl II位點之間插入了序列表中序列3 (無終止密碼子)所示EGFP蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒為陽性，將其命名為PDC316-EGFP。EGFP-up :5，_CGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’(下劃線部分為 EcoRI是識別序列，粗體部分為kozak序列，其后的序列為序列3的第1-19位)EGFP-down :5’ -TCGCA AGATCT CTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(下劃線部分為 BlII 是識別序列，其后的序列為序列3的第699-717位的反向互補序列)以端粒保護蛋白(Potl) C端114個氨基酸片段為研究對象，將其對應(yīng)的編碼基因(命名為PotlClOO基因，核苷酸序列如序列表中序列2所示)為模板，用引物PotlClOO-UP和PotlClOO-down進行PCR擴增，獲得兩端含有限制性內(nèi)切酶識別位點Bgl II和Sal I的DNA片段，用Bgl II和Sal I進行雙酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的pDC316_EGFP載體大片段相連，對得到的重組質(zhì)粒進行測序，經(jīng)測序鑒定在Bgl II和Sal I位點之間插入了序列表中序列2 (無起始密碼子)所示PotlClOO基因的重組質(zhì)粒為陽性，將其命名為pDC316-EGFP-Pot1C100。PotlClOO-up :5’_TCGAG AGA TCT AAAACATCGTGGATTCCTTCT-3’(下劃線部分為 BglII是識別序列，其后的序列為序列2的第1-21位)PotlClOO-down :5’_TCGA GTCGAC TTAGATTACATCTTCTGCAAC-3’(下劃線部分為 SalI是識別序列，其后的序列為序列2的第325-345位的反向互補序列)
綜上所述，重組表達載體pDC316-EGFP-Pot 1C100，即為在pDC316載體的酶切位點EcoR I和Sal I之間插入了序列表中序列5所示的EGFP蛋白編碼基因和PotlClOO基因的融合基因(命名為EGFP-Pot 1C100)。序列5所示的融合基因EGFP-PotlClOO編碼序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)(命名為EGFP-PotlClOO)。重組表達載體pDC316-EGFP_Pot 1C100中啟動所述融合基因EGFP-PotlClOO轉(zhuǎn)錄的啟動子為MCMV啟動子。二、制備重組腺病毒將步驟一制備得到的穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-PotlC100(或pDC316-EGFP)與骨架質(zhì)粒pBH Glox Δ El, 3Cre(加拿大Microbix Biosystems公司(多倫多)產(chǎn)品，另記載于“陳振海，楊漢春，郭鑫等.表達偽狂犬病毒gC糖蛋白基因重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫效果.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15 (2) :192-197” 一文中)，借助轉(zhuǎn)染試劑PEI (Sigma，408727)，大批量共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞HEK293細胞。約一周后，除去細胞培養(yǎng)液，收獲細胞。采用反復(fù)凍融法獲得原代病毒液。用原代病毒液繼續(xù)感染新的HEK293細胞(ATCC，CRL-1573)，在發(fā)生細胞病變效應(yīng)(CPE)時收獲病毒，經(jīng)過幾次重復(fù)感染，擴大病毒量和提高病毒滴度，得到粗制的重組腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP。 三、重組腺病毒的鑒定取5 μ I上述步驟二得到的粗制重組腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP (或Adv-EGFP)上清，加上 ο μ I蛋白酶K (NEB, P8102)，55°C消化I小時，然后煮沸樣品5min，離心后取1-2 μ I進行PCR反應(yīng)，在基因水平完成重組腺病毒的鑒定。其中對于PotlClOO基因的檢測采用引物PotlClOO-up和PotlClOO-down，對于EGFP蛋白的編碼基因的檢測采用引物EGFP-up 和 EGFP-down。結(jié)果顯示，步驟二得到的粗制重組腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP (或Adv-EGFP)在基因水平上擴增出了大小約為340bp (PotlClOO基因)和720bp (EGFP蛋白的編碼基因)的兩個目的條帶，粗制重組腺病毒Adv-EGFP在基因水平上擴增出了大小約為720bp (EGFP蛋白的編碼基因)的一個目的條帶。以上結(jié)果證實步驟二得到的粗制重組腺病毒Adv-PotlClOO/EGFP和Adv-EGFP在基因水平上鑒定正確。另外,采用Western blot對步驟二得到的粗制重組腺病毒Adv-PotlClOO/EGFP(或Adv-EGFP)進行蛋白水平的鑒定，針對EGFP蛋白進行鑒定。結(jié)果表明步驟二得到的粗制重組腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP在蛋白水平上成功表達EGFP蛋白，粗制重組腺病毒Adv-EGFP在蛋白水平上成功表達EGFP蛋白。四、重組腺病毒的純化采用氯化銫密度梯度離心法對步驟二得到的粗制重組腺病毒Adv-PotlC100/EGFP和Adv-EGFP分別進行純化。具體如下(I)將 15% (15g/100ml)CsCl 和 40% (40g/100ml)CsCl (CsCl 溶于 IOmM HEPES,pH7. 4)加入Beckman離心管中制備CsCl梯度溶液；(2)將步驟二得到的粗制重組腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP (或Adv-EGFP)的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；(3)超速離心，30000rpm，4度離心16個小時；(4)離心后，有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有需要收集的活病毒顆粒。用16號針頭將這一條帶收集;(5)在TBS中透析一小時，隨后在含有10% (v/v)甘油的TBS中透析兩次，每次一小時；(6)將透析后所得的純化后重組腺病毒分裝于EP管中，備用。實施例2、Adv-PotlClOO感染腫瘤細胞后對細胞生長和細胞凋亡的影響本實施例用實施例I制備所得的重組腺病毒載體Adv-Pot 1C100/EGFP分別感染端粒酶陽性的腫瘤細胞株(HeLa、H印G2、SMMC7721、BEL-7402、A549和A498)、端粒酶陰性的腫瘤細胞株(U2os)和正常的人二倍體細胞株(WI-38、2BS和BJ)，檢測Adv-PotlClOO/EGFP感染腫瘤細胞后對細胞生長和細胞凋亡的影響。實驗共分三組，其一為未感染腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP的空白對照組；其二為感染Adv-EGFP的病毒對照組；其三為感染Adv-Pot 1C100/EGFP的實驗組。實驗重復(fù)三次。具體操作如下 I、生長曲線測定(I)用胰酶消化細胞，用含體積百分含量10%血清的DMEM培養(yǎng)基中和后，以每孔1000個細胞接種在96孔板中；(2)每種細胞都設(shè)置3大組，即空白對照組，病毒對照組，實驗組。其中，病毒對照組和實驗組又各分為2小組感染復(fù)數(shù)(MOI)為200，以及感染復(fù)數(shù)(MOI)為500。每組均有2個復(fù)孔。(3)待病毒表達后，每12小時按照CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，貨號CK04)說明書每孔加入10μ I反應(yīng)液(CCK-8試劑盒自帶)，37°C孵育2_4小時，測0D450值，按照比值做細胞生長曲線。結(jié)果顯示用感染復(fù)數(shù)(MOI)為200的Adv-Pot 1C100/EGFP或Adv-EGFP感染端粒酶陽性的腫瘤細胞株后，細胞的生長情況如圖I所示。這一結(jié)果顯示，與空白對照組和病毒對照組(Adv-EGFP)相比，Adv-Pot 1C100/EGFP感染端粒酶陽性的腫瘤細胞株后細胞的生長會受到抑制。用感染復(fù)數(shù)(MOI)為500的Adv-Pot 1C100/EGFP或Adv-EGFP感染端粒酶陰性的腫瘤細胞株和正常的人二倍體細胞株后，細胞的生長情況如圖2所示。這一結(jié)果顯示，與空白對照組和病毒對照組(Adv-EGFP)相比，Adv-Pot 1C100/EGFP感染端粒酶陰性的腫瘤細胞株和正常的人二倍體細胞株并不影響細胞的生長。2、凋亡檢測采用DNA染料Hoechst染色，計數(shù)細胞凋亡情況，具體如下(I)細胞胰酶消化，用體積百分含量10%血清的DMEM培養(yǎng)基中和后，接種到12孔板中，將分別梯度稀釋好的重組腺病毒(Adv-Po11C100/EGFP或Adv-EGFP )加入培養(yǎng)皿中(對應(yīng)3個Μ0Ι，即100、200和300)，設(shè)多個時間點，用4%(4g/100ml)的多聚甲醛固定10-15分鐘；(2)固定后用IXPBS輕輕洗2遍后(動作要輕柔，避免洗去死細胞)，加入IOyg/ml 的 Hoechst 33258 (Invitrogen, H21491)避光染核 30 分鐘；(3)熒光顯微鏡下觀察細胞核表現(xiàn)為核碎片、核濃縮的可認為是凋亡細胞，通過計數(shù)每組及復(fù)孔中的三個隨機區(qū)域做柱狀圖來確定細胞凋亡指數(shù)，實驗結(jié)果由三次獨立的重復(fù)實驗獲得。
結(jié)果顯示，用不同感染復(fù)數(shù)的Adv-PotlClOO/EGFP或Adv-EGFP感染細胞后，細胞凋亡的發(fā)生情況如圖3所示。這一結(jié)果顯示，與Adv-EGFP相比，Adv-Pot 1C100/EGFP感染端粒酶陽性腫瘤細胞明顯可使細胞發(fā)生凋亡，但Adv-PotlClOO/EGFP感染端粒酶陰性的腫瘤細胞及正常細胞不能形成細胞凋亡。實施例3、重組腺病毒載體Adv-Pot 1C100/EGFP的抗腫瘤效果檢測本實施例首先采用端粒酶陽性的腫瘤細胞株(HeLa、HepG2、SMMC7721和BEL-7402)構(gòu)建小鼠腫瘤模型；進而通過瘤體局部注射實施例2制備所得的重組腺病毒載體Adv-PotlClOO/EGFP或Adv-EGFP，觀察瘤體大小變化，從而檢測Adv-Pot 1C100/EGFP的抗腫瘤效果。具體操作如下一、裸鼠成瘤實驗將5X IO6-I X IO7 個腫瘤細胞(HeLa、H印G2、SMMC7721 或 BEL-7402)，皮下注射到4-6周齡雌性SPF級無胸腺裸鼠兩側(cè)腋下，進行裸鼠成瘤模型。每種細胞注射6只小鼠結(jié)果顯示，SMMC7721組小鼠自注射腫瘤細胞后10天成瘤；BEL_7402組小鼠自注射腫瘤細胞后7天成瘤；HeLa組小鼠自注射腫瘤細胞后7天成瘤；HepG2組小鼠自注射腫瘤細胞后10天成瘤。所述成瘤指的是瘤體直徑約為O. 5-1厘米。二、重組腺病毒免疫及抗腫瘤效果測定在小鼠成瘤(瘤體直徑約為O. 5-1厘米)后，對步驟一獲得的四種小鼠腫瘤模型分別進行瘤體局部注射Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP，采用瘤體內(nèi)及周圍多點注射的方式，其中Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP的用量均為IX IO8VP/次，每周注射一次，共注射三次。Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP各注射于每只小鼠一側(cè)的瘤體處。自第3次注射日后第7天，測量腫瘤的體積，根據(jù)如下公式計算得到腫瘤體積腫瘤體積V (Him3)=L2XDX 1/2。其中，L為瘤體的短徑，D為瘤體的長徑，單位均為mm。結(jié)果如圖4和表I所示。這一結(jié)果表明，通過瘤體局部注射表達PotlClOO的重組腺病毒 Adv-PotlC 100/EGFP 能夠造成包括 BEL-7402、SMMC7721、HeLa、HepG2 等多種不同腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)移植生長出的腫瘤實體的體積顯著性縮小。表I重組腺病毒載體Adv-Pot 1C100/EGFP的抗腫瘤效果
權(quán)利要求
1.多肽，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的多肽； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與腫瘤細胞殺傷活性相關(guān)的由序列I衍生的多肽。
2.權(quán)利要求I所述多肽衍生的蛋白質(zhì)，是由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
3.編碼權(quán)利要求I所述多肽或權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子為編碼權(quán)利要求I所述多肽或權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)的基因；所述基因是如下I) -4)中任一所述的DNA分子 1)編碼序列為序列表中序列2的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)編碼序列為序列表中序列5所示的DNA分子； 4)序列表中序列5所示的DNA分子。
5.含有權(quán)利要求3或4所述核酸分子的重組載體、表達盒、重組細胞、重組菌或重組病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體；在所述重組表達載體中，啟動所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為MCMV啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組表達載體為在PDC316載體或pDC315載體的多克隆位點處插入權(quán)利要求3或4所述核酸分子的重組質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組病毒，其特征在于所述重組病毒為重組腺病毒；所述重組腺病毒按照包括如下步驟的方法制備得到將權(quán)利要求6或7中所述的重組表達載體與骨架質(zhì)粒pBH Glox AEl，3Cre共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞得到重組細胞甲；培養(yǎng)所述重組細胞甲，獲得所述重組腺病毒。
9.權(quán)利要求I所述多肽，或權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求3或4所述核酸分子，或權(quán)利要求5-8中任一所述的重組載體、表達盒、重組細胞、重組菌或重組病毒在制備下述任一產(chǎn)品中的應(yīng)用 (1)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的產(chǎn)品； (2)抑制腫瘤細胞生長的產(chǎn)品； (3)抗腫瘤產(chǎn)品； 所述腫瘤細胞為端粒酶陽性的腫瘤細胞；所述腫瘤為端粒酶陽性的腫瘤。
10.活性成分為權(quán)利要求I所述多肽，或權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求3或4所述核酸分子，或權(quán)利要求5-8中任一所述的重組載體、表達盒、重組細胞、重組菌或重組病毒的如下產(chǎn)品 (1)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的產(chǎn)品； (2)抑制腫瘤細胞生長的產(chǎn)品； (3)抗腫瘤產(chǎn)品； 所述腫瘤細胞為端粒酶陽性的腫瘤細胞；所述腫瘤為端粒酶陽性的腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有腫瘤細胞殺傷活性的端粒蛋白多肽片段及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的多肽是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與腫瘤細胞殺傷活性相關(guān)的由序列1衍生的多肽。實驗證明，表達本發(fā)明所提供多肽的重組腺病毒能夠抑制端粒酶陽性的腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤體內(nèi)外生長。這表明本發(fā)明的多肽具有廣譜、特異性端粒酶陽性腫瘤細胞殺傷活性，同時該多肽對正常人體細胞的生長和生存沒有影響。這將對新型廣譜特異性抗腫瘤藥物的研發(fā)具有重要意義。
文檔編號A61K38/16GK102942618SQ201210459010
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者黃君健, 金蕊, 白云秀, 馬航航, 徐曉玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所