包括腦膜炎球菌fHBP序列的雜交多肽的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/IB2010/002260,國際申請日為2010年8 月27日，進入中國國家階段的申請?zhí)枮?201080047951. 4"，發(fā)明名稱為"包括腦膜炎球菌 fHBP序列的雜交多肽"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請要求2009年8月27日提交的美國臨時申請?zhí)?1/237, 576的益處，其完整 內(nèi)容通過引用納入本文用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于免疫領(lǐng)域，具體地說，是針對由諸如腦膜炎奈瑟球菌 (N. meningitidis，腦膜炎球菌）的奈瑟球菌（Neisseria)屬致病性細菌導(dǎo)致的疾病的免 疫。
【背景技術(shù)】
[0004] 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)是一種革蘭氏陰性包膜細菌病原體。 雖然存在針對血清群A、C、W135和Y的多糖和偶聯(lián)疫苗，但是該方法無法應(yīng)用于血清群B， 因為莢膜多糖是一種多聚唾液酸的聚合物，是人類的一種自身抗原。為了產(chǎn)生針對血清群 B的疫苗，使用了外膜囊泡（0MV)。這些疫苗會引起血清殺菌抗體應(yīng)答和抵抗疾病，但是無 法誘導(dǎo)菌株間的交叉保護作用[1]。一些研究者因此著重于用于疫苗的特定腦膜炎球菌抗 原[2]。
[0005]-種這樣的抗原是腦膜炎球菌H因子結(jié)合蛋白（fHBP)，也稱作'741'蛋白[參考 文獻 3 中的 SEQ ID 2535 & 2536;本文的 SEQ ID 1], 'NMB1870'，'GNA1870' [參考文獻 4-6,在參考文獻2之后]，'P2086'，'LP2086'或'0RF2086'[7-9]。該脂蛋白在全部腦膜 炎球菌血清群中都表達，在許多菌株中都有發(fā)現(xiàn)。fHBP序列被分成三個家族[4](本文稱作 家族I，II & III)，對一特定家族產(chǎn)生的血清在同一家族中具有殺菌性，但對表達其它家族 之一的菌株無活性，即存在家族內(nèi)，而非家族間的交叉保護。
[0006] 因此，為了實現(xiàn)使用fHBP的交叉菌株保護，使用了多于一種家族。為了避免表達 和純化獨立蛋白的需要，已提出將不同家族表達成雜合蛋白[10-12]，在一條多肽鏈中包括 兩或三個家族。文獻13和14描述了基于誘變的修飾fHBP序列，以提高其對家族I、II和 III的覆蓋的方法。文獻15描述了經(jīng)修飾提高其家族間覆蓋的fHBP的各種其它形式。
[0007] 本發(fā)明的一個目的是提供fHBP具有的家族特異性保護的進一步和改良的方法， 和使用這些方法提供針對腦膜炎球菌病和/或感染，特別是針對B血清群的免疫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 全長fHBP在菌株MC58中具有以下氨基酸序列（SEQ ID N0:1) :MNRTAFCCLSLTTAL ILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKV SRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRA TYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIF GGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
[0009] 成熟的脂蛋白缺乏SEQ ID NO: 1的前19個氨基酸，fHBP的AG形式缺少前26個 氨基酸。
[0010] MC58序列（SEQ ID N0:1)屬于fHBP家族I。用MC58序列引發(fā)的抗體具有針對 MC58菌株的高度殺菌活性，但是對于表達家族II或III fHBP的菌株的活性低得多。在一 些實施方式中，本發(fā)明涉及修飾形式的fHBP，其中修飾作用改善了該蛋白引發(fā)家族間殺菌 抗體的能力。在其他實施方式中本發(fā)明涉及融合蛋白，其中fHBP的改良形式與第二氨基酸 序列，例如另一種腦膜炎球菌免疫原或另一種fHBP(包括修飾的fHBP)融合。
[0011] 因此，本發(fā)明提供了一種多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID N0:77或SEQ ID N0:78。 這些氨基酸序列從MC58序列與Val-27匹配的殘基開始，但包括下游位點的各種氨基酸修 飾。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種多肽，包含第一免疫原性氨基酸序列和第二免疫原性氨基酸 序列，其中第一氨基酸序列選自 SEQ ID N0 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77和78。兩種優(yōu)選的第一免疫原性氨基酸序列是3￡0 1〇勵 20和23。在一些實施方式中，第一和第二氨基酸序列可以是相同的；在其它實施方式中，它 們彼此不同。合適的第二免疫原性氨基酸序列在下文更詳細描述，包括但不限于：(a)非腦 膜炎球菌抗原；(b)腦膜炎球菌非fHBP抗原；（c)野生型腦膜炎球菌fHBP抗原；和（d)修 飾的腦膜炎球菌fHBP抗原，其可以與第一免疫原性氨基酸序列相同或不同。第一和第二序 列可以任何順序從N端到C端排列。
[0013] 因此，本發(fā)明提供了一種多肽，其所含氨基酸序列選自SEQIDN0:99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137 和 138。
[0014] 這些不同的多肽在給予宿主動物后有誘導(dǎo)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體的能力，在優(yōu) 選實施方式中可以誘導(dǎo)對三種fHBP家族I到III中每一種的菌株具有殺菌性的抗體。關(guān) 于殺菌反應(yīng)的其它信息在下文中給出。
[0015] 第二免疫原性氨基酸序列
[0016] 在一些實施方式中，本發(fā)明的多肽包括第二免疫原性氨基酸序列?？墒褂酶鞣N這 類第二序列。
[0017] 第二免疫原性氨基酸序列可以包含非腦膜炎球菌抗原。這優(yōu)選來自非腦膜炎球菌 病原體，例如細菌或病毒。例如，第二序列可以包含免疫原性肺炎球菌氨基酸序列或免疫原 性肝炎病毒氨基酸序列。
[0018] 第二免疫原性氨基酸序列除了 fHBP抗原外還可包含腦膜炎球菌抗原。例如，第二 序列可包含腦膜炎球菌抗原287、NadA、NspA、HmbR、NhhA、App、936或0mp85的序列。這些第 二序列的其它細節(jié)如下。包括這種第二免疫原性序列的多肽序列的例子是SEQ ID N0:102、 124、125、126、127、128 和 129。
[0019] 第二免疫原性氨基酸序列可包含野生型或修飾的fHBP序列。該第二氨基酸序列 在作為本發(fā)明多肽的一部分給予對象時可優(yōu)選引發(fā)抗體反應(yīng)，該反應(yīng)包括與具有氨基酸序 列SEQ ID NO: 1、2或3之一的野生型腦膜炎球菌蛋白結(jié)合的抗體。例如，第二氨基酸序列 可包含以下任一：
[0020]-選自SEQ ID N0:1、2和3的序列（野生型fHBP序列）。
[0021] -選自 SEQ ID N0 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77和78的序列（修飾的fHBP序列）。在一些實施方式中，第二免疫原性序 列與第一免疫原性序列相同。
[0022] -一條氨基酸序列，其與 SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78 任一有至少 x%序列相同性。
[0023] x 的值是至少 80,例如 82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99 或以上。
[0024] 包括這種fHBP序列作為第二免疫原性序列的多肽的例子是SEQ ID N0:99、100、 101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、130、131、132、133、134、135、136、137 和 138。
[0025] 第一和第二免疫原性氨基酸序列可直接通過肽鍵連接，例如（i)第一免疫原性氨 基酸序列的C末端氨基酸在第二免疫原性氨基酸序列N末端氨基酸直接上游，或（ii)第二 免疫原性氨基酸序列的C末端氨基酸在第一免疫原性氨基酸序列N末端氨基酸直接上游。 然而在其它實施方式中，第一和第二免疫原性氨基酸序列由接頭氨基酸序列分隔，但仍然 形成一條翻譯的多肽鏈。這種接頭氨基酸序列-L-一般較短（如20個或更少的氨基酸，即 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽 序列，聚-甘氨酸接頭（即包含Glyn，其中n = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高），組氨酸標(biāo)簽 (即Hisn，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高，例如SEQ ID N0:95).本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然 了解其它合適的接頭氨基酸序列。有用的接頭是GSGGGG(SEQ ID N0:81)或GSGSGGGG(SEQ ID NO :12)，Gly-Ser二肽由BamHI限制位點形成，因而有助于克隆和操作，（617)4四肽是常 用的多聚甘氨酸接頭。其它合適的接頭是ASGGGS(SEQ ID N0:93,例如由SEQ ID N0:94編 碼）或 Leu-Glu 二肽。
[0026] 可存在一種以上這樣的第二序列，從而在多肽中提供第三、第四、第五等免疫原性 序列。這些多肽包括那些含第一免疫原性氨基酸序列、第二免疫原性氨基酸序列和第三免 疫原性氨基酸序列的多肽，其中：第一和第二氨基酸序列如上定義；第三氨基酸序列選自 SEQ ID N0 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78。第一和第三序列可以彼此相同或不同；第二序列可以與第一或第三序列相同，或與它們 都不相同。包括第一、第二和第三序列的多肽的例子是SEQ ID N0:99、100、101、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126 和 127。
[0027] 一組有用的多肽包含（i)獨立選自 SEQ ID N0 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的兩條氨基酸序列，和（11)一種腦膜炎球 菌非fHBP抗原。這些多肽的例子包括SEQ ID NO: 124、125、126、127、140、141和142。部分 (i)的兩條氨基酸序列可以相同或不同。非fHBP抗原可以在部分⑴的兩條氨基酸序列， 部分（i)的兩條氨基酸序列的C末端，或部分（i)的兩條氨基酸序列的N末端之間。
[0028] 非一 fHBP腦膜炎球菌抗原
[0029] 本發(fā)明的組合物可包含287抗原。287抗原作為基因NMB2132包括在腦膜炎球菌B 血清群菌株MC58[16]的已發(fā)表基因組序列中（GenBank登錄號GI:7227388;本文的SEQ ID N0:83)。迄今已發(fā)表了來自許多菌株的287抗原序列。例如，參考文獻17的圖5和15以 及文獻18的實施例13和圖21提供了 287的等位基因形式（文中的SEQ ID 3179-3184)。 也已報道了 287抗原的各種免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選287抗原包含某氨基酸序列， 該序列：（a)與SEQ ID N0:83具有50%或更高相同性（例如60% ,65% ,70% ,75% ,80% ，85% ,90%，91 % ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99% ,99. 5%或以上）；和/或 (b)包含SEQ ID N0:83至少' n'個連續(xù)氨基酸的片段，其中' n'是7或更多（例如8, 10, 1 2, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 或更多）。（b)的優(yōu)選片 段包含來自SEQ ID N0:83的表位。本發(fā)明最有用的287抗原可在給予對象后引起抗體，其 能與氨基酸序列SEQ ID N0:83組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。本發(fā)明使用的有利287抗原 可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0030] 本發(fā)明的組合物可包含NadA抗原。NadA抗原作為基因NMB1994包括在腦膜炎球 菌B血清群菌株MC58 [16]的已發(fā)表基因組序列中（GenBank登錄號GI: 7227256;本文的 SEQ ID N0:84)。迄今已發(fā)表了來自許多菌株的NadA抗原序列，詳細描述了該蛋白作為奈 瑟菌粘附素的活性。還報導(dǎo)了 NadA的各種免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選NadA抗原包 含某氨基酸序列，該序列：（a)與SEQ ID N0:84具有50 %或更高相同性（例如60%，65%， 70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99. 5%或 以上）；和/或（b)包含SEQ ID N0:84至少'n'個連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7或更多 (例如 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 或更多）。 (b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:84的表位。本發(fā)明最有用的NadA抗原可在給予對象 后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID N0:84組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。本發(fā)明使用的 有利NadA抗原可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。SEQ ID N0 :6是這樣一個 片段。
[0031] 本發(fā)明的組合物可包含NspA抗原。NspA抗原作為基因NMB0663包括在腦膜炎球 菌B血清群菌株MC58[16]的已發(fā)表基因組序列中（GenBank登錄號GI:7225888 ;本文的SEQ IDN0:85)。先前參考文獻19和20提到該抗原。之后已發(fā)表了來自許多菌株的NspA抗原 序列。還報導(dǎo)了許多NspA的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選NspA抗原包含某氨基酸序 列，該序列：（a)與SEQIDN0:85具有50 %或更高相同性（例如60%，65%，70%，75%，80 % ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99% ,99. 5%或以上）；和/或 (b)包含SEQIDN0:85至少'n'個連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7或更多（例如8, 10, 1 2, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 或更多）。（b)的優(yōu)選片 段包含來自SEQ ID N0:85的表位。本發(fā)明最有用的NspA抗原可在給予對象后引起抗體， 其能與氨基酸序列SEQ ID NO: 85組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。本發(fā)明使用的有利NspA抗 原可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0032] 本發(fā)明的組合物可包含腦膜炎球菌HmbR抗原。全長HmbR序列作為基因NMB1668 包括在腦膜炎球菌B血清群菌株MC58 [16]的已發(fā)表基因組序列中（本文的SEQ ID N0:86)。 本發(fā)明可使用包含HmbR全長序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些 實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可包含與SEQ ID N0:86具有至少i%序列相同性 的氨基酸序列，其中i值是50、60、70、80、90、95、99或以上。在其它實施方式中，根據(jù)本發(fā) 明使用的HmbR序列可包含SEQ ID N0:86的至少j個連續(xù)氨基酸的片段，其中j值是7、8、 10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或以上。在其它實施 方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可包含一氨基酸序列，其（i)與SEQ ID N0:86具有至 少i%序列相同性，和/或（ii)包含SEQ ID N0:86至少j個連續(xù)氨基酸的片段。j個氨基 酸的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:86的表位。這些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基 酸。有用的表位包括涉及HmbR與血凝素結(jié)合的氨基酸，因為與這些表位結(jié)合的抗體能夠阻 斷細菌與宿主血凝素結(jié)合的能力。HmbR的拓撲學(xué)及其關(guān)鍵功能性殘基如參考文獻21所述。 本發(fā)明最有用的HmbR抗原可在給予對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID N0:86組 成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。本發(fā)明使用的有利HmbR抗原可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗腦 膜炎球菌抗體。
[0033] 本發(fā)明的組合物可包含NhhA抗原。NhhA抗原作為基因NMB0992包括在腦膜炎球 菌B血清群菌株MC58[16]的已發(fā)表基因組序列中（GenBank登錄號GI:7226232;本文的 SEQ ID N0:87)。自從例如參考文獻17和