專利名稱：葫蘆巴水提取物在制備由葫蘆巴水提取物和賦形劑組成的組合物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葫蘆巴提取物，單獨使用所述提取物或?qū)⑵浼尤氲绞称诽砑觿┗蛩幬镏苿┲幸灾委熍c鞭毛蟲寄生蟲有關(guān)的人類或動物疾病。雖然本發(fā)明具體被具體描述為與鞭毛蟲寄生蟲有關(guān)，例如組織滴蟲(Histomonasmeleagridis)和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis),但是本發(fā)明可以應用于任何結(jié)構(gòu)和生理機能與上述屬于后滴門(phylum Metamonada)的寄生蟲相似的鞭毛蟲寄生蟲。
背景技術(shù)：
組織滴蟲(Histomonas meleagridis)寄生蟲是稱為組織滴蟲病的雞形目鳥類的傳染性寄生蟲病的病因。這種病是一種具體在火雞中傳播的盲腸肝炎。這種疾病表現(xiàn)為硫黃色的痢疾，通常導致高死亡率。在頭部肉質(zhì)附屬物中觀察到的青紫色賦予這種疾病黑頭病的名稱。其他臨床癥狀為羽毛脫落形成禿斑、厭食、困倦、步態(tài)異常、頭部低垂或隱藏在翅膀下。從第14天起大量死亡。在不治療的情況下，超過90%的動物可能死亡。未死亡的雞形目鳥類，特別是火雞，相對于臨床上未感染的鳥類顯示出延遲生長。 已經(jīng)提出了許多不同的療法來治療組織滴蟲病具體而言硝基咪唑，特別是二甲硝咪唑(DMZ)對組織滴蟲(Histomonas meleagridis)非常有效。但是，由于其對使用者的毒性，導致這一類分子已經(jīng)被從市場上撤回了。阿苯達唑和其他苯并咪唑被證明在治療組織滴蟲病方面不起作用。其適用于其他目前授權(quán)銷售的抗生素，以及諸如羅沙胂的抗球蟲藥物。此外，還沒有進行對減毒株的免疫試驗。鑒于這種情況，僅有的可能預防方法包括隔離物種或使用有效的原生動物驅(qū)蟲劑。

發(fā)明內(nèi)容
換言之，本發(fā)明的目的在于解決制備用于預防和有效治療，特別是雞形目鳥類中的，原生動物組織滴蟲(Histomonas meleagridis)的有效制劑的問題。更具體而言，本發(fā)明還與一種生理機能和結(jié)構(gòu)與組織滴蟲(Histomonasmeleagridis)相似的有鞭毛的原生動物陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)有關(guān)。陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)是一種在人體中生長特別是集中在泌尿生殖器區(qū)域的有鞭毛的原生動物。其導致一種稱為陰道滴蟲病的普遍的性傳播的疾病。對于女性，臨床癥狀表現(xiàn)為急性外陰陰道炎，伴隨有連續(xù)的泡沫狀的帶有惡臭的青黃色白帶，或伴隨灼熱感的瓣膜瘙癢。并發(fā)癥為宮頸瘤和早產(chǎn)。
對于男性，陰道滴蟲病是無癥狀的，這有利于疾病的傳播?？赡艹霈F(xiàn)尿道炎、附睪炎、前列腺炎和甚至不孕。目前規(guī)定的產(chǎn)品屬于咪唑類，具體是甲硝噠唑、氯丙硝唑、塞克硝唑、替諾尼唑和磺甲硝咪唑。雖然有效，但是必須小心使用這些產(chǎn)品，特別是對于懷孕或哺乳期的女性?？傊?，要解決的問題在于制備一種制劑，其有效預防和治療與有鞭毛的原生動物，特別是組織滴蟲(Histomonas meleagridis)和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)有關(guān)的人類或動物疾病，另外，其既不是細胞毒性的也不導致突變。令人驚訝地，就前述原生動物而言，本申請人發(fā)現(xiàn)并論證了葫蘆巴具有殺死寄生蟲或抑制寄生蟲的性質(zhì)，更普遍地涉及所有具有與組織滴蟲(Histomonas meleagridis)和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)相似的結(jié)構(gòu)和生理機能的屬于后滴門的有鞭毛的原生動物。
文件JP 2008011731描述了一種含有葫蘆巴提取物制劑，其用于治療小豬痢疾。文件FR-A-2833813描述了一種含有葫蘆巴提取物制劑，其用于治療球蟲病。本發(fā)明的目的在于首先使用葫蘆巴提取物來得到用于預防或有效治療與屬于后滴門的有鞭毛的原生動物，特別是組織滴蟲(Histomonas meleagridis)和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis),有關(guān)的人類或動物疾病的制劑。在一個有利的實施方案中，本發(fā)明所涉及的有鞭毛的原生動物屬于后滴門，包括副基體(Parabasalia)綱和意歐法琳基啞(Eopharyngia)綱。具體而言，所述提取物用于治療雞形目鳥類特別是家禽的組織滴蟲病，更具體地用于治療火雞的組織滴蟲病，以及用于治療男性和/或女性的陰道滴蟲病。葫蘆巴的學名是Trigonella foenum-graecum,其屬于豆(Leguminosae)科。原產(chǎn)于北非和地中海盆地，這種一年生植物已經(jīng)在亞洲，特別是在印度和中國，種植了很長時間。葫蘆巴在人類或動物中有許多應用。通常其可以用作補藥來刺激食欲和改善消化，用作開胃劑(orexigenic)或用于減輕呼吸道的刺激。最近，研究和臨床研究表明葫蘆巴可以對調(diào)節(jié)糖尿病患者血糖濃度作出貢獻。根據(jù)本發(fā)明，可以使用整個植物或植物的所有部分。在第一實施方案中，提取物得自種子。有利的是，將種子去皮并且微粉化(至大約為50 μ m的尺寸)或霧化(至尺寸低于50 μ m)。在第二實施方案中，提取物得自預先從發(fā)芽后的種子中分離的胚芽。在實踐中，將浸泡去皮的種子或胚芽在室溫下攪拌，然后將溶液離心收取上層清液。必須理解葫蘆巴提取物可以以其本身形式使用，或者更有利的是在制劑中，特別是在賦形劑的存在下在更復雜的藥物制劑中使用。還可以將其加入到固體食品添加劑或飲料中，特別是水飲料中?？梢栽谥苿┲惺褂玫?、特別是固體添加劑形式的成分有，例如，小麥、玉米、大豆、大豆油、棕櫚油或礦物鹽、氨基酸、維生素和其他碳源，以及更普遍地，任何可以加入到食品中的化合物。當其在制劑或食品添加劑或飲料中使用時，提取物占制劑重量的0. 1%至5%，優(yōu)選占制劑重量的0. 5%至5%。
當在動物體中使用所述提取物來治療本申請中所述的鞭毛蟲寄生蟲并且是以固體食品添加劑的形式時，其含量在I 3g/kg添加劑，有利的是2g/kg添加劑。當在動物體中使用所述提取物來治療本申請中所述的鞭毛蟲寄生蟲并且是在飲用水中時，其含量在I 3g/L飲料，有利的是2g/L飲料。當在人體中使用所述提取物來治療本申請中所述的鞭毛蟲寄生蟲并且是固體食品添加劑的形式時，其含量在I 3g/kg添加劑，有利的是2g/kg添加劑。當在人體中使用所述提取物來治療本申請中所述的鞭毛蟲寄生蟲并且是液體制劑形式時，其含量在100 1000 μ g/ mL制劑，有利的是500 μ g/mL制劑。所述制劑通常口服施用。在這種情況下，配置的藥物通常按所述制劑的O. 5%施用。在陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的情況下,所述提取物經(jīng)陰道施用。如已經(jīng)指出的，葫蘆巴提取物可以用于治療與有鞭毛的原生動物有關(guān)的疾病，除了與前述原生動物有關(guān)外，特別是與以下所列原生動物有關(guān)的疾病-雞四毛滴蟲(Tetratrichomonasgal I inarum) > 鳥毛滴蟲(Trichomonasgallinae),雞形目鳥類腸道寄生蟲。-牛毛滴蟲(Trichomonasfoetus),牛科動物生殖道的寄生蟲。-馬毛滴蟲(Trichomonasequi),馬科動物腸道寄生蟲。-旋核鞭毛蟲(Spironucleusvortens),鮭科魚類寄生蟲。-火雞六鞭毛蟲(Hexamitameleagridis),雞形目鳥類寄生蟲。-腸賈第蟲(Giardiaintestinalis),人類寄生蟲。


通過以下實施例和附圖充分地描述本發(fā)明和由本發(fā)明得到的優(yōu)勢。圖1是本發(fā)明的提取物對組織滴蟲(H. meleagridis)的體外活性的圖示。圖2是比較本發(fā)明的提取物與參比制劑對組織滴蟲(H. meleagridis)的活性的圖
/Jn ο圖3是比較本發(fā)明的提取物與二甲硝咪唑?qū)M織滴蟲(H. meleagridis)生長的功效的圖示。圖4是比較本發(fā)明的提取物與DMZ對與組織滴蟲(H. meleagridis)有關(guān)的菌群的效果的圖示。圖5是比較本發(fā)明的提取物與二甲硝咪唑?qū)D(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中之后的組織滴蟲(H. meleagridis)的生長的功效的圖示。圖6是比較72小時后本發(fā)明的提取物與DMZ對與組織滴蟲(H. meleagridis)有關(guān)的菌群的效果的圖示。圖7是比較本發(fā)明的提取物與參比分子在24小時(圖7a)和48小時(圖7b)的
細胞毒性。圖8是24小時后(圖8a)和48小時(圖8b)后本發(fā)明的提取物對陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的功效。
具體實施例方式材料和方法1.1.提取物的制備通過研磨去皮的種子來得到葫蘆巴提取物，將其微粉化至50μπι的顆粒尺寸，然后將其記為S520。將Ig這種粉末置于5mL無菌水中(濃度200mg/mL)。將溶液在室溫下攪拌過夜，然后在4°C、16100g下離心10分鐘。收取上層清液并再次在4°C下、16100g下離心10分鐘。然后將上層清液在_80°C下以ImL等分存儲。1. 2.培養(yǎng)組織滴蟲(Histomonas meleagridis)從實驗性地寄生了組織滴蟲(H. meleagridis)卵的火雞盲腸中分離出組織滴蟲
(H. meleagridis)菌株。將寄生蟲在39°C于裝有3mL補充型M199培養(yǎng)基的密封玻璃管中培μ養(yǎng)。一周將它們轉(zhuǎn)移兩次。為此，將80 μ L的預培養(yǎng)物加入到3mL的在39°C水浴中預熱的新鮮培養(yǎng)基中。補充型M199培養(yǎng)某-M19942mL-馬血清5mL-稻淀粉溶液4mLpH = 7. 4稻淀粉溶液碳源
一稻淀粉0.6g
—NaCl0.325g
-NaHCO30.05g
-CaCl20.015g
—H2O qsp 50mL1.3.培養(yǎng)與組織滴蟲(H. meleagridis)有關(guān)的菌群取一等分的組織滴蟲(H. meleagridis)培養(yǎng)物。在液體胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基中制備4個連續(xù)稀釋液(10_4至10_7)。將20 μ L的每個稀釋液鋪展在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上。在37°C下培養(yǎng)過夜。1. 4 培養(yǎng)陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)陰道毛滴蟲(T. vaginalis)菌株為ATCC 30243 (參比菌株)。在35°C下將寄生蟲在過濾后的Hollander培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每3天轉(zhuǎn)移一次。為此，將80 μ L的培養(yǎng)物加入到3mL的在35°C水浴中預熱的新鮮培養(yǎng)基中。Hollander 培養(yǎng)基—胰蛋白酶解酪蛋白20.00g
_酵母提取物lO.OOg
一麥芽糖5.00g
—抗壞血酸l.OOg
-KCll.OOg
-KHCO3LOOg
-KH2PO4l.OOg
—K2HPO4l.OOg
—FeSOi · 7H2O0.18g
—H2O qsp IOOOmLpH = 6. 21.5.寄牛蟲計數(shù)用0. 4%的錐蟲藍染色后在馬拉賽(Malassez)計數(shù)室中進行計數(shù)。對計數(shù)室的100個區(qū)域進行計數(shù)。1.6.抗組織滴蟲活件的研究在不同的濃度下對S520進行測試。培養(yǎng)72小時后進行3次寄生蟲計數(shù)。通過僅用溶劑(無菌水)代替提取物來制備陰性對比。為了研究計量依賴效應，每個測試使用不同的濃度進行三次，在24小時、48小時和72小時對寄生蟲進行計數(shù)。通過僅用溶劑代替提取物來制備陰性對比。1.7.抗毛滴蟲活件的研究在4 個濃度下測試 S520 :lmg/mL、500 μ g/mL、100 μ g/mL 和 50 μ g/mL。用樣品培養(yǎng)24小時、48小時和72小時之后對陰道毛滴蟲(T. vaginalis)培養(yǎng)物進行計數(shù)。每個試
驗進行三次。1. 8細胞毒件測試
1. 8. 1MRC5細胞的培養(yǎng)在37°C、5% CO2的室內(nèi)，將MRC5細胞(初級人類胎肺纖維母細胞)在25或75cm2的培養(yǎng)皿中于補充型MEM(最基本培養(yǎng)基，Life Technologies Gibco公司)中培養(yǎng)。用胎牛血清(最終10% )、2mM的谷氨酸鹽(5mL)、抗生素(5mL盤尼西林/鏈霉素，即O.1mU/mL, O. 5mL氨比西林，即10 μ g/mL, O. 25mL慶大霉素，即25 μ g/mL)和殺真菌劑(5mL 二性霉素，即 2. 5 μ g/mL)補充 500ml 的 MEM。當細胞達到細胞覆蓋時，將其胰蛋白酶化并以I 2 X IO5個細胞/孔轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中。然后，在測試之前，在37°C、5% CO2下培養(yǎng)24小時。復制培養(yǎng)板用于在24小時和48小時之后進行蛋白質(zhì)分析。1.8.2.蛋白質(zhì)分析該測試包括在提取物的存在下培養(yǎng)細胞，然后將全部蛋白質(zhì)沉淀以測定其的濃度。將MRC5細胞放入200 μ L的含有不同 濃度待測提取物的補充型MEM中。每個提取物在3個濃度下進行測試2mg/mL、lmg/mL和500 μ g/mL。每個稀釋液進行三次測試,取平均值。使用兩個對比-陰性對比僅在補充型MEM中的細胞-陽性對比在補充型MEM與50%DMSO的混合物存在下的細胞然后將培養(yǎng)板在37°C、5% CO2下培養(yǎng)24小時或48小時。在24小時或48小時后，除去含有提取物的培養(yǎng)基，并用新鮮的培養(yǎng)基代替。用50μ L的50%的三氯乙酸(TCA)沉淀出全部蛋白質(zhì)。在4°C下培養(yǎng)2小時后用自來水清洗板孔。培養(yǎng)板一干燥，就向每個孔中加入O. 4%的硫基堿性蕊香紅(sulphorhodamine) (SRB)以使蛋白質(zhì)染色。培養(yǎng)20分鐘之后，用1%的乙酸沖洗板孔，并且將蛋白質(zhì)溶解于IOmM的pH值10. 5的三羥甲基氨基甲烷(tris-base)緩沖液中。使每個板孔中的物質(zhì)均勻化，并在記錄490nm下的光密度。1. 9回復突奪試駘使用一家加拿大公司(EBPI)銷售的設備Muta-Chromoplate Kit_S9分析提取物的誘變性。這種顯色試驗設備基于最通用且有效的細菌回復突變測試，其被稱為埃姆斯(Ames)試驗。這個測試采用具有組氨酸生物合成操縱子編碼突變的鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)的突變體。當這些細菌暴露于誘變劑中時,在特定條件下,發(fā)生回復突變并且初始組氨酸營養(yǎng)缺陷型細菌變成原養(yǎng)型的。在用S9激活或者不用S9激活的情況下對產(chǎn)品進行測試。S9是模擬肝臟新陳代謝的鼠類肝臟均漿，并可以對產(chǎn)品及其代謝物進行測試。在測試的前一天，用培養(yǎng)基將細菌的凍干產(chǎn)物再水化，然后在37°C下培養(yǎng)16至18小時。根據(jù)設備說明制備反應介質(zhì)和S9混合物。向所有含有待測提取物的試管中加入反應介質(zhì)。僅向在激活條件下測試提取物的試管中加入S9。向除了無菌對比之外的每個試管中加入5μ L的鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium) (TA100)。向96孔培養(yǎng)板的每個孔中移入200 μ L的混合物I個用于每個對比的培養(yǎng)板和2個用于每個提取物的培養(yǎng)板(一個活化的，一個未活化的)。用蓋子將培養(yǎng)板封閉，放入無菌塑料袋中以保持濕度并在37°C下培養(yǎng)5天。使用5個對比-無菌對比(空白)只有反應介質(zhì)-未活化的自然回復突變對比(背景I):細菌和反應介質(zhì)-活化的自然回復突變對比(背景2):細菌、S9混合物和反應介質(zhì)-未活化的帶有誘變劑的對比(標準誘變劑I):細菌、誘變物質(zhì)(疊氮化鈉NaN3)和反應介質(zhì)-活化的帶有誘變劑的對比(標準誘變劑2):細菌、誘變物質(zhì)(2-氨基-蒽)、S9混合物和反應介質(zhì)2/ 結(jié)果2.1. S520的抗組織滴蟲活性如圖1所示，從lmg/mL和從24小時起S520具有殺組織滴蟲作用。在500 μ g/mL的條件下S520減緩寄生蟲的增殖(在72小時抑制51% )。效果是劑量依賴性的。還進行了與以下用于抗組織滴蟲病的物質(zhì)的功效對比PrismaFlag (Santamix公司)、Santagib (Prisma公司)和硝呋索爾(Nifursol)(圖3)。結(jié)果用相對于對比的生長百分比表示。
如圖2所示，從lmg/mL起PrismaFlag 是抑制組織滴蟲的(在72小時2mg/mL的條件下抑制88%,在lmg/mL的條件下抑制50% )。未發(fā)現(xiàn)Santagib :對組織滴蟲(H. meleagridis)的增殖有明顯的效果。在2mg/mL的條件下硝呋索爾有輕微的抑制組織滴蟲的效果(在72小時抑制38% )。因此，在相同的濃度下，S520是抑制組織滴蟲(H. meleagridis)增殖最有效的提取物。最后，對S520進行與二甲硝咪唑(DMZ)平行的測試。結(jié)果如圖3所示。如圖所示，DMZ在25 μ g/mL的條件下是殺寄生蟲物質(zhì)，同時DMZ是抑制寄生蟲的。然后對比培養(yǎng)48小時后不同濃度的S520和DMZ對相關(guān)細菌群的作用。結(jié)果以每HiL細菌的數(shù)量表示(圖4)。S520提取物從lmg/mL起有殺死組織滴蟲的作用。其對相關(guān)細菌群沒有效果。二甲硝咪唑在72小時從25 μ g/mL起有殺死組織滴蟲作用。另一方面，其從400 μ g/mL起有殺菌作用。用S520和DMZ處理72小時后，將寄生蟲放入新鮮的培養(yǎng)基中96小時從而分析殺死組織滴蟲效果(圖5)。S520 :在2mg/mL的條件下沒有培養(yǎng)物再生長,但是在lmg/mL和500 μ g/mL的條件下發(fā)生再生長。這證實S520在2mg/mL的條件下有殺死組織滴蟲的作用。在lmg/mL的條件下有少量寄生蟲存活，因此其是抑制組織滴蟲的而不是殺死組織滴蟲的。DMZ :在lmg/mL和400 μ g/mL的條件下沒有培養(yǎng)物再生長,但在25 μ g/mL (但相對于對比僅僅約30%的生長)和12. 5 μ g/mL的條件下再生長。這證實DMZ從500 μ g/mL起有殺死組織滴蟲作用。其似乎僅在25 μ g/mL的條件下是抑制組織滴蟲的，因為培養(yǎng)物的再生長表明一些寄生蟲在處理過程中存活。應當注意，在400 μ g/mL的條件下DMZ對相關(guān)的菌群起作用(圖4)。對相關(guān)細菌群超過72小時的研究表明不同濃度的S520對這個菌群不起作用(圖6)。2.2.細胞毒件測試對MRC5細胞培養(yǎng)物進行測試。將提取物與以下三種不同物質(zhì)進行對比PrismaFlag 、Santagib .和硝呋索爾。每個提取物我們測試4個濃度2mg/mL、lmg/mL、500 μ g/mL和100 μ g/mL(圖7a和圖7b)。僅PrismaFlag 被認為是細胞毒性的，因為在500 μ g/mL的條件下，從細胞培養(yǎng)24小時起，其導致比對比低60%的細胞生長。S520對培養(yǎng)物中的人體細胞無毒性。這對于Santagib 和硝呋索爾也是一樣。
2.3.回復突變測試對于在產(chǎn)肉的家禽飼養(yǎng)中使用的S520而言，必須確保其不導致突變(并因此致癌)。因此在2mg/mL、lmg/mL和500 μ g/mL的條件下對S520進行測試。結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.葫蘆巴水提取物在制備由葫蘆巴水提取物和賦形劑組成的組合物中的用途，所述組合物用于預防或有效治療與包括陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的有鞭毛的原生動物有關(guān)的人類疾病，其中所述提取物得自去皮的、微粉化的或霧化的種子。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，用于治療男性和/或女性陰道滴蟲病。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于將所述提取物加入到食品添加劑或飲料中，并且占制劑重量的O.1 5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及葫蘆巴提取物在制備組合物中的用途，所述組合物用于預防或有效治療與屬于后滴門的有鞭毛的原生動物有關(guān)的人類或動物疾病。
文檔編號A61K36/48GK102988464SQ20121018403
公開日2013年3月27日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日
發(fā)明者吉恩-克里斯托弗·塞爾熱雷, 克里斯蒂安·維瓦瑞斯 申請人:賽圖彼奧有限公司