專利名稱：一種提高畜禽免疫功能的黃芪多糖納米脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃芪多糖納米脂質(zhì)體的制備方法，及其提高畜禽免疫功能的應(yīng)用，屬于中獸藥制備技術(shù)及免疫應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃苗多糖(Astragalus polysaccharide, APS)是黃苗的主要有效成分,在調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗衰老等方面具有重要的作用。目前大多數(shù)的黃芪多糖制劑在使用過程中藥物在到達作用部位之前，已被降解代謝或排除，血液中有效藥物濃度水平維持時間短，因此需要大劑量或是連續(xù)給藥。研究新型的黃芪多糖制劑或是選擇一種高效的載體以提高治療效果并降低使用劑量，對黃芪多糖的臨床應(yīng)用具有重要意義。脂質(zhì)體具有靶向釋藥、緩釋、無免疫原性、降低藥物毒副作用等優(yōu)勢，近年來作為藥物載體已被廣泛研究。脂質(zhì)體是由類脂質(zhì)制備的具有復(fù)層或單層單位膜結(jié)構(gòu)的小囊，其結(jié)構(gòu)類似生物膜，在體內(nèi)能生物降解。由于脂質(zhì)體成份為磷脂和膽固醇，也是生物細胞膜的主要成分，屬機體內(nèi)源性物質(zhì)，具有良好的生物相容性和可降解性、無毒和無免疫原性。脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)與生物細胞相似，易被細胞吸附、融合·、脂交換、內(nèi)吞而被細胞攝取；且具有一定的彈性和變形性，比相同粒徑的其他類型的納米粒容易進入病灶組織。因此，脂質(zhì)體已成為現(xiàn)代藥物載體研究的內(nèi)容之一。同時脂質(zhì)體還可用作免疫佐劑，早在1974年由Allison等首次報道脂質(zhì)體能增強機體的體液和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，對疫苗的增效作用可達數(shù)十倍甚至更高。脂質(zhì)體具有靶向釋藥、緩釋、無免疫原性、降低藥物毒副作用等優(yōu)勢。脂質(zhì)體是微米級類脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，大小于I οομπι之間。如果在脂質(zhì)體的類脂質(zhì)雙分子層中加入適當(dāng)表面活性劑，則可形成納米脂質(zhì)體。納米脂質(zhì)體除粒徑小于普通脂質(zhì)體外，還具有高度的自身變形性，更易于提高其生物利用度。如將黃芪多糖包封于脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體包封黃芪多糖后在動物體內(nèi)可以持續(xù)釋放，可以有效維持黃芪多糖在機體內(nèi)的有效濃度，提高了其生物利用度。因而脂質(zhì)體可以作為黃芪多糖的一種優(yōu)良載體。本發(fā)明首次將黃芪多糖制備成脂質(zhì)體，并將其和動物疫苗一起應(yīng)用，建立了黃芪多糖納米脂質(zhì)體的制備方法，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖納米脂質(zhì)體能顯著提高黃芪多糖的免疫增強作用，提高其生物利用度。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對黃芪多糖在體內(nèi)代謝快，難以維持長時間的高血藥濃度問題，提供一種黃芪多糖納米脂質(zhì)體的制備方法，達到顯著提高黃芪多糖免疫增強作用目的，并應(yīng)用于畜禽臨床。技術(shù)方案將大豆卵磷脂150mg、膽固醇25mg、吐溫-80 37.5mg、乙醇IOml超聲混合。在溫度43°C，恒流泵用60r/min將混合后的液體滴入IOml 0.25mol/L硫酸銨溶液中，滴入過程中搖床振蕩。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)，除去混合液中的乙醇。在IL的PBS溶液(Vsei⑩體:Vpbs = 1: 100)中透析24h，使脂質(zhì)體內(nèi)外形成硫酸銨梯度，制得空白脂質(zhì)體。取黃芪多糖15mg溶入IOml PBS溶液中，得黃芪多糖溶液，取IOmL黃芪多糖溶液與IOmL空白脂質(zhì)體混合，50°C搖床振蕩lOmin，將所得脂質(zhì)體過0.45 μ m微孔濾膜2次，0.22 μ m微孔濾膜2次，即得黃芪多糖納米脂質(zhì)體。將黃芪多糖納米脂質(zhì)體和新城疫疫苗一起應(yīng)用于雞，能顯著提高血清中新城疫抗體效價、淋巴細胞增殖、細胞因子IL-2和IFN-Y的含量，對提高畜禽免疫功能，防制疾病具有重要應(yīng)用價值。有益效果動物疫病主要靠疫苗來預(yù)防，但是很多疫苗存在免疫原性較弱等缺點，需要免疫增強劑輔助才能產(chǎn)生強大的免疫應(yīng)答?，F(xiàn)有的常用免疫增強劑如油佐劑、鋁膠佐劑等常存在刺激性強、有殘留等缺點。由于中藥具有綠色安全的特點，從中藥中開發(fā)免疫增強劑已成為熱點。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分，不僅能增強機體的細胞免疫和體液免疫功能，而且能促進免疫器官的發(fā)育和細胞因子的分泌。黃芪多糖做為免疫增強劑和抗病毒藥物已被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。但是，目前大多數(shù)的黃芪多糖制劑在使用過程中藥物在到達作用部位之前，已被降解代謝或排除，有效血藥濃度水平維持時間短，因此需要大劑量或是連續(xù)給藥，但是連續(xù)給藥有很多缺點。利用脂質(zhì)體包封黃芪多糖，可以使黃芪多糖在動物體內(nèi)持續(xù)釋放，維持長時間的血藥濃度，提高其生物利用度。本發(fā)明采用硫酸銨梯度法將黃芪多糖制備成納米脂質(zhì)體，包封率較高、粒徑小，不僅便于藥物的吸收，而且可以使藥物緩慢地釋放，有效地延長了藥效，能顯著提高動物細胞免疫功能和體液免疫功能，對抵抗疫病有重要意義。本發(fā)明作為一種新型中獸藥，沒有副作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點如下:1.黃芪多糖納米脂質(zhì)體的制備國內(nèi)外未見報道，本發(fā)明提供了一種黃芪多糖納米脂質(zhì)體的制備方法，填補了國內(nèi)外研究的空白。2.黃芪多糖納米脂質(zhì)體的免疫增強活性未見報道。通過本發(fā)明的實施，證明黃芪多糖的免疫增強作用弱，通過制備成納米脂質(zhì)體后能夠顯著提高其免疫增強活性，表現(xiàn)為明顯提高抗體效價、淋巴細胞增殖、細胞因子IL-2和IFN-Y的含量，與黃芪多糖比，在免疫后期效果更好，具有較強的緩釋作用，從而增強動物體免疫功能。因此，黃芪多糖納米脂質(zhì)體可以作為研制新型免疫增強劑的材料，為研制新型免疫增強劑提供了材料和示范。
具體實施例方式1.黃芪多糖納米脂質(zhì)體的制備I)空白脂質(zhì)體的制備①將大豆卵磷脂150mg、膽固醇25mg、吐溫-80 37.5mg、乙醇IOmL,超聲混合；②在溫度43°C，恒流泵用60r/min將混合后的液體滴入IOmL 0.25mol/L硫酸銨溶液中，滴入過程中搖床振蕩；
③用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)，除去混合液中的乙醇；④在IL的PBS溶液(V空白脂質(zhì)體:Vpbs = I: 100)中透析24h，使脂質(zhì)體內(nèi)外形成硫酸銨梯度，制得空白脂質(zhì)體。2)載藥①取APS 15mg溶入IOml PBS溶液中。②取IOmL APS溶液與空白脂質(zhì)體等體積混合，50°C搖床振蕩lOmin。③將所得脂質(zhì)體過0.45 μ m微孔濾膜2次，0.22 μ m微孔濾膜2次，得黃芪多糖納米脂質(zhì)體。3)黃芪多糖納 米脂質(zhì)體包封率的測定采用苯酚-濃硫酸法測定多糖含量從而計算出脂質(zhì)體的包封率。①標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖IOmg定容于IOOmL量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.lmg/mL葡萄糖對照品溶液。在6支帶塞試管中分別加入葡萄糖對照品溶液O、
0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,加蒸懼水至2mL,再各加入5%苯酹溶液ImL,搖勻,迅速垂直液面加入濃硫酸5mL,混勻后在沸水浴中加熱15min,冷卻后用分光光度儀在490nm處測定吸光度值(以O(shè)mL葡萄糖對照品溶液管吸光度值為校正值)，以葡萄糖質(zhì)量濃度對吸光度值進行線性回歸，得回歸方程 Y = 13.066X-0.0121，R2 = 0.9976。②APS脂質(zhì)體混懸液中多糖總含量測定精密吸取100 μ L APS脂質(zhì)體，加蒸餾水至2mL，按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測得吸光度值，將吸光度值求平均數(shù)后代入回歸方程，計算，即得濃度 C&= 0.67mg/mL。③APS脂質(zhì)體包封的多糖含量測定吸取APS脂質(zhì)體ImL于IOOmL PBS溶液(V脂:Vpbs = I: 100)中透析24h，得包封的APS脂質(zhì)體，精密吸取透析后的脂質(zhì)體100 μ L，加蒸餾水至2mL，按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測得吸光度值，將吸光度值求平均數(shù)后代入回歸方程，計算，即得濃度C樣=0.56mg/mL。④包封率計算包封率=C樣X 100%/C總=0.56X100%/0.67 = 83.41%。4)粒度測定采用激光散射粒度測定儀測定粒徑，平均粒徑為89nm左右。2.黃芪多糖納米脂質(zhì)體免疫增強活性比較以根據(jù)最佳制備條件制備的黃芪多糖納米脂質(zhì)體(APSL)為研究對象，以黃芪多糖(APS)和空白納米脂質(zhì)體(BL)作為對照，測定了它們對雞新城疫(ND)疫苗免疫后機體抗體效價、淋巴細胞增殖、IgG和IgM含量、細胞因子IL-2和IFN-Y含量的影響。(I)動物分組及處理350只14日齡雛雞隨機均分為7組，分別為APSL的高(4mg -πιΓ1)、中(2mg -πιΓ1)、低(lmg.mL—1) 3個劑量組、APS組(4mg.mL—1)、BL組、疫苗組(VC)和空白對照組(BC)。14日齡時，除空白對照組外均用NDV-1V系疫苗免疫，28日齡二免。在首次免疫的同時，I 5組分別肌肉注射相應(yīng)藥物，0.5mL/只，疫苗組和空白對照組注射等量生理鹽水。分別于首免前和首免后7、14、21、28d檢測外周血T淋巴細胞增殖和血清HI抗體效價的動態(tài)變化，于首免后14、21、28d檢測血清中IL-2和IFN-Y含量的變化。(2)免疫應(yīng)答試驗血清抗體效價的變化在首免后第14天，APSL高、中劑量的抗體水平均高于APS組，顯著高于其它四個組(P < 0.05);在免首后21和28天，APSL高、中劑量的抗體水平均顯著其它五個組(P<0.05);在免首后7和14天，APS組的抗體效價顯著高于BL、疫苗組和空白組(P < 0.05)(見表I)。表I免疫應(yīng)答試驗抗體效價的動態(tài)變化(Log2)Table I The dynamic changes of antibody titers in in immune responsetest (Log2)
權(quán)利要求
1.一種黃芪多糖納米脂質(zhì)體的制備方法，采用硫酸銨梯度法制備黃芪多糖脂質(zhì)。
(1)采用硫酸銨梯度法制備黃芪多糖納米脂質(zhì)體(以制備20mL黃芪多糖納米脂質(zhì)體為例)。
將大豆卵磷脂150mg、膽固醇25mg、吐溫-80 37.5mg、乙醇IOml超聲混合。在溫度430C，恒流泵用60r/min將混合后的液體滴入IOml 0.25mol/L硫酸銨溶液中，滴入過程中搖床振蕩。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)，除去混合液中的乙醇。在IL的PBS溶液(Vseig5!#: Vpbs=1: 100)中透析24h,使脂質(zhì)體內(nèi)外形成硫酸銨梯度,制得空白脂質(zhì)體。取黃苗多糖15mg溶入IOml PBS溶液中，得黃芪多糖溶液，取IOmL黃芪多糖溶液與IOmL空白脂質(zhì)體混合，50°C搖床振蕩lOmin，將所得脂質(zhì)體過0.45 μ m微孔濾膜2次，0.22 μ m微孔濾膜2次，即得黃芪多糖納米脂質(zhì)體。
(2)按照上述方法制備黃芪多糖納米脂質(zhì)體的平均包封率為83.41%士 0.15%，平均粒徑89nm左右。
2.權(quán)利要求1所述方法獲得的黃芪多糖納米脂質(zhì)體能夠顯著提高動物免疫功能，具有較好免疫增強活 性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高畜禽免疫功能的黃芪多糖納米脂質(zhì)體及其制備方法，屬于中獸藥制備技術(shù)及免疫應(yīng)用領(lǐng)域。用硫酸銨梯度法制備黃芪多糖納米脂質(zhì)體，制備的黃芪多糖納米脂質(zhì)體包封率高達83.41％。黃芪多糖納米脂質(zhì)體能明顯提高動物抗體效價、淋巴細胞增殖及細胞因子含量，效果顯著好于黃芪多糖。本發(fā)明黃芪多糖納米脂質(zhì)體顯著提高了黃芪多糖的免疫增強活性。
文檔編號A61K9/127GK103191424SQ20121020368
公開日2013年7月10日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者王德云, 袁海星, 范云鵬, 余韻, 胡元亮, 劉家國, 趙曉娟 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)