專利名稱：預(yù)防和治療腦膜炎球菌性疾病的新型免疫原性組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及奈瑟氏球菌屬0RF2086蛋白(亞科A和亞科B)，它可從奈瑟氏球菌屬的菌株以及免疫原性部分和/或所述蛋 白的生物學(xué)等價物分離，所述菌株包括腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(血清組 A、B、C、D、W-135、X、Y、Z 和 29E)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和乳糖奈瑟氏球菌(Neisseria lactamica)菌株。本發(fā)明還涉及免疫特異性結(jié)合所述蛋白質(zhì)、免疫原性蛋白和/或生物學(xué)等價物的抗體。此外，本發(fā)明涉及分離含有編碼任何上述蛋白質(zhì)、免疫原性部分、生物學(xué)等價物和/或抗體的核酸序列的多核苷酸。此外，本發(fā)明涉及免疫原性組合物及其在預(yù)防、治療和/或診斷由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的腦膜炎球菌感染，尤其是由腦膜炎奈瑟氏球菌血清組b引起的腦膜炎球菌性疾病中的應(yīng)用，以及制備所述組合物的方法。本發(fā)明涉及重組形式和分離自天然來源的形式，以及脂質(zhì)化和非脂質(zhì)化的形式。
背景技術(shù)：
盡管可利用抗生素，但腦膜炎球菌性腦膜炎仍是一種可以使兒童和青少年在數(shù)小時內(nèi)死亡的疾病。Pizza等，2000，Science 287:1816-1820。腦膜炎以腦膜發(fā)炎為特征，這會導(dǎo)致劇烈頭痛、發(fā)燒、喪失食欲、對光和聲不耐受、肌肉僵硬，尤其是頸部肌肉僵硬，嚴(yán)重時會導(dǎo)致抽搐、嘔吐和譫妄，從而導(dǎo)致死亡。腦膜炎球菌性腦膜炎癥狀突然出現(xiàn)，最終將導(dǎo)致腦膜炎球菌性敗血癥，其特征為出血性皮疹。如果有任何存活機會都要緊急進(jìn)行快速診斷和用大劑量抗生素立即治療?！禕antam醫(yī)學(xué)詞典》(Bantam Medical Dictionary),第三版，302，200。腦膜炎球菌性腦膜炎是由腦膜炎奈瑟氏球菌(腦膜炎球菌)引起的，這是一種革蘭氏陰性、有莢膜的細(xì)菌，被分成幾個病原血清組，包括么、8、(、0、1-135、乂、￥、2和29￡。腦膜炎奈瑟氏球菌的血清組B菌株是全世界腦膜炎球菌性疾病的主要原因。例如醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中報道，在美國和歐洲，嬰兒和兒童的細(xì)菌性腦膜炎約50%是由血清組b引起的。目前還沒有預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌血清組b引起的腦膜炎球菌性疾病的疫苗。自從Goldschneider等的工作以來,30多年前,開發(fā)預(yù)防血清組B腦膜炎球菌性疾病的免疫原性組合物對于研究人員是一種挑戰(zhàn)。Goldschneider等，1969，J. Exp. Med129 (6) : 1307-26 ；Goldschneider 等，1969，J. Exp. Med 129 (6) : 1327-48 ；Gotschlich 等，1969，J. Exp. Med. 129(6) :1385-95 ;和 Gotschlich 等，1969，J. Exp. Med. 129 (6) : 1367-84。與血清組A疾病不同，二戰(zhàn)后，這種疾病在北美洲實際上已經(jīng)消失，Achtman, M.，1995，Trends in Microbiology3 (5) : 186-92,由血清組B和C生物引起的疾病在很多經(jīng)濟發(fā)達(dá)國家仍舊是一種地方病。疾病的發(fā)病率〈1/100，000，而在流行時，高危人群中地方病的發(fā)病率200/100, 000是罕見的。已經(jīng)開發(fā)了抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A和C的基于多糖結(jié)合物的疫苗，這種疫苗似乎有效預(yù)防疾病。目前已經(jīng)有用血清組A、C、Y和W-135莢膜多糖制造的免疫原性組合物。Ambrosch等，1983，“一種新型四價的免疫原性和副作用”，Bulletin of the WorldHealth Organization 61 (2) : 317-23。然而,這種免疫原性組合物引發(fā)一種不依賴T-細(xì)胞的免疫應(yīng)答，這在兒童中無效，且不能對付造成50%以上腦膜炎球菌性疾病的血清組B菌株。
其它人也試圖用莢膜多糖開發(fā)免疫原性組合物。最近，將血清組C莢膜物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合制成的血清組C疾病的免疫原性組合物在歐洲已被許可使用。然而，血清組B莢膜不適合作為疫苗候選物，因為這種莢膜多糖是由聚唾液酸構(gòu)成的，它與發(fā)育中的人神經(jīng)組織上的碳水化合物部分類似。這種糖部分被識別為自身抗原，因此對人的免疫原性弱。外膜蛋白(OMP)被開發(fā)作為血清組B疾病疫苗抗原的替代品。與PorA兩個可變區(qū)結(jié)合的單克隆抗體確定了腦膜炎球菌的血清亞分類方案。PorA蛋白因此作為腦膜炎球菌菌株的血清亞分類抗原(Abdillahi 等，1988, Microbial Pathogenesis4(I) :27—32),并被作為血清組B免疫原性組合物的組分而被廣泛研究(Poolman, 1996, Adv. Exp. Med.Biol. 397:73-7),因為它們可引發(fā)殺菌抗體(Saukkonen, 1987, Microbial Pathogenesis3(4) :261-7)。殺菌抗體被認(rèn)為是保護(hù)作用的指示劑，任何新的免疫原性組合物候選物都應(yīng)該能夠引發(fā)這些功能性抗體。人和動物研究表明，血清亞分類抗原PorA引發(fā)殺菌抗體。然而，對Por A的免疫應(yīng)答通常是血清亞型特異的。特別地，血清亞分類數(shù)據(jù)表明，由PorA制得的免疫原性組合物需要各個血清亞型的PorA都被這樣一種免疫原性組合物覆蓋，可能多達(dá)6-9個。因此，將需要6-9個PorA來覆蓋70-80%血清組B菌株。因此，這種蛋白質(zhì)的可變特性需要一種多價疫苗組合物來抵抗足量的腦膜炎球菌血清亞型臨床隔離群。開發(fā)血清組B腦膜炎球菌的免疫原性組合物非常困難，最近，一些研究小組測序了代表血清組A和B菌株的基因組以幫助鑒定新型免疫原性組合物的候選物。Tettelin，2000, Science, 287 (5459) :1809-15 ;Pizza 等，2000，Science 287:1816-1820。即便了解了奈瑟氏球菌的基因組，鑒定新型免疫原性組合物候選物也是一種挑戰(zhàn)過程，因為現(xiàn)在還沒有合適的數(shù)學(xué)算法。實際上，一項最近的報道聲稱，盡管已經(jīng)鑒定了數(shù)百個包含理論跨膜區(qū)的開放閱讀框(“ORFs”)，與表達(dá)、純化、誘導(dǎo)表面反應(yīng)和功能活性抗體有關(guān)的問題使研究者只發(fā)現(xiàn)了七種血清組B腦膜炎球菌性免疫原性組合物的候選物。參見同前。其中一種已知。因此，需要一種免疫原性組合物，這種組合物可以(I)引發(fā)多種奈瑟氏球菌菌株的殺菌抗體；(2)與多個菌株的表面反應(yīng)；(3)賦予抗生物攻擊(live challenge)的被動保護(hù)；和/或⑷防止集落形成。

發(fā)明內(nèi)容
為滿足這些要求和其它要求，本發(fā)明提供了奈瑟氏球菌0RF2086蛋白(“2086蛋白，，)，包括2086亞科A蛋白和2086亞科B蛋白。各個2086蛋白都是可以分離自天然奈瑟氏球菌菌株的蛋白，包括腦膜炎奈瑟氏球菌(血清組么、8、(、0、1-135、乂、￥、2和29E)，淋病奈瑟氏球菌和乳糖奈瑟氏球菌菌株。2086蛋白也可用重組技術(shù)制備。特別地，本發(fā)明提供了 2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物學(xué)等價物，與上述任一免疫特異性結(jié)合的抗體，以及包含編碼上述任一的核酸序列的多核苷酸。本發(fā)明包括組合物、免疫原性組合物及其在預(yù)防、治療和/或診斷腦膜炎球菌感染，尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌引起的腦膜炎球菌性疾病中的應(yīng)用，以及制備所述組合物的方法。這里所述2086蛋白包括重組形式和分離自天然來源的形式以及脂質(zhì)化和非脂質(zhì)化的形式。
本發(fā)明意外地且有利地提供了組合物，所述組合物(I)引發(fā)多種奈瑟氏球菌菌株的殺菌抗體，所述菌株如腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌和/或乳糖奈瑟氏球菌菌株；
(2)與多個菌株的表面反應(yīng)；(3)賦予抗生物攻擊的被動保護(hù)；和/或⑷防止集落形成，以及使用所述組合物的方法和制備所述組合物的方法。下面描述了本發(fā)明的各種實施方案。


圖Ia描述了 SDS-PAGE凝膠，它描述了實驗獲得的蛋白質(zhì)組分的兩種主要蛋白，該實驗是為了鑒定奈瑟氏菌的膜蛋白提取物能夠引發(fā)抗異源菌株的殺菌抗體。圖IB描述了通過蛋白酶消化和反相N-末端測序分析TMAE流過組分鑒定兩種主要蛋白的實驗結(jié)果。圖2描述了純化方案和用SDS-PAGE確定rLP2086的均一性。圖3描述了通過LC-MS/MS和相應(yīng)的SDS-PAGE分析TMAE流過組分鑒定兩種主要蛋白和一種次要蛋白的實驗結(jié)果。圖4是2086蛋白重組表達(dá)的SDS-PAGE凝膠。圖5是質(zhì)粒pPX7340的示意圖，如這里的實施例所述。圖6是質(zhì)粒pPX7328的示意圖，如這里的實施例所述。圖7是質(zhì)粒pPX7343示意圖，如這里的實施例所述。圖8描述了各種菌株2086基因的N-末端區(qū)域。圖9A是鑒定奈瑟氏球菌菌株中免疫原性組分最初步驟的流程圖。圖9B是鑒定奈瑟氏球菌菌株中免疫原性組分最終步驟的流程圖。圖IOA是pBAD阿拉伯糖可誘導(dǎo)啟動子的示意圖，它驅(qū)動P4信號/0RF2086融合蛋白的表達(dá)以表達(dá)rP2086的脂質(zhì)化形式，如這里的實施例所述。圖IOB是用于重組表達(dá)0RF2086的非脂質(zhì)化形式的pET9a_I7載體的示意圖。圖IlA是代表表達(dá)rLP2086蛋白的大腸桿菌B全細(xì)胞裂解物的照片。圖IlB是代表表達(dá)rP2086蛋白的大腸桿菌B全細(xì)胞裂解物的照片。圖12是顯示0RF2086蛋白亞科和類別的結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)樹。圖13是rLP2086亞科A抗血清的全細(xì)胞ELISA數(shù)據(jù)的圖示。圖14是rLP2086亞科B抗血清的全細(xì)胞ELISA數(shù)據(jù)的圖示。。圖15是rLP2086混合研究(mixing study)-WCE效價結(jié)果的圖不。圖16是rLP2086/rPorA混合研究-WCE效價結(jié)果的圖示。圖17是顯示rLP2086鼠抗血清對P2086亞科B腦膜炎奈瑟氏球菌全細(xì)胞裂解物反應(yīng)性的Western印跡。圖18是顯示rLP2086鼠抗血清對P2086亞科A腦膜炎奈瑟氏球菌和乳糖奈瑟氏球菌全細(xì)胞裂解物反應(yīng)性的Western印跡。序列概沭用于研究的序列的SEQ ID N0S.:SEQ ID NO: I當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:2用天然前導(dǎo)序列制備的L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:3當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列 SEQ ID N0:4用P4前導(dǎo)序列制備的L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:5編碼L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:6L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:7當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:8用天然前導(dǎo)序列制備的CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:9當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 10用P4前導(dǎo)序列制備的CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 11編碼CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 12CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼⑶C1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 14用天然前導(dǎo)序列制備的⑶C1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 15當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼⑶C1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 16用P4前導(dǎo)序列制備的⑶C1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 17編碼CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 18CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 19當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:20用天然前導(dǎo)序列制備的L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:21當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:22用P4前導(dǎo)序列制備的L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:23編碼L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:24L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID N0:25當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:26用天然前導(dǎo)序列制備的B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:27當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:28用P4前導(dǎo)序列制備的B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:29編碼B16B6菌株的成 熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:30B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 31當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼W135 (ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 32用天然前導(dǎo)序列制備的W135 (ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列。SEQ ID N0:33當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID N0:34用P4前導(dǎo)序列制備的W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨
基酸序列。SEQ ID NO: 35編碼W135 (ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:36W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 37當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:38用天然前導(dǎo)序列制備的Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:39當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:40用P4前導(dǎo)序列制備的Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:41編碼Cll菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:42C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:43當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:44用天然前導(dǎo)序列制備的Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基
酸序列。SEQ ID N0:45當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:46用P4前導(dǎo)序列制備的Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基
酸序列。SEQ ID N0:47編碼Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:48Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:49當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:50用天然前導(dǎo)序列制備的M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:51當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250732菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列SEQ ID N0:52用P4前導(dǎo)序列制備的M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 53編碼M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。 SEQ ID N0:54M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 55當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250771菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:56用天然前導(dǎo)序列制備的M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵:57當(dāng)與？4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼1198250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:58用P4前導(dǎo)序列制備的M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 59編碼M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:60M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:61當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼⑶C1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:62用天然前導(dǎo)序列制備的CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:63當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼⑶C1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID N0:64用P4前導(dǎo)序列制備的⑶C1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:65編碼CDCl 135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:66CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:67當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252153菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:68用天然前導(dǎo)序列制備的M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:69當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252153菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列SEQ ID N0:70用P4前導(dǎo)序列制備的M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:71編碼M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:72M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 73當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 74用天然前導(dǎo)序列制備的⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:75當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨
基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:76用P4前導(dǎo)序列制備的⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:77編碼⑶C1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID N0:78CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 79當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:80用天然前導(dǎo)序列制備的⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:81當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:82用P4前導(dǎo)序列制備的⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:83編碼⑶C1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID N0:84CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:85當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:86用天然前導(dǎo)序列制備的L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:87當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:88用P4前導(dǎo)序列制備的L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:89編碼L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:90L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:91當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:92用天然前導(dǎo)序列制備的M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:93當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252988菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:94用P4前導(dǎo)序列制備的M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:95編碼M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:96M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID N0:97當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252697菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:98用天然前導(dǎo)序列制備的M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:99當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252697菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 100用P4前導(dǎo)序列制備的M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸
序列。 SEQ ID NO: 101編碼M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 102M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 103當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 104用天然前導(dǎo)序列制備的6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 105當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 106用P4前導(dǎo)序列制備的6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 107編碼6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 1086557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 109當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:110用天然前導(dǎo)序列制備的2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 111當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 112用P4前導(dǎo)序列制備的2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 113編碼2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 1142996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 115當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 116用天然前導(dǎo)序列制備的M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵117當(dāng)與？4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼1197252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID勵118用？4前導(dǎo)序列制備的] 97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 119編碼M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 120M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 121當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 122用天然前導(dǎo)序列制備的M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵123當(dāng)與？4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼1197251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 124用P4前導(dǎo)序列制備的M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 125編碼M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 126M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 127當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼CDC1521菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。 SEQ ID N0:128用天然前導(dǎo)序列制備的⑶C1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 129當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 130用P4前導(dǎo)序列制備的⑶C1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 131編碼⑶C1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:132CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 133當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 134用天然前導(dǎo)序列制備的M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵135當(dāng)與？4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼1198250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 136用P4前導(dǎo)序列制備的M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 137編碼M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 138M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 139當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 140用天然前導(dǎo)序列制備的870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 141當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 142用P4前導(dǎo)序列制備的870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 143編碼870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 144870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 145當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO: 146用天然前導(dǎo)序列制備的M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID勵147當(dāng)與？4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼1197253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 148用P4前導(dǎo)序列制備的M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 149編碼M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 150M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 151當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 152用天然前導(dǎo)序列制備的M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:153當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250809菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 154用P4前導(dǎo)序列制備的M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 155編碼M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 156M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 157當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 158用天然前導(dǎo)序列制備的L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 159當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 160用P4前導(dǎo)序列制備的L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 161編碼L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 162L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 163當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 164用天然前導(dǎo)序列制備的NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:165當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 166用P4前導(dǎo)序列制備的NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 167編碼NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 168NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 169當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 170用天然前導(dǎo)序列制備的M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:171當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250572菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 172用P4前導(dǎo)序列制備的M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 173編碼M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 174M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:175 當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼 A4Sanford ;M97251836PART ;M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或1197251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ IDN0:176 用天然前導(dǎo)序列制備的 A4Sanford ;M97251836PART ；M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或1197251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ IDNO: 177 當(dāng)與 P4 前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼 A4Sanford ；M97251836PART ；M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或1197251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO: 178 用 P4 前導(dǎo)序列制備的 A4Sanford ；M97251836PART ；M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或1197251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 179 編碼 A4Sanford ;M97251836PART ;M97251957 ;M97251985 ;M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ；或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:180A4Sanford ；M97251836PART ；M97251957 ；M97251985 ；M97252060 ；M97251870 ；M97251994 ；M98250024 ；M97251905 ；M97251876 ；M97251898 ;或厘97251830 菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 181當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 182用天然前導(dǎo)序列制備的CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 183當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 184用P4前導(dǎo)序列制備的CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 185編碼CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 186CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 187當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 188用天然前導(dǎo)序列制備的M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 189當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97252097菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 190用P4前導(dǎo)序列制備的M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 191編碼M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 192M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 193當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 194用天然前導(dǎo)序列制備的870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序 列。SEQ ID NO: 195當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼870227菌株的成熟2086蛋白的氨
基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 196用P4前導(dǎo)序列制備的870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 197編碼870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 198870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 199當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 200用天然前導(dǎo)序列制備的H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:201當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:202用P4前導(dǎo)序列制備的H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:203編碼H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:204H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 205當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:206用天然前導(dǎo)序列制備的H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 207用P4前導(dǎo)序列制備的H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:208編碼H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:209當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:210H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 211當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:212用天然前導(dǎo)序列制備的8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:213當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID N0:214用P4前導(dǎo)序列制備的8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:215編碼8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:2168529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 217當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 218用天然前導(dǎo)序列制備的6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:219當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼6940菌株的成熟2086蛋白的氨基 酸序列的核酸序列SEQ ID NO:220用P4前導(dǎo)序列制備的6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:221編碼6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ IDN0:2226940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 223當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO: 224用天然前導(dǎo)序列制備的M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:225當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:226用P4前導(dǎo)序列制備的M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 227編碼M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:228M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 229當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:230用天然前導(dǎo)序列制備的880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:231當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:232用P4前導(dǎo)序列制備的880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:233編碼880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID N0:234880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:235當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQ ID NO:236 用天然前導(dǎo)序列制備的 M97253524、M97251885 和 M97251926 菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:237 當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:238 用 P4 前導(dǎo)序列制備的 M97253524、M97251885 和 M97251926 菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:239 編碼 M97253524、M97251885 和 M97251926 菌株的成熟 2086 蛋白
的氨基酸序列的核酸序列。
SEQID NO:240M97253524、M97251885 和 M97251926 菌株的成熟 2086 蛋白的氨基
酸序列。
SEQID NO:241當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID N0:242用天然前導(dǎo)序列制備的M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID勵:243當(dāng)與？4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼1198250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID NO:244用P4前導(dǎo)序列制備的M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID N0:245編碼M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID N0:246M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID NO:247當(dāng)與天然前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼CDC1573菌株的成熟2086蛋白的
氨基酸序列的核酸序列。SEQID NO: 248用天然前導(dǎo)序列制備的CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID NO: 249當(dāng)與P4前導(dǎo)序列結(jié)合時，編碼CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID NO:250用P4前導(dǎo)序列制備的CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID N0:251編碼CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。SEQID N0:252CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。SEQID NO:253編碼乳酰胺奈瑟氏球菌菌株的2086蛋白的氨基酸序列的部分核酸序列。SEQID N0S:254_259與蛋白質(zhì)的2086家族的蛋白結(jié)合的氨基酸序列。SEQID NOS: 260-278與2086亞科A的蛋白結(jié)合的氨基酸序列。SEQID NOS: 279-299與2086亞科B的蛋白結(jié)合的氨基酸序列。SEQID NO:300是與本發(fā)明實施方案所述2086蛋白家族(“2086蛋白”)相應(yīng)的
氨基酸共有序列。SEQID NO: 301是與本發(fā)明實施方案所述2086蛋白亞科A相應(yīng)的氨基酸共有序列。SEQID N0:302是與本發(fā)明實施方案所述2086蛋白亞科B相應(yīng)的氨基酸共有序列。SEQID NO:303帶有BamHI限制位點的反向引物的核酸序列(化合物編號4623)。SEQID NO:304帶有NdeI限制位點的正向引物的核酸序列(化合物編號4624)。SEQID NO:305正向引物的核酸序列(化合物編號4625)。SEQID N0:306正向引物的核酸序列(化合物編號:5005)。SEQID NO:307反向引物的核酸序列(化合物編號5007)。SEQID N0:308帶有BglII限制位點的反向引物的核酸序列(化合物編號5135)。
SEQ ID N0:309帶有BamHI限制位點的正向引物的核酸序列(化合物編號5658)。SEQ ID NO:310帶有SphI限制位點的反向引物的核酸序列(化合物編號5660)。SEQ ID N0:311帶有BamHI限制位點的正向引物的核酸序列(化合物編號6385)。SEQ ID N0:312帶有BglII和NdeI限制位點的正向引物的核酸序列(化合物編號:6406)。SEQ ID N0:313正向引物的核酸序列(化合物編號:6470)。SEQ ID NO:314反向引物的核酸序列(化合物編號6472)。SEQ ID N0:315帶有BamHI限制位點的正向引物的核酸序列(化合物編號6473)。
SEQ ID N0:316帶有BglII和NdeI限制位點的正向引物的核酸序列(化合物編號:6474)。SEQ ID N0:317正向引物的核酸序列(化合物編號:6495)。SEQ ID NO:318反向引物的核酸序列(化合物編號6496)。SEQ ID N0:319帶有SphI限制位點的反向引物的核酸序列(化合物編號6543)。SEQ ID N0:320帶有BglII限制位點的反向引物的核酸序列(化合物編號6605)。SEQ ID N0:321帶有BglII和NdeI限制位點的正向引物的核酸序列(化合物編號6721)。SEQ ID N0:322P4前導(dǎo)序列的核酸序列。SEQ ID NO:323天然2086前導(dǎo)序列變體I的核酸序列。SEQ ID NO: 324天然2086前導(dǎo)序列變體2的核酸序列。SEQ ID NO:325天然2086前導(dǎo)序列變體3的核酸序列。SEQ ID NO: 326天然2086前導(dǎo)序列變體4的核酸序列。SEQ ID NO:327P4431 的氨基酸序列。SEQ ID NO:328P5163 的氨基酸序列。SEQ ID N0:329是本發(fā)明實施方案的氨基酸序列。
具體實施例方式一類新的具有抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的交叉功能殺菌活性的抗原可避免對多價PorA的需求以進(jìn)行抗感染免疫。這種抗原被意外識別并在這里被描述和要求權(quán)利。首先在腦膜炎球菌菌株的可溶性外膜蛋白(sOMP)的復(fù)雜混合物中觀察到這種抗原。通過一系列分級和蛋白質(zhì)純化步驟直到感興趣的蛋白質(zhì)混合物僅含有少數(shù)蛋白而發(fā)現(xiàn)這種抗原的殺菌活性。通過N-末端氨基酸測序和肽作圖鑒定了這種混合物中的主要蛋白質(zhì)。具有殺菌活性的感興趣的蛋白質(zhì)被鑒定為0RF2086蛋白，這是一種脂質(zhì)化蛋白質(zhì)(也被稱為LP2086)。“0RF2086蛋白”是指一種由奈瑟氏球菌屬的開放閱讀框2086 (0RF2086)編碼的蛋白質(zhì)。新的免疫原性組合物在這里是指分離自腦膜炎奈瑟氏球菌的基于奈瑟氏球菌屬0RF2086蛋白(也稱為“2086蛋白”或“0RF2086”蛋白質(zhì)，在這里可替換使用，或P2086 (指非脂質(zhì)化蛋白)和LP2086(指蛋白的脂質(zhì)化形式))的候選物，它通過合并細(xì)胞分級分離，不同洗滌劑提取、蛋白質(zhì)純化，以及制備抗血清并用多種菌株進(jìn)行殺菌活性測定而鑒定。作為潛在的免疫原性組合物和上述參考資料中所述診斷方法的替代品，本發(fā)明涉及組合物以及通過使用蛋白質(zhì)、其免疫原性部分和其生物學(xué)等價物，及編碼所述多肽、蛋白質(zhì)和等價物的基因以及與其免疫特異性結(jié)合的抗體治療和/或預(yù)防腦膜炎球菌感染的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，基于上述試劑顯示的交叉反應(yīng)性或非菌株特異性，包括分離的多肽、其免疫原性部分和/或其生物學(xué)等價物的基于2086蛋白的免疫原性試劑被意外確定為免疫原性候選物。特別地，所述候選物出乎意料地被鑒定出具有以下能力(I)引發(fā)多種奈瑟氏球菌和/或淋球菌菌株的殺菌抗體；(2)與多個菌株的表面反應(yīng)；(3)賦予抗生物攻擊的被動保護(hù)；和/或(4)防止集落形成。因此，本發(fā)明提供了包含所述免疫原性試劑的免疫原性組合物，包括分離的多肽、其免疫原性部分和/或其生物學(xué)等價物，以及使用它們抵抗腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法。(參見這里的實施例I用于鑒定2086蛋白的方法。)術(shù)語“非菌株特異”在這里指抗原引發(fā)抗一種以上腦膜炎奈瑟氏球菌菌株(例如異源腦膜炎球菌菌株)的免疫應(yīng)答效應(yīng)的特性。術(shù)語“交叉反應(yīng)”在這里可與術(shù)語“非菌株特異”互換使用。術(shù)語“免疫原性非菌株特異性腦膜炎奈瑟氏球菌抗原”在這里描述可分離 自腦膜炎奈瑟氏球菌的抗原，盡管它也可分離自其它細(xì)菌(例如其它奈瑟氏球菌菌株，如淋球菌菌株)，或用重組技術(shù)制備。本發(fā)明的2086蛋白包括脂質(zhì)化和非脂質(zhì)化的蛋白。此外，本發(fā)明還試圖將與各個蛋白質(zhì)相應(yīng)的不成熟蛋白或前蛋白用作中間化合物/組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施，本發(fā)明還提供了與上述免疫原性試劑免疫特異結(jié)合的抗體。此外，本發(fā)明涉及包含編碼上述任一的核酸序列的分離的多核苷酸。因此，本發(fā)明提供了組合物和/或免疫原性組合物以及它們在預(yù)防、治療和/或診斷腦膜炎球菌性腦膜炎，尤其是血清組B腦膜炎球菌性疾病中的應(yīng)用，以及制備所述組合物的方法。本發(fā)明的組合物具有高免疫原性并能夠引發(fā)殺菌抗體的產(chǎn)生。這些抗體與異源血清組、血清型和血清亞型的腦膜炎球菌菌株交叉反應(yīng)。因此，本發(fā)明的組合物克服了以前腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗的不足，它具有對異源奈瑟氏球菌菌株引發(fā)殺菌抗體的能力。因此，本發(fā)明提供了可與較少組分結(jié)合而產(chǎn)生保護(hù)作用的免疫原性組合物，這種保護(hù)作用可與先前使用的試劑相比，這是本發(fā)明的其它優(yōu)點。所述組合物或免疫原性試劑(例如多肽、免疫原性部分或片段和生物學(xué)等價物等，但不限于此)可單獨使用或與其它抗原或試劑一起使用以引發(fā)對腦膜炎球菌感染和疾病的免疫保護(hù)，以及引發(fā)對其它病原體引起的感染和/或疾病的免疫保護(hù)。由于減少了抗多種菌株所需的抗原的數(shù)量，這樣就簡化了用來抗腦膜炎球菌感染的免疫原性組合物的設(shè)計。實際上，純化的2086蛋白將顯著地并出乎意料地減少提供足夠的引起腦膜炎球菌性疾病的菌株的免疫原性所需的蛋白數(shù)量。所述2086蛋白可在大腸桿菌中作為脂蛋白重組表達(dá)，這是蛋白質(zhì)的野生形式，其表達(dá)水平遠(yuǎn)高于天然腦膜炎球菌。由于發(fā)現(xiàn)來自一種菌株的抗2086蛋白的抗體可殺死不相關(guān)的(即異源的)菌株，我們試圖表征大量異源菌株以確定存在“2086同源物”，并確定序列保守的水平。盡管用PCR測得約70%的菌株具有2086同源物，這種同源物可用擴增起始2086基因的引物從菌株8529擴增，但其余約30%對這種測試呈陰性。余下的約30%被發(fā)現(xiàn)含有與來自2086基因的起始8529僅有約60%氨基酸序列同源性的2086同源物。其它引物被確定可從這些約30%的菌株擴增2086同源物。所測腦膜炎奈瑟氏球菌菌株屬于亞科A或亞科B，這取決于可擴增2086同源物的引物。這些實驗的細(xì)節(jié)描述在下面的實施例5中。2086蛋白在各種血清亞型中的存在情況為確定腦膜炎奈瑟氏球菌菌株之間2086基因的序列保守水平，克隆了亞科A和B的一些代表的全長基因并進(jìn)行了 DNA序列分析。用這里所述的引物，例如參見表IV，鑒定了 24種表達(dá)不同血清亞型抗原且也表達(dá)共享蛋白P2086的血清組B腦膜炎球菌菌株。這些序列的例子在這里提供并作為成熟DNA序列顯示(即在半胱氨酸殘基切除所有脂蛋白信號序列)。例如參見偶數(shù)編號的SEQ ID N0S:2-252的氨基酸序列，但不限于此。由于2086蛋白不大量出現(xiàn)在野生型菌株中，它是殺菌抗體的靶。這些抗體不同于響應(yīng)PorA產(chǎn)生的抗體,能夠殺死表達(dá)異源血清亞型的菌株。2086蛋白的抗體還可被動保護(hù)幼鼠免遭腦膜炎球菌攻擊(見表VII)。2086蛋白的重組表達(dá)使得可用2086蛋白作為免疫原性組合物以預(yù)防腦膜炎球菌性疾病。臨床實驗中所有新近的腦膜炎球菌性免疫原性組合物的候選物都是含有許多不同蛋白的復(fù)雜混合物或外膜蛋白制品。提供血清亞型特異性的PorA蛋白質(zhì)需要一種免疫原性組合物中含有 6-9種變異體以覆蓋約70-80%疾病相關(guān)的血清亞型。相反，這里清楚證明，一種2086蛋白的抗血清能夠殺死6種血清亞型的代表，在西歐和美國它們引起約65%的疾病隔離群。因此，純化的2086蛋白具有減少提供足夠覆蓋引起腦膜炎球菌性疾病的血清亞型的免疫原性組合物所需的蛋白數(shù)量的潛力。蛋白質(zhì)、免疫原性蛋白和生物學(xué)等價物本發(fā)明提供的2086蛋白是分離的蛋白質(zhì)。術(shù)語“分離的”是指用人手從天然狀態(tài)改變。如果“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界存在，則它已經(jīng)被改變或從其原始環(huán)境除去，或者兩者同時發(fā)生。例如天然出現(xiàn)在活動物中的多肽或多核苷酸不是“分離的”，但相同的分離自其天然狀態(tài)共存物質(zhì)的相同多肽或多核苷酸是“分離的”，如這里所用的術(shù)語。因此，術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”在這里包括分離自天然來源的蛋白和用重組技術(shù)制備的蛋白，以及與其它抗原和/或添加劑組合的蛋白，添加劑如藥學(xué)上可接受的載體、緩沖劑、佐劑等。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物學(xué)等價物包含以下任何氨基酸序列ADIGxGLADA (SEQ ID NO:254)，其中，x 是任何氨基酸； IGxGLADALT (SEQ ID NO: 255)，其中，x 是任何氨基酸；SLNTGKLKND(SEQ ID NO:256)；SLNTGKLKNDKxSRFDF(SEQ ID NO:257，其中，x 是任何氨基酸);SGEFQxYKQ (SEQ ID NO: 258)，其中，x 是任何氨基酸；或IEHLKxPE (SEQ ID NO: 259)，其中，x 是任何氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，2086亞科A蛋白質(zhì)，其免疫原性部分和/或其生物學(xué)等價物包含以下任何氨基酸序列GGGVAADIGx (SEQ ID NO:260)，其中，x 是任何氨基酸；SGEFQIYKQ(SEQ ID NO:261)；HSAWALQIE(SEQ ID NO:262)；EKINNPDKID(SEQ ID NO:263)；SLINQRSFLV(SEQ ID NO:264)；
SGLGGEHTAF(SEQ ID NO :265)；GEHTAFNQLP(SEQ ID NO :266)；SFLVSGLGGEH(SEQ ID NO :267)；EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLP(SEQ ID NO :268)；GKAEYHGKAF(SEQ ID NO :269)；YHGKAFSSDD(SEQ ID NO :270)； GKAEYHGKAFSSDD(SEQ ID NO:271)；IEHLKTPEQN(SEQ ID NO :272)；KTPEQNVELA(SEQ ID NO :273)；IEHLKTPEQNVELA(SEQ ID NO :274)；AELKADEKSH(SEQ ID NO :275)；AVILGDTRYG(SEQ ID NO:276)；AELKADEKSHAVILGDTRYG (SEQ ID NO:277);或EEKGTYHLAL(SEQ ID NO:278)。2086亞科B蛋白質(zhì)、其免疫原性部分和/或其生物學(xué)等價物，包含以下任何如本發(fā)明實施方案所述的氨基酸序列LITLESGEFQ(SEQ ID NO:279)；SALTALQTEQ(SEQ ID NO :280)；FQVYKQSHSA(SEQ ID NO:281)；LITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQ(SEQ ID NO:282)；I⑶IAGEHTS(SEQ ID NO :283)；EHTSFDKLPK(SEQ ID NO :284)；I⑶IAGEHTSFDKLPK(SEQ ID NO :285)；ATYRGTAFGS(SEQ ID NO :286)；DDAGGKLTYT(SEQ ID NO :287)；IDFAAKQGHG(SEQ ID NO :288)；KIEHLKSPEL(SEQ ID NO :289)；ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV(SEQ ID NO:290)；HAVISGSVLY(SEQ ID NO:291)；KGSYSLGIFG(SEQ ID NO :292)；VLYNQDEKGS(SEQ ID NO :293)；HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG(SEQ ID NO :294)；AQEVAGSAEV(SEQ ID NO :295)；IHHIGLAAKQ(SEQ ID NO :296)；VETANGIHHI(SEQ ID NO :297)；AQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO :298);或VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO:299)。所述2086蛋白包括以下如本發(fā)明實施方案所述的共有序列和/或其免疫原性部分。
2086 蛋白共有序列(SEQ ID NO:300):CSSG-----GGGVxADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGA EKTxxx⑶SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGxxITLxSGEFQxYKQxHSAxxALQxExxxxxxxxxxxxxxRxFxxxxxxGEHTxFxxLPxx-xAxYxGxAFxSDDxxGxLxYxIDFxxKQGxGxIEHLKxPExNVxLAxxxxKxDEKxHAVIxGxxxYxxxEKGxYxLxxxGxxAQExAGxAxVxxxxxxHxIxxAxKQ在上述共有序列中，“x”表示任何氨基酸，氨基酸位置5-9的區(qū)域是任何0-5個氨基酸，氨基酸位置67-69的區(qū)域是任何0-3個氨基酸，同時氨基酸位置156是任何0_1個氨基酸。氨基酸位置5-9的區(qū)域優(yōu)選包含0、4或5個氨基酸。氨基酸位置67-69的區(qū)域優(yōu)選包含0或3個氨基酸。特別值得一提的是，這種共有序列說明了 2086蛋白的高變異性。根據(jù)理論，但不局限于此，這種高變異性被認(rèn)為提供了有利且未預(yù)料的交叉反應(yīng)性。 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述2086蛋白以免疫原性、非病原的和非菌株特異為特征。此外，根據(jù)本發(fā)明再一個實施方案，這些蛋白意外地具有免疫原性，盡管約2%-約40%是非保守的。術(shù)語“非保守的”在這里指可以發(fā)生插入、取代和/或缺失的氨基酸數(shù)目占蛋白質(zhì)中總氨基酸數(shù)目的百分比。例如，如果蛋白質(zhì)有40%是非保守的并有例如263個氨基酸，則蛋白質(zhì)中有105個氨基酸位置上的氨基酸可以發(fā)生取代。同樣，如果蛋白質(zhì)有10%是非保守的并有例如約280個氨基酸，則有28個氨基酸位置上的氨基酸可發(fā)生取代。所述2086蛋白不包含蛋白質(zhì)免疫原性的氨基酸殘基也可發(fā)生缺失。此外，可基于不同區(qū)域的同源性將所述2086蛋白分成亞科。例如，下面提供了共有序列的兩個亞科，亞科A和亞科B，但不局限于此2086 亞科 A 序列(SEQ ID 301)CSSG——GGGVAADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGAEKTxxx⑶SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGQxITLxSGEFQIYKQxHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPxGKAEYHGKAFSSDDxxGxLxYxIDFxxKQGxGxIEHLKTPEQNVELAxAELKADEKSHAVILGDTRYGxEEKGTYHLALx⑶RAQEIAGxATVKIxEKVHEIxIAxKQ“x”是任何氨基酸。氨基酸位置5-8的區(qū)域是任何0-4個氨基酸。氨基酸位置66-68的區(qū)域是任何0_3個氨基酸。氨基酸位置5-8的區(qū)域優(yōu)選包含0或4個氨基酸。氨基酸位置66-68的區(qū)域優(yōu)選包含0或3個氨基酸。2086 亞科 B (SEQ ID 302)CSSGGGG-----VxADIGxGLADALTAPLDHKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGxLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQxQDxExSxKMVAKRxFxI⑶IAGEHTSFDKLPKxxxATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVxLAxxYIKPDEKxHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGxxAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ“x”是任何氨基酸。氨基酸位置8-12的區(qū)域是任何0-5個氨基酸。
氨基酸位置8-12的區(qū)域優(yōu)選包含0或5個氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，2086蛋白亞科可再分成簇(cluster)。例如根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了以下以下簇偶數(shù)編號的SEQ ID N0S:2-12 ;偶數(shù)編號的SEQ IDN0S: 14-24 ;偶數(shù)編號的SEQ ID N0S: 26-42 ;偶數(shù)編號的SEQ ID N0S: 50-60 ;偶數(shù)編號的SEQ ID N0S:62-108 ;偶數(shù)編號的 SEQ ID N0S: 110-138 ;偶數(shù)編號的 SEQ ID N0S: 140-156 ；偶數(shù)編號的SEQ ID N0S: 158-174和偶數(shù)編號的SEQ ID N0S:224-252 本發(fā)明的多肽序列可與偶數(shù)編號的SEQ ID NOS:2-252的參考序列相同，S卩100%相同，或與參考序列相比有一定數(shù)目的氨基酸改變，即同一 性百分比小于100%。這種改變包括至少一種氨基酸缺失、取代(包括保守性和非保守性取代)或插入。這種改變可發(fā)生在參考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或那些末端位置之間的任何地方，分散在參考氨基酸序列的各個氨基酸中間或在參考氨基酸序列內(nèi)的一個或多個毗連基團中。因此，本發(fā)明還提供了含有與序列表中所含氨基酸序列(即偶數(shù)編號的SEQ IDNOS:2-252)相同序列的蛋白質(zhì)。根據(jù)特定的序列，序列的同一性程度優(yōu)選大于60%(例如60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99. 9%或更高)。這些同源蛋白包括突變體和等位基因變異體。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述2086蛋白或其它2086多肽(例如免疫學(xué)部分或生物學(xué)等價物)產(chǎn)生對同源和至少一種異源腦膜炎球菌菌株的殺菌抗體。特別地，2086多肽的抗體被動保護(hù)幼鼠免遭腦膜炎球菌的侵襲，例如鼻內(nèi)的。在更加優(yōu)選的實施方案中，所述2086多肽可使幼鼠抵抗同源菌株和至少一種異源菌株。所述多肽可選自上述序列，如偶數(shù)編號的SEQ ID N0S:2-252，或者所述多肽可以是所列多肽的任何免疫學(xué)片段或生物學(xué)等價物。優(yōu)選地，所述多肽選自上述序列中任何偶數(shù)編號的SEQ ID N0S:2-2520本發(fā)明還涉及所述2086多肽的等位基因變體或其它變異體，這是生物學(xué)等價物。合適的生物學(xué)等價物能夠(I)引發(fā)對同源菌株和至少一種異源奈瑟氏球菌菌株和/或淋球菌菌株的殺菌抗體；(2)與同源菌株和至少一種異源奈瑟氏球菌菌株和/或淋球菌菌株的表面反應(yīng)；(3)賦予抗生物攻擊的被動保護(hù)；和/或(4)防止集落形成。合適的生物學(xué)等價物與這里所述2086多肽之一(即偶數(shù)編號的SEQIDNOS :2-252)至少有約60%，優(yōu)選至少約70%，更優(yōu)選至少約75%，再優(yōu)選約80%，再優(yōu)選約85%，再優(yōu)選約90%，再優(yōu)選約95%或再優(yōu)選約98%，或再優(yōu)選約99%類似，這使得所述等價物能夠引發(fā)與本發(fā)明的2086蛋白實質(zhì)上相同的免疫原性特性。或者，所述生物學(xué)等價物與偶數(shù)編號的SEQ ID NOS:2-252中的2086蛋白之一有實質(zhì)上相同的免疫原性特性。更加本發(fā)明的一個實施方案，所述生物學(xué)等價物與偶數(shù)編號的SEQ ID NOS 2-252的有相同的免疫原性特性。通過產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的變異體和修飾物得到了生物學(xué)等價物。這些蛋白質(zhì)的變異體和修飾物是通過插入、缺失或取代一個或多個氨基酸來改變氨基酸序列而獲得的。氨基酸序列被修飾，例如通過取代以產(chǎn)生實質(zhì)上相同質(zhì)量或改進(jìn)質(zhì)量的多肽。優(yōu)選的引入變化的方法包括通過定點誘變產(chǎn)生多肽的核酸序列的預(yù)定突變。修飾和變化可發(fā)生在本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)中，這樣獲得的的分子仍具有腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性。例如，但不限于此，在未喪失免疫原性的序列中，某些氨基酸可被其它氨基酸取代(包括非保守性取代和保守性取代)。由于多肽的相互作用能力和性質(zhì)確定了多肽的生物學(xué)功能活性，多肽序列(或者，當(dāng)然，其指定的DNA編碼序列)中可發(fā)生許多氨基酸序列的取代，然而，所得多肽具有類似特性。本發(fā)明包括這里所述多肽結(jié)構(gòu)以及編碼所述多肽的核酸序列的任何變化，其中，所述多肽保持免疫原性。根據(jù)這里提供的指導(dǎo)，精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地修飾所述多肽和多核苷酸。例如某些可變區(qū)被確定可允許有取代或缺失。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述2086共有序列顯示了 2086蛋白家族的保守和非保守性區(qū)域。在作出這些變化時，可采用精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何技術(shù)。例如，但不限于此，可考慮氨基酸的親水指數(shù)。在對多肽賦予生物活性功能時，親水氨基酸指數(shù)的重要性在此領(lǐng)域中通常被理解。Kyte等，1982. J. Mol. Bio. 157:105-132?；谟H水性，也可進(jìn)行類似氨基酸的取代，尤其是生物功能等價多肽或如此產(chǎn)生的肽要用于免疫學(xué)實施方案時。美國專利4，554，101描述了多肽的最大局部平均親水性，這由其毗鄰氨基酸的親水性控制，與其免疫原性相關(guān)，即與多肽的生物學(xué)特性相關(guān)，在此將此專利并入以供參考。所述多肽的生物學(xué)等價物也可通過定點誘變制備。定點誘變是通過特定誘變指定的DNA來制備第二代多肽或來自其序列的生物功能等價多肽或肽的有用技術(shù)。這種改變可發(fā)生在需要氨基酸取代的地方。這種技術(shù)還提供制備和測試序列變異體的能力，例如結(jié)合上述一種或多種想法，在DNA中引入一個或多個核苷酸序列變化。定點誘變可通過使用特定的寡核苷酸序列產(chǎn)生突變體，所述序列編碼所需突變的DNA序列和足夠數(shù)量的毗鄰核苷酸，以提供足夠大小的引物序列和序列復(fù)雜性從而在橫貫缺失連接的兩側(cè)上形成穩(wěn)定的雙鏈體。通常，長度約為17-25個核苷酸的引物是優(yōu)選的，序列連接的兩側(cè)約有5-10個殘基被改變。通常，定點誘變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。應(yīng)該意識到的是，該技術(shù)通常采用噬菌體載體，它可以以單鏈和雙鏈形式存在。通常，這里所述的定點誘變是通過首先獲得單鏈載體而進(jìn)行的，該載體的序列中包含編碼所有或部分所選腦膜炎奈瑟氏球菌多肽序列的DNA序列。制備了帶有所需突變序列的寡核苷酸引物(例如合成的)。然后將該引物退火形成單鏈載體，并用酶如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段延伸，以完全合成帶有突變的鏈。因此形成了雜雙鏈體，其中第一條鏈編碼最初的非突變序列，第二條鏈帶有所需突變。然后用這種雜雙鏈體載體來轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇包含帶有該突變的重組載體的克隆。市售的試劑盒可提供需要的所有試劑，除但寡核苷酸引物外。所述2086多肽包括任何與具有偶數(shù)編號的SEQ ID NOS 2-252之一的氨基酸序列的2086蛋白有足夠的序列相似性和/或生物學(xué)等價的蛋白或多肽。此外，本發(fā)明的2086多肽不限于特定來源。因此，本發(fā)明提供一般檢測和從各種來源分離多肽。同樣，基于本文提供的指導(dǎo)，所述2086多肽可用重組方法制備，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，或用此領(lǐng)域已知的任何其它合成方法制備。本發(fā)明預(yù)料，將所述2086多肽切割成片段將有利于進(jìn)一步用于結(jié)構(gòu)或功能分析或用于產(chǎn)生如2086相關(guān)多肽和2086特異性抗體的試劑。這可通過用肽酶如如內(nèi)切蛋白酶glu-C(Boehringer, Indianapolis, IN)處理純化或未純化的腦膜炎奈瑟氏球菌多肽而實現(xiàn)。另一種方法是用CNBr處理，這樣可以從天然腦膜炎奈瑟氏球菌2086多肽中產(chǎn)生肽片段。也可用重組技術(shù)來產(chǎn)生2086蛋白的特定片段。
術(shù)語“變異體”在這里分別是指不同于參考多核苷酸或多肽但保留實質(zhì)特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型變異體的核苷酸序列與參考多核苷酸不同。變異體核苷酸序列的變化可以改變或不改變參考多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸變化可導(dǎo)致參考序列編碼的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短，如下所述。多肽的典型變異體的氨基酸序列不同于參考多肽。通常，差異是有限的，因此參考多肽和變異體的序列總體而言非常類似，且在許多區(qū)域是相同的(即生物學(xué)等價物)。變異體和參考多肽的氨基酸序列可以不同，這包括一種或多種任何組合的取代、添加、缺失。取代或插入的氨基酸殘基可由或不可由遺傳密碼編碼。多核苷酸或多肽的變異體可以是天然存在的如等位基因變異體，或者可以是非天然存在的變異體。非天然存在的多核苷酸和多肽的變異體可通過誘變技術(shù)或通過直接合成制備?！巴恍浴笔潜绢I(lǐng)域已知的，它是指通過序列比較確定的兩個或多個多肽序列或兩個或多個多核苷酸序列之間的關(guān)系。在此領(lǐng)域中，“同一性”還指多肽或多核苷酸序列之間序列相關(guān)的程度，這可通過在所述序列的鏈之間進(jìn)行配對而確定?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨捎靡阎姆椒ㄓ嬎悖@些方法包括但不限于以下文獻(xiàn)中描述的方法《計算分子生物學(xué)》(Computational Molecular Biology), Lesk, A. M.編，牛津大學(xué)出版社，紐約，1988 ; 《生物計算信息學(xué)和基因組計劃》(Biocomputing: Informatics and Genome Projects),Smith, D. ff.編，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993 ;《序列數(shù)據(jù)的計算機分析》(Computer Analysisof Sequence Data),第 I 部分，Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.編，Humana Press,新澤西州，1994 ;《分子生物學(xué)中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology),von Heinje, G.,學(xué)術(shù)出版社，1987 ;和《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer),Gribskov, M.和 Devereux, J.編，M Stockton Press,紐約，1991 ；和 Carillo，H.和Lipman, D.，SIAMJ. AppliedMath. ,48:1073(1988)。優(yōu)選的確定同一性的方法是要得到測試序列之間的最大匹配。確定同一性和相似性的方法被編成公眾可獲得的計算機程序。優(yōu)選的確定兩個序列之間同一性和相似性的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux, J.等，1984)、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul，S. F.等，1990)。BLASTX 程序可從NCBI 以及其它來源(BLAST手冊，Altschul, S.等，NCBI NLM NIH Bethesda,Md. 20894 ；Altschul, S.等，1990)獲得。也可用熟知的Smith Waterman算法來確定同一性。例如，但不局限于此，本發(fā)明的氨基酸序列可與參考序列一偶數(shù)編號的SEQ IDN0S: 2-252相同，即100%相同，或者與參考序列相比可包含一些氨基酸改變,這樣同一性百分比就小于100%。這種改變選自至少一種氨基酸缺失、取代(包括保守性和非保守性取代)或插入，其中，所述改變可發(fā)生在參考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或這些末端位置之間的任何地方，獨立地分散在參考序列的氨基酸中間或在參考序列內(nèi)的一個或多個毗連基團中。將SEQ ID N0S:2-252的氨基酸總數(shù)乘以各自的同一性百分比的分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將所述SEQ ID N0S:2-252中任一氨基酸總數(shù)減去該結(jié)果就可得到給定的同一性百分比的氨基酸改變的數(shù)目，或na=xa- (xa y),其中，\是氨基酸改變的數(shù)目，xa是SEQ ID NOS:2-252中的氨基酸總數(shù)，y是，例如用0. 70表示70%，0. 80表示80%，0. 85表示85%，等等，且其中任何非整數(shù)的xa-y的結(jié)果在從Xa中減去之前都被減小成最接近的整數(shù)。
在優(yōu)選的實施方案中，上述多肽選自偶數(shù)編號的SEQ ID NOS 2_252所列出的蛋白質(zhì)，如2086蛋白的成熟形式。2086蛋白或等價物等可以是脂質(zhì)化或非脂質(zhì)化的。ORF 2086可在帶有天然ORF 2086信號序列的大腸桿菌中表達(dá)。然而，需要找到改進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，前導(dǎo)序列產(chǎn)生蛋白質(zhì)的脂質(zhì)化形式。例如，下面描述了使用非典型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)P4蛋白的信號序列以提聞表達(dá)。
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細(xì)菌脂蛋白的加工以含有信號序列的前體或脂蛋白質(zhì)(prolipoprotein)的合成開始，該信號序列依次含有共有序列脂蛋白加工/修飾位點。這種脂蛋白質(zhì)最初通過常規(guī)的Sec系統(tǒng)位于革蘭氏陰性菌的內(nèi)膜或革蘭氏陽性菌的膜上。一旦通過Sec系統(tǒng)位于膜，所述脂蛋白質(zhì)就在共有序列位點被信號肽酶II切割，暴露的N-末端半胱氨酸殘基被甘油酸化(glycerated)和酸化。Hayashi 等，1990, “細(xì)菌中的脂蛋白 ”, J. Bioenerg. Biomembr.Jun ；22(3) :451-71 ;0udega等，1993，“一種小的脂蛋白一細(xì)菌素釋放蛋白的表達(dá)和膜插入所需的大腸桿菌 SecB、SecA 和 SecY 蛋白，，,J. Bacteriol. Mar ； 175 (5) : 1543-7 ；Sankaran等，1995，“細(xì)菌脂蛋白的修飾”，Methods Enzymol. 250:683-97。在革蘭氏陰性菌中，脂質(zhì)化蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到外膜是由獨特的具有膜特異性的ABC轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)介導(dǎo)的，這種特異性取決于脂蛋白位置2上的分選信號。Yakushi等，2000, “一種新的ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)從膜中分離脂質(zhì)修飾的蛋白質(zhì)”，Nat Cell Biol. Apr ；2(4) : 212-8。與細(xì)菌脂蛋白及其信號序列融合已被用于在細(xì)菌表面展示重組蛋白。美國專利號5，583，038和6，130,085。交換脂蛋白信號序列可增加脂蛋白的產(chǎn)生。De等，2000，“在大腸桿菌中表達(dá)的肺炎鏈球菌棕櫚?；姆窝浊蚓苑潜砻嬲掣剿谹的純化和鑒定”，Vaccine，Mar 6 ；18(17):1811-21。已知蛋白質(zhì)的細(xì)菌脂質(zhì)化可增加或改變對蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。Erdile等，1993，“附加的脂質(zhì)在布氏疏螺旋體OspA免疫原性中的作用”，Infect. Immun. Jan ；61 (I) :81-90 ；Snapper等，1995，“在對T細(xì)胞依賴型II抗原的體液免疫應(yīng)答中細(xì)菌脂蛋白可替代細(xì)胞因子”，J. Immunol. Dec 15 ; 155 (12) : 5582-9。然而，細(xì)菌脂蛋白的表達(dá)可因加工的嚴(yán)格而復(fù)雜化。Pollitt等，1986，“大腸桿菌主要外膜脂蛋白的信號肽切割位點氨基酸取代的效果”，J. Biol. Chem. Feb 5 ；261 (4) : 1835-7 ;Lunn等，1987，“脂蛋白質(zhì)信號肽突變對大腸桿菌中雜交體前脂-0 -內(nèi)酰胺酶分泌的作用”，J. Biol. Chem. Jun 15 ；262(17) :8318-24 ；Klein等，1988，“細(xì)菌脂蛋白信號序列的特殊性質(zhì)”，Protein Eng. Apr ;2 (I) : 15-20。細(xì)菌脂蛋白的表達(dá)也可因其它問題而復(fù)雜化，如毒性和低表達(dá)水平。Gomez等，1994，“當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時枯草芽孢桿菌脂蛋白LplA核苷酸使細(xì)胞裂解”，Microbiology. Aug ；140 (Pt 8) : 1839-45 ；Hansson等，1995，“截短和全長形式的萊姆病疏螺旋體外表面蛋白A在大腸桿菌中的表達(dá)”，Protein Expr. Purif. Feb ；6 (I) : 15-24 ；Yakushi 等，1997, “錯誤定位的主要外膜脂蛋白和大腸桿菌的肽聚糖之間共價連接的致死率”，J. Bacteriol. May ；179(9):2857-62。非可分型流感嗜血桿菌表達(dá)稱為P4的脂蛋白(也稱為蛋白質(zhì)“e”)。采用天然P4信號序列P4蛋白的重組形式在大腸桿菌中高度表達(dá)。美國專利號5，955，580。當(dāng)用天然P4信號序列取代大腸桿菌表達(dá)載體中的天然ORF 2086信號序列時，0RF2086的表達(dá)水平增加。用異源P4信號序列增加表達(dá)的概念可延伸到其它細(xì)菌脂蛋白。特別地，分析細(xì)菌基因組能夠鑒定許多可能感興趣的ORF試圖。在異源宿主細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá)各個帶有其天然信號序列的ORF將產(chǎn)生各種使用多種信號序列固有的問題，包括穩(wěn)定性、相容性等等。為使這些問題最小化，P4信號序列被用來表達(dá)各個感興趣的0RF。如上所述，P4信號序列可改進(jìn)異源20860RF的表達(dá)。通過刪除感興趣的ORF的天然信號序列并將P4信號序列連接到ORF構(gòu)建了表達(dá)載體。然后用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染合適的宿主細(xì)胞，與使用ORF的天然信號序列進(jìn)行表達(dá)相比，ORF的表達(dá)增加了。用缺少原始前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)或是用未指定宿主細(xì)胞中脂肪酸?；稽c的部分序列代替的前導(dǎo)序列產(chǎn)生了非脂質(zhì)化的形式。除非另有說明，本發(fā)明2086蛋白的各種形式在這里被稱為“2086”蛋白。同樣，除非另有說明，“2086多肽”是指2086蛋白以及上述免疫原性部分或其生物學(xué)等價物。
用10%_20%梯度SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)測得全長分離和純化的腦膜炎奈瑟氏球菌2086蛋白的表觀分子量約為28-35kDa。更具體的，用質(zhì)譜測得這種蛋白質(zhì)的分子量約為26，000-30, 000道爾頓。優(yōu)選地，所述2086多肽和編碼這種多肽的核酸被用于預(yù)防或減輕腦膜炎奈瑟氏球菌和/或其它菌種引起的感染?？贵w本發(fā)明的蛋白質(zhì)，包括氨基酸序列SEQ ID N0S:2_252，其片段及其類似物或表達(dá)它們的細(xì)胞，也被用作免疫原以產(chǎn)生對本發(fā)明的多肽免疫特異的抗體。本發(fā)明包括免疫特異性多肽的抗體以及使用所述抗體來檢測腦膜炎奈瑟氏球菌的存在情況，提供被動保護(hù)或測量細(xì)胞、細(xì)胞或組織提取物、或生物液體中多肽的量或濃度。本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體和抗獨特型抗體。多克隆抗體是來自用抗原免疫的動物血清的不同群體的抗體分子。單克隆抗體是特定抗原的大體均一群體的抗體。單克隆抗體可用精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法獲得，例如Kohler和Milstein, 1975,Nature 256:495-497和美國專利號4，376，110。這種抗體可以是任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE、IgA, GILD及其任何亞類。嵌合抗體是一種分子，其不同部分來自不同的動物種類，例如那些具有鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。嵌合抗體及其生產(chǎn)方法在本領(lǐng)域已知(Cabilly等，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81: 3273-3277 ；Morrison 等，1984, Proc. Natl. Acad.Sci. USA81:6851-6855 ;Boulianne 等，1984，Nature312:643-646 ;Cabilly 等，歐洲專利申請125023 (1984年11月14日公開)；Taniguchi等，歐洲專利申請171496 (1985年2月19日公開)；Morrison等，歐洲專利申請173494 (1986年3月5日公開)；Neuberger等，PCT申請WO 86/01533 (1986年3月13日公開)；Kudo等，歐洲專利申請184187 (1986年6月11日公開)；Morrison等，歐洲專利申請173494(1986年3月5日公開);Sahagan等，1986,J. Immunol. 137:1066-1074 ；Robinson 等，PCT/US86/02269 (1987 年 5 月 7 日公開)；Liu等，1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:3439-3443 ；Sun 等，1987, Proc. Natl. Acad. Sci.USA84:214-218 ;Better 等，1988，Science 240:1041-1043)。在此將其全文并入以供參考?？躬毺匦?抗-Id)抗體是識別通常與抗體的抗原結(jié)合位點結(jié)合的獨特決定子的抗體?？?Id抗體通過用已制備抗-Id的單克隆抗體免疫作為單克隆抗體來源的相同種類和基因型的動物(如小鼠品系)來制備。被免疫的動物將通過產(chǎn)生這些同種型決定子的抗體(抗-Id抗體)識別并響應(yīng)免疫抗體的獨特型決定子。因此，所產(chǎn)生的抗本發(fā)明多肽的單克隆抗體可用于在合適的動物中誘導(dǎo)抗-Id抗體。來自這種免疫小鼠的脾細(xì)胞可用于產(chǎn)生分泌抗-Id單克隆抗體的抗-Id雜交瘤。此外，所述抗-Id抗體可與載體 如匙孔纖 血藍(lán)蛋白(KLH)結(jié)合以及用于免疫其它BALB/c小鼠。這些小鼠的血清將含有抗-抗-Id抗體，它具有最終對R-PTP酶表位特異的mAb的結(jié)合特性。因此可評價這種抗-Id抗體的獨特型表位，或與表位結(jié)構(gòu)類似的一些“獨特型表位”，如釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogene功多肽。術(shù)語“抗體”還包括完整的分子以及片段，如能夠結(jié)合抗原的Fab片段。Fab片段缺乏完整抗體的Fe片段，能夠更迅速地從循環(huán)中清除，且與完整抗體相比有更小的非特異性組織結(jié)合(Wahl等，1983，J. Nucl.始d 24:316—325)。按照用于完整抗體分子的方法，F(xiàn)ab和用于本發(fā)明的其它抗體片段也可用來檢測和定量腦膜炎奈瑟氏球菌多肽。本發(fā)明的抗體，如抗獨特型(“抗-Id”)抗體，可用于在哺乳動物宿主中治療或預(yù)防奈瑟氏球菌屬感染的方法，包括給予免疫有效量的抗體，如上所述對多肽特異的抗體。所述抗-Id抗體也可用作“免疫原”以誘導(dǎo)另一動物中的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生所謂抗-抗-Id抗體?？?抗-Id可與誘導(dǎo)抗-Id的原始mAb有相同的表位。因此，通過使用mAb的獨特型決定子的抗體就可以鑒定表達(dá)相同特異性的抗體的其它克隆?？贵w被用于多種方法，例如用來確定蛋白質(zhì)被表達(dá)，或用來確定蛋白質(zhì)在哪里被表達(dá)。例如，可將標(biāo)記的抗體(例如FACS的熒光標(biāo)記)與完整的細(xì)菌一起培養(yǎng)，細(xì)菌表面上標(biāo)記的存在確定了蛋白質(zhì)的位置?？刹捎贸Ｒ?guī)方法將多肽或帶有表位的片段、類似物或細(xì)胞用于動物以獲得所產(chǎn)生的抗本發(fā)明多肽的抗體。為制備單克隆抗體，可使用任何技術(shù)，這些技術(shù)可提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體。多核苷酸和本發(fā)明的蛋白質(zhì)一樣，本發(fā)明的多核苷酸可包含與任何奇數(shù)編號的SEQ IDN0S: 1-253的參考序列相同，即100%同一的核酸序列，或者，與參考序列相比，它可包含許多核苷酸改變。這種改變選自至少一種核苷酸缺失、取代(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中，所述改變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或那些末端位置之間的任何地方，獨立地分散在參考序列的核苷酸中間或在參考序列的一個或多個毗連基團中。核苷酸改變的數(shù)目可將任何奇數(shù)編號的SEQ ID N0S: 1-253的核苷酸總數(shù)乘以各自的百分比同一性的數(shù)字百分比(除以100)來確定，并從所述序列中的所述核苷酸總數(shù)減去該乘積。例如，但不限于此，分離的腦膜炎奈瑟氏球菌多核苷酸包含與SEQ ID N0S: 1-253的任何核酸序列、其簡并變異體或其片段有至少70%同一性的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列在核酸序列SEQ ID N0S: 1-253的整個多核苷酸區(qū)域最多可包含nn個核酸變化，其中nn是最大變化數(shù)，它通過以下公式計算nn=xn- (xn y)，其中，Xn是SEQ ID N0S: 1-253中的核酸總數(shù)，y的值為0. 70，其中任何非整數(shù)的xn y的乘積在從xn中減去之前都被減小到最接近的整數(shù)。當(dāng)然，y也可以是0.80(表示80%) ,0. 85(表示 85%) ,0. 90(表示 90%)、0. 95 (表示 95%)等等。編碼包含 SEQ IDNOS: 2-252中任何氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的改變可在此編碼序列中產(chǎn)生無義、錯義或移碼突變，從而改變由經(jīng)過這種變化的多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明的一些實施方案涉及編碼2086蛋白和抗2086蛋白的抗體的多核苷酸(這里稱為“2086多核苷酸”或“0RF2086多核苷酸”)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸包含與選自奇數(shù)編號的SEQ ID NOil-SEQ ID N0S: 253之一的核苷酸序列有至少95%同一性的核苷酸序列，其簡并變異體或其片段?！昂啿⒆儺愺w”在這里指由于遺傳密碼的簡并而與奇數(shù)編號的SEQ ID N0S:1-SEQ ID N0S: 253 (及其片段)的核苷酸序列不同的多核苷酸，但它仍編碼與奇數(shù)編號的SEQ ID N0S: 1-253的核苷酸序列編碼的相同的2086蛋白(即偶數(shù)編號的SEQ ID NOS:2-252) o在其它實施方案中，所述多核苷酸與選自奇數(shù)編號的SEQ ID N0S: 1-253之一的核苷酸序列、其簡并變異體或其片段互補。在另一個實施方案中，所述多核苷酸選自DNA、染色體DNA、cDNA和RNA，還可包含異源核苷酸。在另一個實施方案中，分離的多核苷酸在高嚴(yán) 格雜交條件下與選自SEQ ID N0S: 1-253之一、其補體、其簡并變異體或其片段的核苷酸序列雜交。再在其它實施方案中，所述多核苷酸在中等嚴(yán)格雜交條件下發(fā)生雜交。所述2086多核苷酸可獲自天然、合成或半合成來源；此外，所述核苷酸序列可以是天然產(chǎn)生的序列，或者可以通過突變與這種天然產(chǎn)生的序列發(fā)生關(guān)系，包括單個或多個堿基取代、缺失、插入和倒位，只要所述核酸分子包含能夠作為上述2086免疫原性多肽進(jìn)行表達(dá)的序列。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈、線性或共價閉合環(huán)狀形式的RNA、DNA。所述核苷酸序列可包含位于其附近的表達(dá)控制序列，這種控制序列通常來自異源來源。通常，本發(fā)明核酸序列的重組表達(dá)將在所述核酸序列末端使用終止密碼子序列，如TAA。本發(fā)明還包括能夠在降低的嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選在嚴(yán)格條件下，最優(yōu)選在高嚴(yán)格條件下與這里所述多核苷酸雜交的多核苷酸。嚴(yán)格條件的例子顯示在下面的嚴(yán)格條件表中高嚴(yán)格條件是至少和例如條件A-F—樣嚴(yán)格的條件；嚴(yán)格條件是至少和例如條件G-L一樣嚴(yán)格的條件；降低的嚴(yán)格條件是至少和例如條件M-R —樣嚴(yán)格的條件。嚴(yán)格條件一表I
權(quán)利要求
1.一種組合物，該組合物含有至少ー種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)含有一氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO:248,250和252中任一的氨基酸序列具有大于60%的序列同一性。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述至少ー種蛋白質(zhì) (a)含有一氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQID NO: 248、250和252中任一的氨基酸序列具有大于90%的序列同一‘注；或 (b)由具有SEQID NO =247,249和251中任一的核酸序列的多核苷酸編碼。
3.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述至少ー種蛋白質(zhì)含有SEQIDNO:248,250和252中任一所示的氨基酸序列。
4.化的或非脂質(zhì)化的。
5.如權(quán)利要求I一 4中任一項所述的組合物，其特征在于，所述至少ー種蛋白質(zhì)是重組蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求I一 5中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的緩沖劑、稀釋劑、佐劑或載體。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述佐劑是氫氧化鋁或磷酸鋁。
8.如權(quán)利要求I一 7中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有其它活性免疫原。
9.如權(quán)利要求I一 7中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有其它奈瑟氏球菌屬免疫原性多肽。
10.如權(quán)利要求I一 7中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有至少ー種由奈瑟氏球菌屬開放讀框(0RF2086)編碼的蛋白質(zhì)，所述開放讀框編碼交叉反應(yīng)免疫原性抗原，且所述交叉反應(yīng)免疫原性抗原為患者提供針對腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B引起的感染的免疫原性。
11.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述由奈瑟氏球菌屬開放讀框0RF2086編碼的至少ー種蛋白質(zhì)屬于腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的亞科A。
12.如權(quán)利要求I一 11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有至少ー種PorA、PorB、運鐵結(jié)合蛋白或混池蛋白或至少ー種額外的奈瑟氏球菌屬表面抗原,所述額外的編碼抗原是非-0RF2086蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求I一 12中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有多糖。
14.一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸與SEQ ID N0:247、249和251中的任一核苷酸序列具有至少90%的同一‘注。
15.—種組合物，該組合物含有 (a)至少ー種多核苷酸，所述多核苷酸編碼至少ー種含有SEQID N0:248、250和252中的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或 (b)至少ー種多核苷酸,所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與(a)所述的任一多核苷酸雜交。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述至少ー種多核苷酸含有SEQIDNO:247,249和251中任一所示的核酸序列。
17.一種組合物，該組合物含有至少ー種抗體，所述抗體與含有SEQ ID N0:248、250和252中的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)免疫特異性結(jié)合。
18.—種載體，該載體含有具有啟動子序列和起始密碼子序列的表達(dá)控制序列以及編碼SEQ ID NO:248,250和252中的任一多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于3’至啟動子和起始密碼子序列。
19.ー種宿主細(xì)胞,該細(xì)胞含有權(quán)利要求18所述的載體。
20.一種轉(zhuǎn)化的、轉(zhuǎn)染的或感染的細(xì)胞系，含有表達(dá)ー種核酸序列的重組細(xì)胞，所述核酸序列編碼至少ー種含有SEQ ID NO:248、250和252中的任一氨基酸序列的多肽。
21.—種制備組合物的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼至少ー種蛋白質(zhì)的核酸序列，所述至少ー種蛋白質(zhì)含有SEQ ID N0:248、250和252中的任一氨基酸序列。
22.權(quán)利要求I一 17中任一項所述的組合物，用作藥物。
23.權(quán)利要求I一 17中任一項所述的組合物在制備在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或減輕或預(yù)防人中腦膜炎奈瑟氏球菌引起的感染的藥物中的用途。
全文摘要
一種預(yù)防和治療腦膜炎球菌性疾病的新型免疫原性組合物。本發(fā)明涉及奈瑟球菌屬ORF2086蛋白、交叉反應(yīng)免疫原性蛋白，可從奈瑟氏球菌屬菌株分離或用重組方法制備，包括其免疫原性部分、其生物學(xué)等價物、免疫特異性結(jié)合上述蛋白質(zhì)的抗體以及編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列，以及在有效對抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B感染的免疫原性組合物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/395GK102755631SQ201210211368
公開日2012年10月31日 申請日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月11日
發(fā)明者B·J·麥特卡爾夫, G·W·澤洛特尼克, J·法利, L·A·伯恩非爾德, L·D·弗萊切, R·J·扎古斯基 申請人:惠氏控股有限公司