一種藍(lán)萼甲素長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是一種藍(lán)萼甲素類藥物納米脂質(zhì)體及其制備方法以及在乳腺癌治療中的應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]藍(lán)萼甲素為15-氧-16貝殼杉烯骨架結(jié)構(gòu)的二萜類化合物，是藍(lán)萼香菜二萜類化合物的主要活性成份。具有心血管保護(hù)、抑菌、抗凝血、耐缺氧、抗乙肝病毒、抗腫瘤、內(nèi)皮保護(hù)、免疫抑制及調(diào)節(jié)鈣離子濃度等多種藥理作用，并且有很高的體內(nèi)安全性。民間常用于治療胃炎、乳腺炎、肝炎，腹痛，關(guān)節(jié)痛等疾病，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、腦供血不足等缺氧性心腦血管疾病。[0003]因其水溶性差，給藥困難，且在體內(nèi)代謝很快，如在肝微粒體中可代謝生成羥基或雙羥基產(chǎn)物，在膽汁中可代謝成異構(gòu)化產(chǎn)物，因而需長(zhǎng)時(shí)間大劑量給藥才能產(chǎn)生療效。[0004]納米脂質(zhì)體是指粒徑控制在10nm左右并用親水材料如聚乙二醇進(jìn)行表面修飾的納米脂質(zhì)體在靜脈注射后兼具“長(zhǎng)循環(huán)(Long-Circulat1n)”和“隱形(Stealthy)”或“立體穩(wěn)定(Stereo-Stable)”的特點(diǎn)，對(duì)減少肝臟巨噬細(xì)胞對(duì)藥物的吞噬、提高藥物靶向性、阻礙血液蛋白質(zhì)成分與磷脂等的結(jié)合、延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間等具有重要作用。[0005]由于脂質(zhì)體為脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，能包載脂溶性藥物，改善其水溶性差的不足，增加藥物的包載量;在納米脂質(zhì)體靶向到病變部位的同時(shí)，由于其含有的親水基團(tuán)而能阻止血液中許多不同組分特別是調(diào)理素與其結(jié)合，從而降低與單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的親和力，可在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定存在并延長(zhǎng)半衰，增加腫瘤組織對(duì)它的攝取，增強(qiáng)了治療效果。[0006]目前對(duì)藍(lán)萼甲素的劑型研究較少，藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體在藥物的增溶、緩釋及靶向等方面均表現(xiàn)出非常好的應(yīng)用前景?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體及其制備方法以及在乳腺癌治療中的應(yīng)用。[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案包括:[0009]制備一種藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體；[0010]載藥納米脂質(zhì)體體外抗乳腺癌及乳腺癌干細(xì)胞活性分析；[0011]本發(fā)明采用無血清培養(yǎng)方法分選富集乳腺癌干細(xì)胞，并通過乳腺癌干細(xì)胞的特異性抗原標(biāo)記物⑶24/⑶44進(jìn)行鑒定。[0012]首先，本發(fā)明的第一方面，提供了一種藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體，包含藍(lán)萼甲素藥物，藥學(xué)上可接受的生物學(xué)載體和配體，以及有機(jī)相和水相介質(zhì);所述的載體為卵磷脂和膽固醇(CHOL)，所述的配體為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2k)。[0013]所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體的平均粒徑小于200nm，并且是可無菌過濾的。所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體是藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體的無菌制劑，采用薄膜分散法制備得到。[0014]所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體中藍(lán)萼甲素藥物為有機(jī)相的0.l%-0.3%(w/v)，優(yōu)選的藍(lán)萼甲素為有機(jī)相的0.3%。[0015]所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體中生物學(xué)載體與配體的摩爾比為19:1-19:3，優(yōu)選的比例為生物學(xué)載體與配體的摩爾比為19:2。[0016]所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體中卵磷脂與膽固醇的摩爾比為85:10-1:1，優(yōu)選的比例為卵磷脂與膽固醇的摩爾比為85:10。[0017]所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體中卵磷脂選自蛋黃卵磷脂(優(yōu)選E80)，大豆卵磷脂(優(yōu)選S100)或氫化大豆卵磷脂HSPC中的一種或幾種，優(yōu)選的卵磷脂為大豆卵磷脂S100;所述的膽固醇為普通膽固醇。[0018]所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體中的水相介質(zhì)為0.9%(w/v)氯化鈉溶液，去離子水或PBS(pH為7.4)，優(yōu)選的水相介質(zhì)為0.9%(w/v)氯化鈉溶液。[0019]所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體中的有機(jī)相為氯仿和甲醇，優(yōu)選的有機(jī)相為氯仿。[0020]其次，本發(fā)明的第二方面，提供上述藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體的制備方法，采用薄膜分散法，具體制備方法如下:[0021]A.有機(jī)相配制:將載體和配體以及藍(lán)萼甲素藥物分散于有機(jī)相中；[0022]B.水相配制:將水相介質(zhì)預(yù)熱；[0023]C.然后將有機(jī)相超聲混勻后放入圓底燒瓶中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使形成均勻薄膜;將水相介質(zhì)倒入圓底燒瓶中加熱進(jìn)行水化;將水化好的液體進(jìn)行冰浴超聲得到藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體。[0024]所述的得到的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體采用透析法或超速離心法除去游離藥物并通過0.22μπι的聚碳酸酯膜除菌。[0025]所述的步驟C中水化溫度為50-60°C，優(yōu)選溫度為55°C。[0026]所述的步驟C中水化時(shí)間為30-50min，優(yōu)選時(shí)間為30min。[0027]所述的步驟C中超聲的功率為200-400w，優(yōu)選的超聲功率為300w。[0028]所述的步驟C中超聲時(shí)間為8-30min，優(yōu)選的超聲時(shí)間為8min。[0029]優(yōu)選的，上述藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體的制備方法，采用薄膜分散法，具體制備方法如下:[0030]I)有機(jī)相配制:稱取卵磷脂、膽固醇及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000分散于有機(jī)相中混合均勻后稱取藍(lán)萼甲素藥物混合于有機(jī)相中；[0031]2)水相配制;將5ml0.9%氯化鈉溶液預(yù)熱到55°C;[0032]3)有機(jī)相超聲混勻，加入250ml圓底燒瓶通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓旋蒸5min，旋蒸溫度為40°C，使形成均勻分散的薄膜；[0033]4)將預(yù)熱好的0.9%的氯化鈉溶液加入圓底燒瓶，旋蒸30min制成初乳，旋蒸溫度為55°C。[0034]5)將初乳在冰浴條件下進(jìn)行探頭超聲，超聲功率為300w，超聲時(shí)間為Smin得納米脂質(zhì)體。[0035]6)采用透析法或超速離心法去除游離藥物并通過0.22μπι碳酸脂膜過濾得到納米脂質(zhì)體。[0036]最后，本發(fā)明的第三方面，提供上述任一藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。[0037]所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體用于制備非胃腸道給藥的醫(yī)藥產(chǎn)品。所述的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體可以直接靜脈注射。[0038]所述藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體靶向乳腺癌細(xì)胞或乳腺癌干細(xì)胞。[0039]本發(fā)明采用cck-8檢測(cè)方法測(cè)定在不同給藥劑型、給藥時(shí)間和給藥濃度處理情況下乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞存活率，來評(píng)價(jià)藍(lán)萼甲素脂質(zhì)體對(duì)乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性。經(jīng)擬合曲線分析，比較不同處理情況下的Ic50值來比較其毒性大小。[0040]本發(fā)明制備的載藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體利用納米脂質(zhì)體緩釋，靶向等性質(zhì)可改善藍(lán)萼甲素水溶性差，體內(nèi)代謝快，給藥困難等不足，本發(fā)明的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體在藥物的增溶、緩釋及靶向等方面均表現(xiàn)出非常好的應(yīng)用前景?！靖綀D說明】[0041]圖1A為本發(fā)明的藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體的粒徑分布圖，圖1B為表面電位圖；[0042]圖2為本發(fā)明藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體的透射電鏡圖；[0043]圖3為本發(fā)明藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體的釋放行為圖；[0044]圖4A本發(fā)明空白納米脂質(zhì)體對(duì)suml49PT細(xì)胞毒性圖，圖4B為本發(fā)明空白納米脂質(zhì)體對(duì)suml49PT-TS細(xì)胞毒性圖；[0045]圖5A，B，C為本發(fā)明藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體對(duì)suml49PT細(xì)胞的24h，48h，72h的殺傷效果圖，圖，E，F(xiàn)為本發(fā)明藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體對(duì)suml49PT-TS細(xì)胞的24h，48h，72h的殺傷效果圖；[0046]圖6A為本發(fā)明藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體對(duì)suml49PT細(xì)胞殺傷效果的統(tǒng)計(jì)圖，圖6B為本發(fā)明藍(lán)萼甲素納米脂質(zhì)體對(duì)suml49PT-TS細(xì)胞殺傷效果的統(tǒng)計(jì)圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0047]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。除特有說明外，所有比例均為摩爾比，所有的％均為重量體積濃度。[0048]實(shí)施例1[0049]有機(jī)相配制:將HSPC:CHOL:DSPE_PEG_2k為85:10:10加入有機(jī)相中，將藍(lán)萼甲素當(dāng)前第1頁1 2 3 4