一種包載花生短肽的納米脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種包載花生短肽的納米脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用，該納米脂質(zhì)體原料包括卵磷脂、花生短肽、膽固醇和脫氧膽酸鈉；通過(guò)采用薄膜分散與Ostwald熟化相結(jié)合的方法制得。本發(fā)明納米脂質(zhì)體包封率達(dá)到82.21％，粒徑為89.70nm，具有良好的酸堿環(huán)境穩(wěn)定性、體外緩釋性和消化穩(wěn)定性。
【專利說(shuō)明】
一種包載花生短肽的納米脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品加工領(lǐng)域，具體的，涉及一種包載花生短肽的納米脂質(zhì)體及其制 備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生短肽的開(kāi)發(fā)近年來(lái)受到了廣泛的重視，已經(jīng)報(bào)道的花生短肽和酶解產(chǎn)物目前 有十幾種，生理功能主要集中于ACE抑制、抗氧化活性等。與大量的花生短肽及酶解產(chǎn)物種 類不斷得到報(bào)道相對(duì)照，花生短肽的實(shí)際應(yīng)用卻基本是空白，主要的原因是作為食品應(yīng)用 的短肽必須通過(guò)口服方式進(jìn)入體內(nèi)，嚴(yán)苛的胃腸道環(huán)境使短肽被胃蛋白酶、胰蛋白酶以及 肽酶等降解而喪失生理活性，因此至今未見(jiàn)有花生短肽能夠通過(guò)小腸上皮細(xì)胞成功進(jìn)入到 人體血液或淋巴循環(huán)中的相關(guān)報(bào)道。
[0003] 構(gòu)建脂質(zhì)體運(yùn)載體系，保護(hù)短肽躲避胃腸道環(huán)境是解決上述問(wèn)題的一個(gè)有效方 案。親水性、疏水性短肽分別能夠以包載、嵌入等多種形式結(jié)合到脂質(zhì)體運(yùn)載體系中，而完 成體內(nèi)輸送。但花生短肽同時(shí)又具有強(qiáng)親水性特征，在脂質(zhì)體制備時(shí)親水性短肽更傾向于 分布在外水相中，包封率過(guò)低成為親水類藥物脂質(zhì)體應(yīng)用的主要障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種包載花生短肽的納米脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用。本 發(fā)明以花生短肽為原料，采用薄膜分散法，通過(guò)優(yōu)化脂質(zhì)體組成，提高脂質(zhì)體對(duì)短肽的包封 率；同時(shí)通過(guò)優(yōu)化HPM工藝，制備納米脂質(zhì)體，以賦予脂質(zhì)體更好的體內(nèi)性質(zhì)；有效利用 Ostwald熟化，增加脂質(zhì)體包封率和應(yīng)用穩(wěn)定性。
[0005] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供一種包載花生短肽的納米脂質(zhì)體，其原料包括卵磷 月旨、花生短肽、膽固醇和脫氧膽酸鈉。
[0006] 優(yōu)選地，所述包載花生短肽的納米脂質(zhì)體，其原料中卵磷脂與花生短肽的質(zhì)量比 為10-12:1，進(jìn)一步優(yōu)選為11.47:1;
[0007] 卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為9-10.5:1，進(jìn)一步優(yōu)選為9.52:1;
[0008] 卵磷脂與脫氧膽酸鈉的質(zhì)量比為4-5:1，進(jìn)一步優(yōu)選為4.40:1;
[0009] 本發(fā)明還提供上述包載花生短肽的納米脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1)將卵磷脂、花生短肽、膽固醇和脫氧膽酸鈉加入乙醇，水浴超聲直至完全溶解；
[0011] 2)將步驟1)所得溶液在水浴條件下減壓蒸發(fā)除去乙醇，直至減壓蒸發(fā)儀容器(例 如茄形瓶)壁上形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜;然后加入PBS(pH7.4)緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合，得到脂 質(zhì)體粗懸液；
[0012] 3)將所述脂質(zhì)體粗懸液進(jìn)行高壓微射流均質(zhì)，均質(zhì)壓力為60-130Mpa，循環(huán)處理Ια次 ，得到納米脂質(zhì)體；
[0013] 4)將所述納米脂質(zhì)體攪拌，即得所述包載花生短肽的納米脂質(zhì)體。
[0014] 優(yōu)選地，步驟1)所述卵磷脂與花生短肽的質(zhì)量比為10-12:1，進(jìn)一步優(yōu)選為11.47: 1;卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為9-10.5:1，進(jìn)一步優(yōu)選為9.52:1;卵磷脂與脫氧膽酸鈉的質(zhì) 量比為4-5:1，進(jìn)一步優(yōu)選為4.40:1;
[0015]優(yōu)選地，步驟1)所得溶液(溶劑為乙醇）中卵磷脂的濃度為3.8-4.6mg/mL，進(jìn)一步 優(yōu)選為4.21mg/mL。
[0016]優(yōu)選地，步驟1)所述乙醇為95%乙醇(體積分?jǐn)?shù)）。
[0017 ] 優(yōu)選地，步驟2)中PBS (pH7.4)緩沖液的加入量與步驟1)乙醇的加入量相同；
[0018] 優(yōu)選地，所述PBS(pH7.4)緩沖液的濃度為0.0 lmol/L;
[0019] 優(yōu)選地，使步驟2)所得脂質(zhì)體充分溶解于PBS緩沖液中；
[0020] 優(yōu)選地，步驟2)所述水浴溫度為40-50°C，進(jìn)一步優(yōu)選為45°C ;
[0021 ]優(yōu)選地，步驟2)所述加壓蒸發(fā)真空度為-0.07~-0. lOMpa，進(jìn)一步優(yōu)選為-0·09Mpa;
[0022] 優(yōu)選地，步驟2)所述旋轉(zhuǎn)水合時(shí)間為30-120min;進(jìn)一步優(yōu)選為60min。
[0023] 優(yōu)選地，步驟3)所述均質(zhì)壓力為110_130MPa，進(jìn)一步優(yōu)選為120Mpa;
[0024] 優(yōu)選地，步驟3)所述循環(huán)處理次數(shù)為2-4次。
[0025] 步驟3)可通過(guò)高壓微射流均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)。
[0026] 步驟3)中通過(guò)高壓微射流的高速碰撞、高頻振蕩、瞬時(shí)壓降、強(qiáng)烈剪切等作用將會(huì) 破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)重組，使脂質(zhì)體具有更強(qiáng)的機(jī)械和環(huán)境適應(yīng)性。
[0027]優(yōu)選地，步驟4)所述攪拌在室溫(一般溫度為15-30 °C)條件下進(jìn)行；
[0028] 優(yōu)選地，步驟4)所述攪拌速度為20-100rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為30-70rpm，更優(yōu)選為 50rmp；
[0029] 優(yōu)選地，步驟4)所述攪拌時(shí)間為12_24h;
[0030] 步驟4)所述攪拌可采用磁力攪拌器。
[0031]步驟4)中低速攪拌目的是促進(jìn)脂質(zhì)體充分水合，形成有限聚集，增加對(duì)親水性短 肽的包封率。
[0032]具體地，上述制備方法，包括以下步驟：
[0033] 1)將卵磷脂、花生短肽、膽固醇和脫氧膽酸鈉加入乙醇，水浴超聲直至完全溶解； 卵磷脂與花生短肽的質(zhì)量比為11.47:1;卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為9.52:1;卵磷脂與脫氧 膽酸鈉的質(zhì)量比為4.40:1;所得溶液中卵磷脂的濃度為4.2 lmg/mL;
[0034] 2)將步驟1)所得溶液在45°C水浴條件下減壓蒸發(fā)除去乙醇，真空度為_(kāi)0.09Mpa， 直至減壓蒸發(fā)儀容器壁上形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜;然后加入與步驟1)所加乙醇等量的 0.01mol/L的PBS緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合60min，得到脂質(zhì)體粗懸液；
[0035] 3)將所述脂質(zhì)體粗懸液進(jìn)行高壓微射流均質(zhì)，均質(zhì)壓力為120Mpa，循環(huán)處理4次， 得到納米脂質(zhì)體；
[0036] 4)將所述納米脂質(zhì)體攪拌，攪拌速度為50rpm攪拌時(shí)間為12-24h，即得。
[0037] 本發(fā)明還提供了利用上述方法制備的包載花生短肽的納米脂質(zhì)體。
[0038] 本發(fā)明還提供了上述包載花生短肽的納米脂質(zhì)體或按照上述方法制備的包載花 生短肽的納米脂質(zhì)體在制備用于抑制ACE(即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)活性和/或抗氧化活性的 制劑中的應(yīng)用。
[0039] 優(yōu)選地，所述制劑包括降壓食品或降壓藥品。
[0040]本發(fā)明所述花生短肽可由現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法制備得到或市售得到;例如采用李寧 等的方法（李寧，紅芝，劉麗，王強(qiáng).中性蛋白酶分步酶解花生分離蛋白制備花生短肽的研 究.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013,46(24) :5237-5247)制備。
[0041 ] 本發(fā)明所述Ostwald熟化是指Wilhelm Ostwald在1896年發(fā)現(xiàn)的一種描述固溶體 中多相結(jié)構(gòu)隨著時(shí)間的變化而變化的一種現(xiàn)象。
[0042] 有益效果：
[0043] 1.本發(fā)明所述包載花生短肽的納米脂質(zhì)體采用薄膜分散與Ostwald熟化相結(jié)合的 方法制備而成，采用優(yōu)化的組成、高壓微射流壓力和循環(huán)次數(shù)，實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)體對(duì)花生短肽的 最大程度包封，為后續(xù)脂質(zhì)體體內(nèi)應(yīng)用創(chuàng)造了最佳的作用環(huán)境；
[0044] 2.本發(fā)明所述的花生短肽納米脂質(zhì)體的制備方法，成本低廉，制備工藝簡(jiǎn)單，可操 作性強(qiáng)；
[0045] 3.本發(fā)明所述的花生短肽納米脂質(zhì)體的制備方法，所獲得的脂質(zhì)體短肽包封率達(dá) 到82 · 21 %，粒徑為89 · 70nm，具有體外的體外緩釋性和抗消化能力。
【附圖說(shuō)明】
[0046] 圖1為本發(fā)明所述薄膜分散與Ostwald熟化相結(jié)合制備包封短肽納米脂質(zhì)體的方 法示意圖。
[0047] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中高壓微射流不同壓力對(duì)花生短肽脂質(zhì)體的粒徑和多分散 指數(shù)的影響。
[0048] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中高壓微射流不同壓力對(duì)花生短肽脂質(zhì)體的包封率影響。
[0049] 圖4為本發(fā)明中高壓微射流120MPa處理壓力下不同循環(huán)次數(shù)對(duì)花生短肽脂質(zhì)體粒 徑和包封率的影響。
[0050] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中所得花生短肽納米脂質(zhì)體和粗脂質(zhì)體在不同pH條件下泄 漏率變化對(duì)比。
[0051] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中所得花生短肽納米脂質(zhì)體與粗脂質(zhì)體、游離肽體外釋放度 對(duì)比。
[0052]圖7為本發(fā)明實(shí)施例6中所得花生短肽納米脂質(zhì)體與粗脂質(zhì)體、游離肽、水體外模 擬消化前后ACE抑制活性變化對(duì)比。
[0053]圖8為本發(fā)明實(shí)施例6中所得花生短肽納米脂質(zhì)體與粗脂質(zhì)體體外模擬消化前后 微觀結(jié)構(gòu)變化對(duì)比。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但 不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0055]下述實(shí)施例中采用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器有限公司；高壓微射流處理 為通過(guò)微射流高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行，設(shè)備為美國(guó)BEE international公司生產(chǎn);粒徑分析采用的 儀器為英國(guó)馬爾文儀器有限公司生產(chǎn)的Zeta電位分析儀;透射電鏡為日本日立公司生產(chǎn)的 H-7500透射電子顯微鏡；高效液相色譜采用美國(guó)Waters公司的Waters 1525高效液相色譜 系統(tǒng)。
[0056] 以下實(shí)施例所用花生短肽采用李寧等的方法(李寧，紅芝，劉麗，王強(qiáng).中性蛋白酶 分步酶解花生分離蛋白制備花生短肽的研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46(24): 5237-5247)制 備。
[0057] 下述實(shí)施例中采用下述方法進(jìn)行測(cè)定和分析。
[0058]脂質(zhì)體包封率測(cè)定:超濾離心法
[0059]脂質(zhì)體破乳后測(cè)定肽含量(Co)，取10mL脂質(zhì)體，置于截留量為lOKDa的超濾離心管 中，常溫下3500rpm轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液0.2mL，測(cè)定肽含量(Ci)，按照計(jì)算包封率。
[0061]脂質(zhì)體粒徑和多分散指數(shù)(PDI)的測(cè)定:Zeta電位儀法
[0062]用Zeta電位儀測(cè)定脂質(zhì)體粒徑，測(cè)定溫度25°C。采用儀器自帶軟件，計(jì)算多分散指 數(shù)。
[0063] 脂質(zhì)體不同酸堿環(huán)境下穩(wěn)定性測(cè)定
[0064] 脂質(zhì)體和超濾離心濾液先經(jīng)破乳處理，福林酚法測(cè)定肽含量(Co)和濾液肽含量 (&)。取6mL脂質(zhì)體裝入截留分子量為lOKDa的透析袋中，分別置于pH值2·0、4·5、6·0、8·0、 10.0的50mL濃度0.01Μ磷酸緩沖液中，37°C水浴搖床中l(wèi)OOrprn振蕩30min。之后，取3mL脂質(zhì) 體移入截留分子量為3KDa的超濾離心管中，3500rpm轉(zhuǎn)速離心15min，濾液破乳后測(cè)定肽含 量(C 2)。泄露率按下式計(jì)算。
[0066] 脂質(zhì)體體外釋放度的測(cè)定
[0067] 脂質(zhì)體和游離肽的體外釋放采用Liu等（2015)的透析方法略加修改。脂質(zhì)體和超 濾離心濾液破乳后，分別測(cè)定脂質(zhì)體(Co)和濾液(&)肽含量。然后，取50mL脂質(zhì)體樣品和游 離肽樣品（肽濃度與脂質(zhì)體相同）中裝入截留分子量為l〇KDa的透析袋中，置于50mL pH 7.0 的0.01M磷酸緩沖液中，37 °C水浴搖床中l(wèi)OOrpm振蕩。之后，每隔固定時(shí)間取樣3mL脂質(zhì)體移 入截留分子量為3KDa的超濾離心管中，3500rpm轉(zhuǎn)速離心15min，濾液破乳后測(cè)定肽含量 (C 2)。泄露率按下式計(jì)算。
[0069] 對(duì)于脂質(zhì)體，Co為脂質(zhì)體樣品中肽含量;Ci為脂質(zhì)體樣品超濾離心濾液中肽含量； C2為每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的樣品超濾離心濾液肽含量。
[0070] 對(duì)于游離肽，Co為游離肽樣品中肽含量;(^ = 0;(：2為每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的樣品肽含 量。
[0071] 脂質(zhì)體體外消化分析
[0072] 5mL脂質(zhì)體樣品中加入1.0mol/L HC1將溶液pH調(diào)至2.0,并加入用0.1M HCl(pH 2.0)配制濃度為80mg/mL的胃蛋白酶120yL，37 °C模擬胃液消化1 h。然后，采用1.0mo 1 /L NaOH將體系pH調(diào)至7.5，并加入400yL配制在0.1M NaHC03溶液中的腸液消化酶(含4mg/mL胰 酶和24mg/mL脫氧膽酸鈉），進(jìn)行37°C模擬腸液消化lh。冷卻至4°C滅酶。
[0073] ACE抑制活性的測(cè)定:高效液相色譜法
[0074]分別精確稱取花生短肽，加入去離子水分別配制成2mg/mL、lmg/mL、0.5mg/mL、 0.2mg/mL、0.05mg/mL濃度的短肽溶液，采用高效液相色譜對(duì)短肽的ACE抑制活性進(jìn)行測(cè)定， 條件為：色譜柱Sunf ire TM-C18(250 X 4.6mm)，流動(dòng)相：乙腈：水：三氟乙酸=50:50:0.05， 流速:0.4mL/min，溫度:30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng):228nm。測(cè)定結(jié)果采用Origin 8.0軟件計(jì)算IC50值。 [0075]微觀結(jié)構(gòu)觀察:透射電鏡法
[0076] 用去離子水將固體樣品配制成濃度為lmg/mL (w/v)的溶液，取一滴溶液加到覆有 聚乙烯醇縮甲醛脂膜的銅網(wǎng)上，銅網(wǎng)水平放置2~3min使分子聚集體沉積到網(wǎng)面上，用濾紙 吸去表面多余溶液，之后滴加2 %的醋酸雙氧釉溶液負(fù)染2min，將銅網(wǎng)在濾紙上放置3min使 充分染色并吸去多余的染液，干燥后用透射電子顯微鏡觀察并拍照。
[0077] 實(shí)施例1高壓微射流不同壓力處理對(duì)脂質(zhì)體粒徑和包封率影響
[0078] 第一步：稱取卵磷脂42lmg，花生短肽36 · 7mg，膽固醇44 · 2mg，脫氧膽酸鈉95 · 7mg， 加入95%乙醇100mL，水浴超聲直至完全溶解；
[0079]第二步:將溶液在45°C水浴條件下減壓，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，真空度為_(kāi)0.09MPa， 直至前形瓶壁上形成一層均勾的脂質(zhì)薄膜。向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入100mL的0.01mol/L的PBS (pH7.4)緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合60min，得到脂質(zhì)體粗懸液；
[0080] 第三步：將所述脂質(zhì)體粗懸液通過(guò)高壓微射流均質(zhì)機(jī)，處理壓力分別為60、90、 120、150、180MPa，循環(huán)處理1次，測(cè)定脂質(zhì)體粒徑和包封率。
[0081] 脂質(zhì)體粒徑結(jié)果如圖2所示，很明顯HPM處理能夠顯著降低載荷花生短肽的脂質(zhì)體 粒徑。即使在最低的6 0 Μ P a處理下，脂質(zhì)體粒徑也有大幅度的下降，從對(duì)照時(shí)3 01.8 5 土 15 · 91nm降低到60MPa時(shí)的92 ·43±2 · 48nm，已經(jīng)成為納米脂質(zhì)體。隨著壓力的增加脂質(zhì)體粒 徑繼續(xù)下降。
[0082]脂質(zhì)體的多分散指數(shù)在120MPa之前隨壓力增加而持續(xù)下降，而在120MPa之后隨壓 力上升與120MPa對(duì)比有顯著上升。低的Η)Ι表明了窄的粒徑分布，PDI在120MPa之前持續(xù)下 降表明隨壓力增加脂質(zhì)體顆粒趨向均一化，而120MPa后Η)Ι增大，預(yù)示著體系構(gòu)成開(kāi)始趨向 雜亂，這也會(huì)對(duì)體系的性質(zhì)產(chǎn)生影響。
[0083] 脂質(zhì)體包封率測(cè)定結(jié)果如圖3所示，除120MPa外，HPM不同壓力處理均顯著降低了 載荷花生短肽脂質(zhì)體的包封率(P<〇. 05)。有所區(qū)別的是，120MPa之前包封率的下降幅度要 小于120MPa之后，總體來(lái)講，HPM處理會(huì)降低脂質(zhì)體包封率。Frederik等（1991)曾經(jīng)報(bào)道過(guò) 粒徑小于200nm的親水性藥物，包封率會(huì)隨著粒徑的下降而顯著降低，過(guò)低的粒徑并不利于 包封能力的提高，因此就包封率來(lái)講，120Mpa為適宜的HPM處理壓力。
[0084]實(shí)施例2高壓微射流120MPa處理不同循環(huán)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體粒徑和包封率影響 [0085] 第一步：稱取卵磷脂42lmg，花生短肽36 · 7mg，膽固醇44 · 2mg，脫氧膽酸鈉95 · 7mg， 加入95%乙醇100mL，水浴超聲直至完全溶解；
[0086]第二步:將溶液在45°C水浴條件下減壓，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，真空度為-0.09MPa， 直至前形瓶壁上形成一層均勾的脂質(zhì)薄膜。向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入100mL的0.01mol/L的PBS (pH7.4)緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合60min，得到脂質(zhì)體粗懸液；
[0087]第三步:將所述脂質(zhì)體粗懸液通過(guò)高壓微射流均質(zhì)機(jī)，處理壓力為120MPa，循環(huán)處 理1-5次，測(cè)定不同循環(huán)處理的脂質(zhì)體粒徑和包封率。
[0088] 從圖4中可以看出，HPM處理壓力120MPa下不同循環(huán)次數(shù)對(duì)于脂質(zhì)體粒徑和包封率 也會(huì)產(chǎn)生一定影響。循環(huán)次數(shù)顯著改變了脂質(zhì)體包封率。循環(huán)處理4次使脂質(zhì)體包封率從 41.72± 1.97%增加到59.65±2.81 %，循環(huán)次數(shù)增加包封率則有所下降。
[0089]而從脂質(zhì)體粒徑來(lái)看，循環(huán)次數(shù)增加也能降低粒徑，從1次循環(huán)時(shí)的79.70 ± 1.05nm，降低至4次循環(huán)時(shí)的65.10 ± 1.29nm，繼續(xù)處理對(duì)于粒徑無(wú)明顯影響，因此綜合考 慮，采用120MPa下處理4次可以作為納米脂質(zhì)體制備的工藝參數(shù)。
[0090]實(shí)施例3納米脂質(zhì)體Ostwald熟化對(duì)包封率影響
[0091 ] 第一步：稱取卵磷脂42lmg，花生短肽36 · 7mg，膽固醇44 · 2mg，脫氧膽酸鈉95 · 7mg， 加入95%乙醇100mL，水浴超聲直至完全溶解；
[0092]第二步:將溶液在45°C水浴條件下減壓，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，真空度為_(kāi)0.09MPa， 直至前形瓶壁上形成一層均勾的脂質(zhì)薄膜。向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入100mL的0.01mol/L的PBS (pH7.4)緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合60min，得到脂質(zhì)體粗懸液；
[0093]第三步:將所述脂質(zhì)體粗懸液通過(guò)高壓微射流均質(zhì)機(jī)，處理壓力為120MPa，循環(huán)處 理4次，得到納米脂質(zhì)體；
[0094]第四步:將所述納米脂質(zhì)體室溫條件下分別以20、50、100rpm速率攪拌，攪拌時(shí)間 分別為12h、24h、36h和48h。測(cè)定脂質(zhì)體粒徑包封率。
[0095]剛制備完成納米脂質(zhì)體的包封率為55.28±3.31%，從表1可以發(fā)現(xiàn)，常溫下適度 攪拌都能提高包封率，低速、長(zhǎng)時(shí)攪拌包封率提升較大。同等時(shí)間下，攪拌速度為50rpm時(shí)有 更高的效率，因此選擇50rpm攪拌速度，而攪拌24h和48h之間雖然有所差別，但差異并不顯 著（p>0.05)，此外，考慮到常溫下長(zhǎng)時(shí)間存放可能會(huì)造成脂質(zhì)體氧化等因素，因此選擇 50rpm下攪拌24h作為適宜的主動(dòng)Ostwald熟化工藝，經(jīng)過(guò)處理后，脂質(zhì)體包封率可提高到 80%以上。
[0096]表1攪拌時(shí)間、速度對(duì)于脂質(zhì)體包封率影響
[0098] 注：同一行不同字母表示差異顯著。
[0099]實(shí)施例4納米脂質(zhì)體酸堿環(huán)境下穩(wěn)定性
[0?00] 第一步：稱取卵磷脂42lmg，花生短肽36 · 7mg，膽固醇44 · 2mg，脫氧膽酸鈉95 · 7mg， 加入95%乙醇100mL，水浴超聲直至完全溶解；
[0101]第二步:將溶液在45°C水浴條件下減壓，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，真空度為-0.09MPa， 直至前形瓶壁上形成一層均勾的脂質(zhì)薄膜。向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入100mL的0.01mol/L的PBS (pH7.4)緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合60min，得到脂質(zhì)體粗懸液；
[0102] 第三步:將所述脂質(zhì)體粗懸液通過(guò)高壓微射流均質(zhì)機(jī)，處理壓力為120MPa，循環(huán)處 理4次，得到納米脂質(zhì)體；
[0103] 第四步:將所述納米脂質(zhì)體室溫條件下以50rpm速率攪拌24，24h，獲得包封花生短 肽的納米脂質(zhì)體。
[0104] 第五步:測(cè)定制備的納米脂質(zhì)體與粗脂質(zhì)體在不同pH條件下泄漏率。
[0105] 從圖5可以發(fā)現(xiàn)，載荷花生短肽的脂質(zhì)體在不同pH環(huán)境下表現(xiàn)了較好的穩(wěn)定性，最 高泄漏率出現(xiàn)在PH2.0條件下，粗脂質(zhì)體和納米脂質(zhì)體分別為21.96 ± Ο . 95 %和12.53 土 0.53%。納米脂質(zhì)體具有更好的酸性條件下穩(wěn)定性。
[0106]實(shí)施例5納米脂質(zhì)體體外釋放度
[0? 07] 第一步:稱取卵磷脂842mg，花生短肽73.4mg，膽固醇88.4mg，脫氧膽酸鈉191.4mg， 加入95 %乙醇200mL，水浴超聲直至完全溶解；
[0108] 第二步:將溶液在45°c水浴條件下減壓，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，真空度為-0.09MPa， 直至茄形瓶壁上形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜。向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入200mL的O.Olmol/L的PBS (pH7.4)緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合60min，得到脂質(zhì)體粗懸液；
[0109] 第三步:將所述脂質(zhì)體粗懸液通過(guò)高壓微射流均質(zhì)機(jī)，處理壓力為120MPa，循環(huán)處 理4次，得到納米脂質(zhì)體；
[0110]第四步:將所述納米脂質(zhì)體室溫條件下以50rpm速率攪拌24，24h，獲得包封花生短 肽的納米脂質(zhì)體。
[0111] 第五步:測(cè)定制備的納米脂質(zhì)體與粗脂質(zhì)體和游離短肽的體外釋放度。
[0112] 從圖6可以看出，游離肽快速釋放到介質(zhì)中，4h時(shí)的釋放率達(dá)到49.37± 3.07%，而 粗脂質(zhì)體和納米脂質(zhì)體的釋放則要緩慢的多，分別只有3.57 ±0.23%和1.27 ±0.06 %。溫 孵時(shí)間達(dá)到16h時(shí)，游離肽幾乎完全釋放，而兩種脂質(zhì)體則都低于30%，脂質(zhì)體明顯延遲了 肽的釋放，具有良好的緩釋效果。粗脂質(zhì)體和納米脂質(zhì)體36h的累計(jì)釋放率分別為78.12± 4.69%和59.21 ± 2.67%，納米脂質(zhì)體表現(xiàn)了更好的體外緩釋性。
[0113]實(shí)施例6納米脂質(zhì)體抗消化性
[0114] 第一步：稱取卵磷脂1263mg，花生短肽110 . lmg，膽固醇132.6mg，脫氧膽酸鈉 287. lmg，加入95 %乙醇300mL，水浴超聲直至完全溶解；
[0115]第二步:將溶液在45°C水浴條件下減壓，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，真空度為_(kāi)0.09MPa， 直至茄形瓶壁上形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜。向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入300mL的0.01m〇l/L的PBS (pH7.4)緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合60min，得到脂質(zhì)體粗懸液；
[0116] 第三步:將所述脂質(zhì)體粗懸液通過(guò)高壓微射流均質(zhì)機(jī)，處理壓力為120MPa，循環(huán)處 理4次，得到納米脂質(zhì)體；
[0117] 第四步:將所述納米脂質(zhì)體室溫條件下以50rpm速率攪拌24，24h，獲得包封花生短 肽的納米脂質(zhì)體。
[0118] 第五步:將制備的納米脂質(zhì)體與粗脂質(zhì)體進(jìn)行模擬體外消化，測(cè)定消化后ACE抑制 活性變化，采用透射電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)變化。
[0119] 從圖7中可以看出消化前粗脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體和游離肽表現(xiàn)了相近的ACE抑制活 性。而經(jīng)過(guò)體外模擬消化后，包括水在內(nèi)，試驗(yàn)樣品的ACE抑制活性都有顯著提高這表明胃 腸道消化酶系對(duì)花生短肽的ACE抑制活性有一定影響。游離肽的ACE抑制活性提高幅度最 小，而納米脂質(zhì)體的活性上升最大，這表明納米脂質(zhì)體比粗脂質(zhì)體和游離肽表現(xiàn)了更高的 生物利用度。
[0120] 從圖8中可以看出，納米脂質(zhì)體表現(xiàn)了較高的消化穩(wěn)定性，可以從對(duì)消化后脂質(zhì)體 微觀結(jié)構(gòu)變化中得到證實(shí)。粗脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)破損多，基本見(jiàn)不到完整脂質(zhì)體結(jié)構(gòu);而納米脂質(zhì) 體則保持了相對(duì)完整的結(jié)構(gòu)，這表明納米脂質(zhì)體能夠成功地保護(hù)花生短肽免于胃腸道消化 酶系和強(qiáng)酸性環(huán)境的攻擊。
[0121] 本發(fā)明具有以下有益效果:對(duì)比親水性短肽，本發(fā)明制備的脂質(zhì)體明顯提高了具 有強(qiáng)親水性特征的花生短肽的包封率，達(dá)到82.21 %，粒徑為89.70nm;納米脂質(zhì)體具有良好 的酸堿環(huán)境穩(wěn)定性和體外緩釋性;體外模擬消化后ACE抑制活性保持穩(wěn)定，基本保持了完整 的結(jié)構(gòu)形態(tài)，表現(xiàn)了良好的抗消化穩(wěn)定性。
[0122] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種包載花生短肽的納米脂質(zhì)體，其原料包括卵磷脂、花生短肽、膽固醇和脫氧膽酸 鈉。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的包載花生短肽的納米脂質(zhì)體，其特征在于，其原料中卵磷脂與 花生短肽的質(zhì)量比為10-12:1，卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為9-10.5:1，卵磷脂與脫氧膽酸鈉 的質(zhì)量比為4-5:1; 優(yōu)選地，其原料中卵磷脂與花生短肽的質(zhì)量比為11.47:1;卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為 9.52:1;卵磷脂與脫氧膽酸鈉的質(zhì)量比為4.40:1。3. 權(quán)利要求1或2所述包載花生短肽的納米脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟： 1) 將卵磷脂、花生短肽、膽固醇和脫氧膽酸鈉加入乙醇，水浴超聲直至完全溶解； 2) 將步驟1)所得溶液在水浴條件下減壓蒸發(fā)除去乙醇，直至減壓蒸發(fā)儀容器壁上形成 一層均勻的脂質(zhì)薄膜;然后加入PBS緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合，得到脂質(zhì)體粗懸液； 3) 將所述脂質(zhì)體粗懸液進(jìn)行高壓微射流均質(zhì)，均質(zhì)壓力為60-130Mpa，循環(huán)處理1-4次， 得到納米脂質(zhì)體； 4) 將所述納米脂質(zhì)體攪拌，即得。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所得溶液中卵磷脂的濃度為 3 · 8-4 · 6mg/mL，優(yōu)選為4 · 2 lmg/mL。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中PBS緩沖液的加入量與步 驟1)乙醇的加入量相同；優(yōu)選地，所述PBS緩沖液的濃度為0.01mol/L，pH值為7.4。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述水浴溫度為40-50 °C，優(yōu)選為45°C; 所述加壓蒸發(fā)真空度為. 07~-0.1 OMpa，優(yōu)選為-0.09Mpa; 所述旋轉(zhuǎn)水合時(shí)間為30_120min，優(yōu)選為60min。7. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述均質(zhì)壓力為110-130MPa，優(yōu)選為120Mpa;所述循環(huán)處理次數(shù)為2-4次。8. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中所述攪拌速度為20-1 OOrpm，優(yōu)選為 30_70rpm，更優(yōu)選為 50rmp; 和/或，所述攪拌時(shí)間為12_24h。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將卵磷脂、花生短肽、膽固醇和脫氧膽酸鈉加入乙醇，水浴超聲直至完全溶解;卵磷 脂與花生短肽的質(zhì)量比為11.47:1;卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為9.52:1;卵磷脂與脫氧膽酸 鈉的質(zhì)量比為4.40:1;所得溶液中卵磷脂的濃度為4.2 lmg/mL; 2) 將步驟1)所得溶液在45°C水浴條件下減壓蒸發(fā)除去乙醇，真空度為_(kāi)0.09Mpa，直至 減壓蒸發(fā)儀容器壁上形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜；然后加入與步驟1)所加乙醇等量的 0.0 lmol/L的PBS緩沖液，旋轉(zhuǎn)水合60min，得到脂質(zhì)體粗懸液； 3) 將所述脂質(zhì)體粗懸液進(jìn)行高壓微射流均質(zhì)，均質(zhì)壓力為120Mpa，循環(huán)處理4次，得到 納米脂質(zhì)體； 4) 將所述納米脂質(zhì)體攪拌，攪拌速度為50rpm攪拌時(shí)間為12-24h，即得。10. 權(quán)利要求1或2所述的包載花生短肽的納米脂質(zhì)體或權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)所述方法 制備的包載花生短肽的納米脂質(zhì)體在制備用于抑制ACE活性和/或抗氧化活性的制劑中的 應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述制劑包括降壓食品或降壓藥品。
【文檔編號(hào)】A61P39/06GK105902996SQ201610366274
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】王強(qiáng), 石愛(ài)民, 龔魁杰, 劉紅芝, 劉麗, 胡暉, 楊穎
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所