專利名稱：有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物信息學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及流感病毒PBl的模擬結(jié)構(gòu)及針對(duì)該結(jié)構(gòu)的有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽。
背景技術(shù)：
流感病毒，屬于正粘病毒科，是極易發(fā)生突變的負(fù)鏈RNA病毒。它是引起流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)的病原體，在歷史上多次引起流行性感冒大流行如1918年西班牙流感大流行，造成多達(dá)5000萬(wàn)人死亡，1957年流感，引起全球15億人發(fā)病。流感病毒的流行為全球的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展造成了巨大的危害。所以針對(duì)流感病毒的防治是擺在我們面前的一項(xiàng)重要任務(wù)。現(xiàn)在使用的有效的流感藥物有Amantadine、Ostamivir、Zanamivir等,分別針對(duì) 流感病毒的離子通道蛋白(M2)，及表面蛋白(NA)。但是這些小分子藥物也存在一些問(wèn)題，如抗性病毒的出現(xiàn)等(18、24)。所以，我們需要更多的手段來(lái)抑制流感病毒的傳播。流感病毒的基因組由8個(gè)基因片段組成，共編碼11個(gè)蛋白。流感病毒聚合酶是由3個(gè)蛋白(PB2、PB1、PA)組成的異源三聚體復(fù)合物，是負(fù)責(zé)流感病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的重要復(fù)合物。PB2主要負(fù)責(zé)Cap binding，PA主要有核酸內(nèi)切酶活性，負(fù)責(zé)切割5’端“帽子”結(jié)構(gòu)，而PBl是聚合酶的核心蛋白，負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸，單獨(dú)和PB2，PA都有很強(qiáng)的相互作用。另外流感病毒聚合酶在體內(nèi)要行使功能還需要NP蛋白的輔助，NP蛋白負(fù)責(zé)結(jié)合到病毒的基因組RNA上，保持RNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，另外NP也能和PB2相互作用從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的過(guò)程(9、11、25)。對(duì)流感病毒聚合酶的功能研究用的最多的是流感病毒聚合酶的微型復(fù)制系統(tǒng)(minireplicon system),即在細(xì)胞中表達(dá)流感病毒聚合酶行使功能所需要的4個(gè)蛋白PB2、PB1、PA和NP，另外再表達(dá)一個(gè)RNA報(bào)告基因，報(bào)告基因反向互補(bǔ)克隆在流感病毒保守的基因組RNA(vRNA)啟動(dòng)子的5’端和3’端之間，報(bào)告基因最初會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶I復(fù)合物轉(zhuǎn)錄出一個(gè)5’和3’端帶有流感病毒的啟動(dòng)子的RNA(報(bào)告基因是反向互補(bǔ)的)，然后細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的流感病毒聚合酶會(huì)識(shí)別該啟動(dòng)子RNA，從而復(fù)制出報(bào)告基因?yàn)檎蚩寺〉膍RNA，從而在細(xì)胞中翻譯出報(bào)告基因的蛋白產(chǎn)物(22、23)。簡(jiǎn)單的講細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)RNA報(bào)告基因的載體后，只要細(xì)胞中有足夠的流感病毒聚合酶或流感病毒，就能在細(xì)胞中檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)(17、18、22)，這也是用來(lái)研究針對(duì)流感病毒聚合酶的藥物的很好的系統(tǒng)，當(dāng)藥物能有效抑制流感病毒聚合酶活性的時(shí)候，報(bào)告基因的表達(dá)量就會(huì)低，反之會(huì)聞。在進(jìn)化上，流感病毒聚合酶結(jié)構(gòu)和功能都非常的保守，針對(duì)流感病毒聚合酶的藥物相對(duì)于針對(duì)表面蛋白的藥物來(lái)講具有更好的廣譜性和耐藥性。到現(xiàn)在，PA的兩個(gè)亞基結(jié)構(gòu)已被解析，PB2有近1/2的結(jié)構(gòu)被解析，而PBl的兩端有少部分結(jié)構(gòu)外，還沒(méi)有更多的PBl的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(25)。隨著對(duì)流感病毒聚合酶結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識(shí)的不斷深入，現(xiàn)在流感病毒聚合酶成為人們研制流感藥物的新的有效的靶點(diǎn)
發(fā)明內(nèi)容
我們通過(guò)對(duì)PBl結(jié)構(gòu)的模擬，以及通過(guò)將諾沃克病毒(Norwalk virus) RdRp晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID 3BSN)中的RNA對(duì)接(稱為“dock”)到我們模擬的PBl的結(jié)構(gòu)上，發(fā)現(xiàn)PBl的氨基酸序列中的第481位至第515位的片段(下文中稱為PBl 481-515，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示)可能參與PBl與RNA的結(jié)合。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明PBl 481-515對(duì)流感病毒聚合酶具有抑制效果。病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)表明PBl 481-515對(duì)流感病毒的復(fù)制具有很好的抑制效果。并且發(fā)現(xiàn)PBl 481-515與已報(bào)道的對(duì)流感病毒聚合酶有抑制效果的片段PBln 1-25AA(SEQ ID NO. 2) (18)在抑制病毒復(fù)制方面效果相當(dāng)。因此，本發(fā)明的多肽PBl481-515具有非常好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。更具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)I. 一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亞基PBl 481-515位的氨基酸片段(SEQ ID N0:1)。2. 一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO :1的截短體，所述截短體與SEQ ID NO 1相比在N端和/或C端缺少15個(gè)以下的氨基酸，優(yōu)選地缺少10個(gè)以下的氨基酸。3.根據(jù)2的多肽，其中所述截短體與SEQ ID NO : I相比在N端缺少10個(gè)或5個(gè)
氨基酸。4.根據(jù)2的多肽，其中所述截短體與SEQ ID NO : I相比在N端缺少10個(gè)氨基酸并且在C端缺少5個(gè)氨基酸。5. 一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽是在根據(jù)I至4中任一項(xiàng)的多肽的C端添加了序列為YGRKKRRQRRRPP的13個(gè)氨基酸的衍生多肽。6.核苷酸序列，其編碼根據(jù)前述中任一項(xiàng)的多肽。7.包括根據(jù)6的核苷酸序列的表達(dá)載體。8.包含根據(jù)7的表達(dá)載體的細(xì)胞。9. 一種使用根據(jù)1-5中任一項(xiàng)的多肽來(lái)抑制流感病毒聚合酶活性的方法，所述方法包括將根據(jù)7的載體提前轉(zhuǎn)染到之后會(huì)被病毒感染的人細(xì)胞中。10.根據(jù)1-5中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)6的核苷酸序列、根據(jù)7的表達(dá)載體或根據(jù)8的細(xì)胞在制備用于抑制流感病毒聚合酶活性的藥物中的應(yīng)用。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖I是流程框圖，其表示模擬構(gòu)建PBl三維結(jié)構(gòu)的流程；圖2是模擬構(gòu)建的PBl整體結(jié)構(gòu)的示意圖；圖3A顯示PBl 481-515片段對(duì)流感病毒聚合酶的抑制效果；圖3B顯示I3Bl 481-515片段在N端和/或C端缺少5個(gè)或10個(gè)氨基酸的截短體對(duì)流感病毒聚合酶的抑制效果；圖4A顯示PBl 481-515片段對(duì)流 感病毒H1N1A/WSN/33復(fù)制的抑制效果；圖4B顯示PBl 481-515片段對(duì)流感病毒H9N2A/Quail/HK/Gl/97復(fù)制的抑制效果。圖5顯示在PBl 481-515的截短體PBl 491-515的C端添加了序列為YGRKKRRQRRRPP的13個(gè)氨基酸的衍生肽(491-515-TAT)在體外對(duì)流感病毒聚合酶轉(zhuǎn)錄活性的抑制效果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、PBl三維結(jié)構(gòu)的模擬由于PBl和已有晶體結(jié)構(gòu)的RNA dependent RNA polymerase (依賴RNA的RNA聚合酶，RdRp)序列的相似性非常低，很難用已有的常規(guī)的基于模板的模建方法來(lái)模建PBl的結(jié)構(gòu)。在本文中本發(fā)明人將已知的PBl的功能信息加入常規(guī)的基于模版的結(jié)構(gòu)模擬方法FR-t5 (7)來(lái)找最優(yōu)的PBl的模板。 首先挑選用于模擬PBl結(jié)構(gòu)的模板，挑選PBl的模板所用的信息包括PB1的111-636區(qū)域?yàn)镻Bl的RdRp核心區(qū)和PBl的5個(gè)保守的基序(motif) (pre_A、A、B、C、D)區(qū)域(2、13)。根據(jù)設(shè)計(jì)的方法找到的打分最高的前20個(gè)蛋白中，大部分模板是正鏈RNA病毒的RdRp。打分最高的三個(gè)模板從高到低依次為諾沃克病毒(Norwalk Virus, NV) (6)、手足口病病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV) (5)和登革熱病毒(Dengue Virus,DV) (8)的RdRps。我們選取排在第一位的NV RdRP (PDB ID 2B43，1208-1695AA)為模板用Swiss-Model(I)來(lái)構(gòu)建PBl的結(jié)構(gòu)。序列比對(duì)時(shí)一個(gè)原則是優(yōu)先將5個(gè)基序的位點(diǎn)比對(duì)準(zhǔn)確，另一個(gè)原則是盡可能不在模板二級(jí)結(jié)構(gòu)中間加入“間隔”，保持二級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)分析NV和DV的RdRp發(fā)現(xiàn)，DV RdRp多了一個(gè)“Flap”結(jié)構(gòu)，從而使其不能結(jié)合雙鏈RNA(4、10)，而PBl和NV RdRp都能結(jié)合雙鏈RNA啟動(dòng)子(promoter) (3、12、15)，說(shuō)明NV RdRp是非常適合用于構(gòu)建PBl結(jié)構(gòu)的模板。如圖I所示，PBl模建的流程包括4個(gè)步驟步1)要模擬區(qū)域的選擇，2)位點(diǎn)限制的折疊識(shí)別，3)模版的選擇和4)模板構(gòu)建優(yōu)化實(shí)施例2、PBl 481-515片段的挑選如在圖2A中所示，本發(fā)明的模擬的PBl結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出RdRp典型的“閉合的右手”的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)的中心是由手指(fingers) (71-266，314-405AA)，手掌(palm) (267-313，406-501AA)和拇指(thumb) (502-600AA)組成的一個(gè)通道，這個(gè)通道是結(jié)合RNA模板的通道(RNA template channel)。整個(gè)結(jié)構(gòu)中包含5個(gè)保守的基序。4個(gè)保守位點(diǎn)D405、G406、D445和K481均位于RNA模板的通道周圍；圖2B是將圖2A沿縱坐標(biāo)旋轉(zhuǎn)180°得到的圖。將已知的諾沃克病毒RdRp晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID 3BSN)中的RNA對(duì)接(稱為“dock”)到本發(fā)明模擬的PBl的結(jié)構(gòu)中，可以看到在本發(fā)明模擬的PBl結(jié)構(gòu)的中心形成的RNA模板的通道正好可以容納一個(gè)雙鏈的RNA，本發(fā)明的PBl 481-515的位置正好位于所對(duì)接的RNA周圍。
PBl的481位-515位氨基酸區(qū)域非常保守，并且包含了基序E (在負(fù)鏈RNA病毒中是非常保守的)(20)，這個(gè)片段在如上所述的模擬的含有RNA的PBl的結(jié)構(gòu)模型中可能參與了 PBl對(duì)RNA的結(jié)合，可見(jiàn)這個(gè)片段在流感病毒復(fù)制過(guò)程中功能非常重要，在體內(nèi)過(guò)表達(dá)該片段后，該片段可能會(huì)和PBl競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RNA，從而抑制PBl的功能及病毒的復(fù)制。我們選這個(gè)片段進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。實(shí)施例3、將多肽片段PBl 481-515構(gòu)建到真核表達(dá)載體上用定點(diǎn)突變的方法將獲得自He，W等的載體pcDNA3. 1_6HA(14)中的NdeI 酶切位點(diǎn)突變掉，引物為 NdeI-F :CATCAAGTGTATCGTATGCCAAGTAC ;NdeI-R :CGTACTTGGCATACGATACACTTGATG。測(cè)序正確后記為 pcDNA3. 1-6HA-M,設(shè)計(jì)引物Flag_F CCCAAGCTTCATATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAG ;FI ag-R : CCGGAATTCCCCGGGACTACTTGTACAGCTCGTCCATGC,將 Flag-GFP 從模板 pEGFP-Nl (購(gòu)自 clontech)中擴(kuò)增出來(lái)，用Hindlll、EcoRI酶切所得到的PCR產(chǎn)物并回收，將該切好的PCR產(chǎn)物連接到用Hindlll、EcoRI (Takara公司生產(chǎn))酶切并回收的載體pcDNA3. 1-6HA-M上，得到pFA-Flag-GFP，其中Flag兩邊帶有Ndel、BamHI的酶切位點(diǎn)(下劃線表示)，測(cè)序正確后，用于之后的載體構(gòu)建。設(shè)計(jì)特異引物(481-F: CCATTATGGCCCCATATGCCCAAGTCTTACATAAATCGGACAGGAAC ；481-R CGACATGTTTTTTGGATCCCCCCTAGGATCCAGACACTCCAAAGCTGGGCA)將 PBl 481-515 從模板pBD-PBl(來(lái)自于1996年在廣東的鵝體內(nèi)分離的A型高致病性禽流感H5N1的基因，毒株名稱為A/Goose/Guangdong/l/96(H5Nl) (8,19))中擴(kuò)增出來(lái)，用 NdeI、BamHI (Takara 公司生產(chǎn))雙酶切所得的PCR產(chǎn)物和載體pFA-Flag-GFP，用T4連接酶(Takara公司生產(chǎn))進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到TOPlO感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京GenStar公司)中，測(cè)序鑒定正確并在本文中記為 PFA-PB1481-515-GFP，即將 pFA-Flag-GFP 載體中的 Flag 片段替換為 PBl 481-515 片段。其他片段的克隆都采用同樣的策略。下文中除非另外說(shuō)明，就用pFA-peptide-GFP表示表達(dá)多種肽(peptide)與GFP相連的融合蛋白(peptide_GFP)的載體。實(shí)施例4、將多肽片段PBl 481-515的截短體構(gòu)建到真核表達(dá)載體上PBl 481-515截短體是在PBl 481-515的N端和C端截去若干個(gè)(例如5個(gè)或10個(gè))氨基酸的不同截短體。將所述截短體構(gòu)建到實(shí)施例3中所述的真核表達(dá)載體上，所用方法與實(shí)施例3中所述基本相同，不同之處在于當(dāng)從模板擴(kuò)增目的片段時(shí)，使用以下表I中的引物以獲得相應(yīng)的截短體克隆。表IPBl 481-515的不同截短體的構(gòu)建
權(quán)利要求
1.一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亞基PB1481-515位的氨基酸片段(SEQ ID NO 1)0
2.一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO :1的截短體，所述截短體與SEQ ID NO 1相比在N端和/或C端缺少15個(gè)以下的氨基酸，優(yōu)選地缺少10個(gè)以下的氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽，其中所述截短體與SEQID NO : I相比在N端缺少10個(gè)或5個(gè)氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽，其中所述截短體與SEQID NO : I相比在N端缺少10個(gè)氨基酸并且在C端缺少5個(gè)氨基酸。
5.一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽是在根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)的多肽的C端添加了序列為YGRKKRRQRRRPP的13個(gè)氨基酸的衍生多肽。
6.核苷酸序列，其編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽。
7.包括根據(jù)權(quán)利要求6的核苷酸序列的表達(dá)載體。
8.包含根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)載體的細(xì)胞。
9.一種使用根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽來(lái)抑制流感病毒聚合酶活性的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求7的載體提前轉(zhuǎn)染到之后會(huì)被病毒感染的人細(xì)胞中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求6的核苷酸序列、根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)胞在制備用于抑制流感病毒聚合酶活性的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
提供了一種用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亞基PB1481-515位的氨基酸。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在所述多肽的N端和/或C端缺少5個(gè)或10個(gè)氨基酸的截短體以及在所述多肽和它的上述截短體的C端添加了序列為YGRKKRRQRRRPP的13個(gè)氨基酸的衍生多肽也具有類似的對(duì)流感病毒聚合酶活性的抑制作用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102617712SQ201210088960
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者吳愛(ài)平, 李春峰, 蔣太交 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所