專利名稱：人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，簡(jiǎn)稱DC)大約占血液中整個(gè)細(xì)胞群體的O. 3%，是一種專職抗原遞呈細(xì)胞，它能夠激發(fā)和調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答。樹(shù)突狀細(xì)胞的以下幾個(gè)特點(diǎn)使得它能夠有效的遞呈抗原激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答(1)能夠通過(guò)吞噬作用、胞飲作用和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而高效的捕捉抗原(如凋亡和壞死的細(xì)胞微生物及可溶性的外源蛋白等)；(2)具有強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性，能夠?qū)⒉蹲降降目乖瓘耐庵芙M織轉(zhuǎn)運(yùn)到初級(jí)和次級(jí)淋巴器官；能夠高水平表達(dá)MHC-I、MHC- II分子，與細(xì)胞內(nèi)加工形成的抗原決定簇形成復(fù)合體并表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞表面為激活抗原特異的淋巴細(xì)胞提供必需的第一信號(hào)；(4)能夠高水平表達(dá)共刺激分子及粘附分子，為激活抗原特異的T淋巴細(xì)胞提供必需的第二信號(hào)；(5)能夠合成重要的細(xì)胞因子(如IL-12和IFN-Y等)，激活多種免疫相關(guān)細(xì)胞。所以樹(shù)突狀細(xì)胞是最有效的抗原遞呈細(xì)胞，其抗原遞呈能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于其他的抗原遞呈細(xì)胞(如B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。腫瘤免疫治療是放療、化療和手術(shù)治療之外的另一種治療腫瘤的方法，雖然目前這種方法還只處于I期和II期臨床研究階段，但它已被公認(rèn)為是最具前景的腫瘤治療方法。腫瘤免疫治療的關(guān)鍵是通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)清除腫瘤細(xì)胞，其中關(guān)鍵的是產(chǎn)生腫瘤特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)。廣泛的研究表明有效的抗腫瘤CTLs應(yīng)答需要專職抗原遞呈細(xì)胞——樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)激活T淋巴細(xì)胞。樹(shù)突狀細(xì)胞在激活抗原特異T淋巴細(xì)胞及維持T淋巴細(xì)胞活性上具有重要作用。目前樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗正在被迅速、廣泛的研究，并且已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和早期的臨床實(shí)驗(yàn)中取得了很有意義的結(jié)果。這些研究結(jié)果表明 樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗不僅能夠誘發(fā)針對(duì)原發(fā)腫瘤的免疫應(yīng)答，而且也能夠誘發(fā)針對(duì)轉(zhuǎn)移腫瘤的免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是解決上述問(wèn)題，提供一種人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗。本發(fā)明的目的之二是提供上述人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法。本發(fā)明的目的之三是提供上述人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的之一的技術(shù)方案是一種人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，它是由葡聚糖誘導(dǎo)獲得。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的之二的技術(shù)方案是一種人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，具有以下步驟①獲得CD14+外周血單核細(xì)胞和腫瘤抗原用含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟①獲得的CD14+外周血單核細(xì)胞IOOh 140h，獲得未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中GM-CSF的濃度為80ng/mL 120ng/mL，IL-4的濃度為
330ng/mL 70ng/mL ;③用β -葡聚糖誘導(dǎo)步驟①獲得的腫瘤抗原負(fù)載到步驟②獲得的未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)，獲得人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗；所述β -葡聚糖的濃度為80 μ g/mL 120 μ g/mL。上述步驟①中所述的CD14+外周血單核細(xì)胞是由血細(xì)胞分離機(jī)從人外周血中先分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，再通過(guò)磁珠分選系統(tǒng)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分選獲得。上述步驟①中所述的腫瘤抗原是通過(guò)生物法和/或物理法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而獲得。即可以單獨(dú)通過(guò)生物法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，也可以單獨(dú)通過(guò)物理法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可以先通過(guò)生物法再通過(guò)物理法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。所述的生物法是采用抗腫瘤化療藥物處理腫瘤細(xì)胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射線照射腫瘤細(xì)胞使之凋亡，或者采用紫外線照射腫瘤細(xì)胞使之凋亡，或者對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融使之凋亡。上述腫瘤為各種惡性實(shí)體瘤，包括肝癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌
坐寸O實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的之三的技術(shù)方案是上述人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明具有的積極效果是本發(fā)明采用β -葡聚糖誘導(dǎo)腫瘤抗原負(fù)載到未成熟的人樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)，從而得到人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，該疫苗能夠提高人樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫效能，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖能力，特別能夠體外刺激T細(xì)胞具有特異性腫瘤殺傷能力，從而用于治療各種惡性實(shí)體瘤。


圖I為β -葡聚糖的結(jié)構(gòu)式。圖2為未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬β -葡聚糖的示意圖。圖3為β -葡聚糖影響共刺激分子表達(dá)的示意圖。圖4為β -葡聚糖影響細(xì)胞因子濃度的示意圖。圖5為T細(xì)胞的特異性腫瘤殺傷能力的檢測(cè)示意圖。
具體實(shí)施例方式(實(shí)施例I)
本實(shí)施例的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗由以下方法獲得
①使用費(fèi)森尤斯血細(xì)胞分離機(jī)以及與其配套的一次性消耗管路，選擇雙針單個(gè)核細(xì)胞程序，輸入被采集人相應(yīng)的參數(shù)(性別、身高、體重、血細(xì)胞比容等)，根據(jù)被采集人具體情況調(diào)整血液流速為50mL/min 80mL/min，抗凝劑和全血比例為I : 10，將單個(gè)核細(xì)胞從人外周血中分離出來(lái)，處理全血量不超過(guò)自身血量的2倍，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞。將獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞先置于15mL的離心管中,取10 μ L細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),然后加入抗人⑶14+免疫磁珠抗體，在108cellS/100l·! L，4°C避光培養(yǎng)15min，接著用2mL的PBS (磷酸鹽緩沖液) 洗滌細(xì)胞5min，去除上清液，再加入O. 5mL的PBS，最后用自動(dòng)磁珠分選系統(tǒng)陽(yáng)性分選獲得 ⑶14+外周血單核細(xì)胞。將腫瘤細(xì)胞(本實(shí)施例的腫瘤來(lái)源于胃癌)接種于無(wú)血清培養(yǎng)基(市售，下同)中， 加入抗腫瘤化療藥物5-氟尿嘧啶繼續(xù)培養(yǎng)36h后，收集凋亡的腫瘤細(xì)胞，然后用PBS洗滌3次，接著將凋亡的腫瘤細(xì)胞收集并懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)基中，在37°C和液氮之間反復(fù)凍融5 次，獲得腫瘤抗原。②將步驟①獲得的CD14+外周血單核細(xì)胞洗滌后用無(wú)血清培養(yǎng)基制備ImL的細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至3 X IOVmL,加入6孔培養(yǎng)板中，貼壁此后，收集懸浮細(xì)胞，-80°C保存?zhèn)溆?。向上?孔培養(yǎng)板中加入含GM-CSF和IL_4的無(wú)血清培養(yǎng)基(GM-CSF濃度為 100ng/mL, IL-4濃度為50ng/mL)，在37°C、5%的CO2的條件下培養(yǎng)CD14+外周血單核細(xì)胞， 在培養(yǎng)24h后換液(保證GM-CSF濃度為100ng/mL，IL-4濃度為50ng/mL，下同)一次，在培養(yǎng)72h后再換液一次，培養(yǎng)IOOh 140h獲得的細(xì)胞即為未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞。③將步驟②培養(yǎng)120h獲得的未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞按照I : 3的細(xì)胞數(shù)量比加入到步驟①獲得的腫瘤抗原中，同時(shí)加入β_葡聚糖(β_葡聚糖的濃度為100yg/mL)，誘導(dǎo) 48h，使腫瘤抗原負(fù)載到未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞中，最后常規(guī)離心法洗滌，收集負(fù)載了腫瘤抗原的人樹(shù)突狀細(xì)胞并懸浮于生理鹽水中，獲得人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗。(實(shí)驗(yàn)例I、未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞能夠吞噬β-葡聚糖)
取5Χ IO5個(gè)實(shí)施例I的步驟①培養(yǎng)120h獲得的未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞與熒光素DTAF 標(biāo)記的β -葡聚糖(濃度為20 μ g/mL)在37°C培養(yǎng)lh，馬上置于冰上，用預(yù)冷的PBS洗滌3 次，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞能夠吞噬β -葡聚糖。(實(shí)驗(yàn)例2、β-葡聚糖對(duì)共刺激分子表達(dá)以及細(xì)胞因子濃度的影響)
本實(shí)驗(yàn)例采用三組人樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行⑶83、⑶86、⑶40、HLA-DR、CCR7表面標(biāo)志檢測(cè)， 判定成熟度。其中第一組為離心收集的實(shí)施例I的步驟①培養(yǎng)120h獲得的未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞。第二組為由葡聚糖(濃度為100 μ g/ml)激發(fā)第一組獲得的未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞48h后的人樹(shù)突狀細(xì)胞。第三組為由TNF- α (濃度為20ng/mL)激發(fā)第一組獲得的未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞48h后的人樹(shù)突狀細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知由β_葡聚糖激發(fā)后的第二組的共刺激分子的表達(dá)明顯上升。另外，收集上述三組人樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，檢測(cè)其細(xì)胞因子濃度，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知由葡聚糖激發(fā)后的第二組的細(xì)胞因子濃度明顯上升。(實(shí)驗(yàn)例3、T細(xì)胞的特異性腫瘤殺傷能力)
將實(shí)施例I獲得的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗與T細(xì)胞按照I : 10的數(shù)量比混合培養(yǎng)24h， 加入IL-2 (濃度為500U/mL)，收集T細(xì)胞，并與靶細(xì)胞混合，分別按照效靶比為30 I、 20 UlO 1、5 I的比例加入到培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置最大釋放孔、效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔、 靶細(xì)胞自然釋放孔，在37°C、5%的CO2的條件下培養(yǎng)4h后，加入LDH反應(yīng)液檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知由實(shí)施例I獲得的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗體外刺激的T細(xì)胞具有特異性腫瘤殺傷能力。
權(quán)利要求
1.一種人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于它是由β-葡聚糖誘導(dǎo)獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于它是由以下步驟的方法獲得①獲得CD14+外周血單核細(xì)胞和腫瘤抗原；②用含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟①獲得的CD14+外周血單核細(xì)胞IOOh 140h,獲得未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中GM-CSF的濃度為 80ng/mL 120ng/mL, IL-4 的濃度為 30ng/mL 70ng/mL ；③用β-葡聚糖誘導(dǎo)步驟①獲得的腫瘤抗原負(fù)載到步驟②獲得的未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)，獲得人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗；所述β -葡聚糖的濃度為80 μ g/mL 120 μ g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于步驟①中所述的CD14+ 外周血單核細(xì)胞是由血細(xì)胞分離機(jī)從人外周血中先分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，再通過(guò)磁珠分選系統(tǒng)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分選獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于步驟①中所述的腫瘤抗原是通過(guò)生物法和/或物理法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于所述的生物法是采用抗腫瘤化療藥物處理腫瘤細(xì)胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射線照射腫瘤細(xì)胞使之凋亡，或者采用紫外線照射腫瘤細(xì)胞使之凋亡，或者對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融使之凋亡。
6.權(quán)利要求I所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于具有以下步驟①獲得CD14+外周血單核細(xì)胞和腫瘤抗原；②用含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟①獲得的CD14+外周血單核細(xì)胞IOOh 140h,獲得未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中GM-CSF的濃度為 80ng/mL 120ng/mL, IL-4 的濃度為 30ng/mL 70ng/mL ；③用β-葡聚糖誘導(dǎo)步驟①獲得的腫瘤抗原負(fù)載到步驟②獲得的未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)，獲得人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗；所述β -葡聚糖的濃度為80 μ g/mL 120 μ g/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟①中所述的CD14+外周血單核細(xì)胞是由血細(xì)胞分離機(jī)從人外周血中先分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，再通過(guò)磁珠分選系統(tǒng)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分選獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟①中所述的腫瘤抗原是通過(guò)生物法和/或物理法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于所述的生物法是采用抗腫瘤化療藥物處理腫瘤細(xì)胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射線照射腫瘤細(xì)胞使之凋亡，或者采用紫外線照射腫瘤細(xì)胞使之凋亡，或者對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融使之凋亡。
10.權(quán)利要求I或2所述的人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗及其制備方法和應(yīng)用。該人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法是獲得CD14+外周血單核細(xì)胞和腫瘤抗原；用含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基培養(yǎng)CD14+外周血單核細(xì)胞100h～140h獲得未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞；用β-葡聚糖誘導(dǎo)腫瘤抗原負(fù)載到未成熟人樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)獲得人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗；β-葡聚糖的濃度為80μg/mL～120μg/mL。本發(fā)明采用β-葡聚糖誘導(dǎo)腫瘤抗原負(fù)載到未成熟的人樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)，從而得到人樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，該疫苗能夠提高人樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫效能，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖能力特別能夠體外刺激T細(xì)胞具有特異性腫瘤殺傷能力，從而用于治療各種惡性實(shí)體瘤。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102600462SQ20121008875
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者寧永玲, 戚春建, 王仕忠, 錢科卿 申請(qǐng)人:戚春建