一種功能性近紅外熒光納米微粒及其制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種近紅外熒光納米微粒（Near-infrared?Fluorescence?Nanoparticles）的制備及其在成像技術(shù)中的應(yīng)用方法。近紅外熒光納米粒以所裝載的近紅外熒光染料作為發(fā)光中心，以殼聚糖、聚賴氨酸為基本骨架，經(jīng)海藻酸鈉自組裝包裹成殼制備而成。透射電子顯微鏡顯示近紅外熒光納米粒的平均粒徑在15nm左右，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試表明其平均動(dòng)態(tài)水合半徑為~160nm。近紅外熒光納米粒的光穩(wěn)定性較熒光染料分子有顯著增強(qiáng)，在0~1.5%的NaCl水溶液中可以穩(wěn)定存在。
【專利說明】一種功能性近紅外熒光納米微粒及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米近紅外熒光材料，具體地說是一種功能性納米近紅外熒光微粒及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]納米尺度上的生物分析化學(xué)是納米生物技術(shù)的最主要發(fā)展方向。在納米生物技術(shù)中，基于近紅外熒光納米探針的活體熒光成像技術(shù)是當(dāng)今國際生物分析科學(xué)領(lǐng)域的研究前沿和重要發(fā)展方向之一，也是各國的研究熱點(diǎn)。功能性納米熒光材料是近年來納米材料研究中的一個(gè)新生長(zhǎng)點(diǎn)，其應(yīng)用焦點(diǎn)目前主要集中在生物【技術(shù)領(lǐng)域】如生物活體成像檢測(cè)，生物大分子原位示蹤、熒光顯微鏡檢測(cè)、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)等。現(xiàn)在已報(bào)道的熒光活體成像技術(shù)及其存在的問題包括如下幾個(gè)方面:
[0003](I)近紅外突光染料體內(nèi)成像技術(shù)(文獻(xiàn)1C.，Jonak, H., Skvara, R., Kunst feld，et al.1ntradermal indocyanine green for in vivo fluorescence laser scanning microscopy of human skin:a pilot study.Plos One，2011，6，e23972.文獻(xiàn) 2L.A.Yannuzz1.1ndocyanine green angiography:a perspective on use in the clinical setting.Am.J.0phthalmol.2011，151，745)。以口引哚菁綠(ICG)為代表的近紅外染料，人體毒性低，可直接應(yīng)用于活體成像，如體內(nèi)血管造影，注射式皮膚造影等。但吲哚菁綠體內(nèi)代謝速度快，光穩(wěn)定性低，使其應(yīng)用受到限制。
[0004](2)熒光量子 點(diǎn)應(yīng)用于成像技術(shù)(文獻(xiàn)3H.S.Choi, B.1.1pej P.Misra, et al.Tissue—and organ-selective biodistribution of nir fluorescent quantum dots.Nano Lett.2009，9，2354.文獻(xiàn) 4Y.Wang, P.Anilkumar，L Caoj et al.Carbon dots of different composition and surface functionalization:cytotoxicity issues relevant to fuorescence cell imaging.Exp.Bi0.Med.2011，236，1231) ?焚光量子點(diǎn)可以分為兩類:一類是以CdSe，ZnS等無機(jī)材料形成的量子點(diǎn)，光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，熒光量子產(chǎn)率高， 但存在重金屬毒性問題，活體成像應(yīng)用受限；另一類是以有機(jī)質(zhì)為原料制成的碳點(diǎn)，生物相容性優(yōu)于無機(jī)量子點(diǎn)，同時(shí)擁有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，但焚光量子產(chǎn)率較弱，發(fā)射光波段位于短波長(zhǎng)可見光，不適合活體成像。
[0005](3)納米載體裝載焚光物質(zhì)成像技術(shù)(文獻(xiàn)5E.1.Altinogluj T.J.Russin, J.M.Kaiser,et al.Near-1nfrared emitting fluorophore—doped calcium phosphate nanoparticles for in vivo imaging of human breast cancer.ACS Nano, 2008, 2, 2075.文獻(xiàn) 6M.Nykj R.Kumar, T.Y.0hulchanskyy, et al.High contrast in vitro and in vivo photoluminescence bioimaging using near infrared to near infrared up-conversion in Tm3+and Yb3+doped fluoride nanophosphors.Nano Lett.2008，8，3834。以裝載焚光物質(zhì)的類型分為兩類:一類裝載量子點(diǎn)成像，另一類裝載熒光染料。兩種方法都是通過載體的保護(hù)提高染料的熒光穩(wěn)定性，延長(zhǎng)體內(nèi)成像時(shí)間，并通過載體賦予其靶向。與染料直接成像方法相比應(yīng)用范圍更廣，目前應(yīng)用主要集中在實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)階段。[0006]吲哚菁綠是一種近紅外熒光三碳菁染料，它的吸收和發(fā)射峰的最大值均位于組織的“最佳窗口”內(nèi)，近紅外光的組織穿透性比藍(lán)綠光要強(qiáng)很多，大大地降低了人體中血紅蛋白等的吸收干擾，已通過美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的肝臟損傷診斷和眼底血管造影檢測(cè)， 成為觀測(cè)生理指標(biāo)的最佳選擇之一。然而吲哚菁綠分子本身熒光強(qiáng)度低，光穩(wěn)定性弱，無活性基團(tuán)不易進(jìn)行分子標(biāo)記，用于體內(nèi)成像時(shí)靶向性差。如果能夠通過使用納米載體包裹吲哚菁綠，既可以增強(qiáng)其熒光穩(wěn)定性，延緩體內(nèi)成像時(shí)間，也可以發(fā)揮納米顆粒的增強(qiáng)滲透效應(yīng)(EPR)引起的被動(dòng)靶向作用，從而改善和提高吲哚菁綠的體內(nèi)成像質(zhì)量，為發(fā)展新的體內(nèi)光學(xué)成像探針提供新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種以吲哚菁綠近紅外熒光染料作為發(fā)光中心，以殼聚糖、聚賴氨酸等為基本骨架，經(jīng)海藻酸鈉自組裝包裹成殼的納米熒光微粒。 所得到的近紅外熒光納米微粒具有熒光穩(wěn)定性高，體內(nèi)成像時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)又具備良好生物相容性等特點(diǎn)。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]功能性納米近紅外熒光微粒以近紅外染料平面共軛結(jié)構(gòu)為發(fā)光中心，采用靜電結(jié)合成粒技術(shù)制備而成，并且納米球表面具有化學(xué)結(jié)合能力的功能官能團(tuán)。
[0010]具體為:以聚陰離子作為交聯(lián)劑，與裝載有陰離子近紅外染料殼聚糖材料形成納米粒內(nèi)核，再經(jīng)海藻酸鈉等交聯(lián)形成穩(wěn)定的外殼結(jié)構(gòu)，其所結(jié)合方式如下:
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種功能性近紅外熒光納米微粒，其特征在于:于液相中，以吲哚菁綠(ICG)為發(fā)光中心，采用殼聚糖(CA)、聚賴氨酸(PLL)中的一種或二種以上聚合物，經(jīng)過靜電自組裝后， 再引入海藻酸鈉(ALG)，經(jīng)過二次靜電自組裝方法獲得具有近紅外發(fā)光功能的納米顆粒。
2.按照權(quán)利要求1所述的功能性近紅外熒光納米微粒，其特征在于:其制備過程如下:將近紅外熒光染料吲哚菁綠溶于0.05-0.2M的HAc/NaAc緩沖溶液中(pH 4飛)，制成 0.8~3mg/mL的ICG溶液；經(jīng)過0.22 u m過濾膜處理；同時(shí)將分子量為5~800kDa的殼聚糖，溶于0.05~0.2M的HAc/NaAc緩沖溶液中(pH 4、),制成1.(Tl2mg/mL的殼聚糖溶液,經(jīng)過0.22 y m過濾膜處理,在磁力攪拌狀態(tài)下,通過進(jìn)液泵將25~100 ii L的ICG溶液滴入2~5mL殼聚糖溶液，制得ICG-CA靜電結(jié)合溶液； 將多聚磷酸鈉(STPP)加入到HAc/NaAc緩沖溶液中，配置6~12mg/mL的STPP溶液，并經(jīng)0.22 ii m過濾膜處理；在磁力攪拌狀態(tài)下，通過進(jìn)液泵將10(T350 y L的STPP溶液滴入 ICG-CA靜電結(jié)合溶液，制得ICG-CA-STPP納米粒溶液；然后將海藻酸鈉加入到HAc/NaAc緩沖溶液中，配置5~20mg/mL的ALG溶液，并經(jīng) 0.22um過濾膜處理；使用I~2.5M的NaOH溶液調(diào)整ICG-CA-STPP納米粒溶液的pH至pH 4-5 ;在磁力攪拌下，通過進(jìn)液泵將l(T300ii L的海藻酸鈉溶液滴入ICG-CA-STPP納米粒溶液中，制得海藻酸鈉包裹的ICG-CA-STPP納米粒溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的功能性近紅外熒光納米微粒，其特征在于:微粒納米表面具有可用于化學(xué)修飾或標(biāo)記的活性功能團(tuán)。
4.一種權(quán)利要求1所述的功能性近紅外熒光納米微粒的制備方法，其特征在于:將近紅外熒光染料吲哚菁綠溶于0.05、.2M的HAc/NaAc緩沖溶液中(pH 4飛)，制成0.8~3mg/mL的ICG溶液；經(jīng)過0.22 u m過濾膜處理；同時(shí)將分子量為5~800kDa的殼聚糖，溶于0.05~0.2M的HAc/NaAc緩沖溶液中(pH4、),制成1.(Tl2mg/mL的殼聚糖溶液,經(jīng)過0.22 y m過濾膜處理,在磁力攪拌狀態(tài)下,通過進(jìn)液泵將25~100 ii L的ICG溶液滴入2~5mL殼聚糖溶液，制得ICG-CA靜電結(jié)合溶液；將多聚磷酸鈉加入到HAc/NaAc緩沖溶液中，配置6~12mg/mL的STPP溶液，并經(jīng) 0.22iim過濾膜處理；在磁力攪拌狀態(tài)下，通過進(jìn)液泵將10(T350iiL的STPP溶液滴入 ICG-CA靜電結(jié)合溶液，制得ICG-CA-STPP納米粒溶液；然后將海藻酸鈉加入到HAc/NaAc緩沖溶液中，配置5~20mg/mL的ALG溶液，并經(jīng)0.22 um水系膜過膜處理；使用1~2.5M的NaOH溶液調(diào)整ICG-CA-STPP納米粒溶液的pH至 pH 4~5 ;在磁力攪拌下，通過進(jìn)液泵將10~300 ii L的ALG溶液滴入ICG-CA-STPP納米粒溶液中，制得海藻酸鈉包裹的ICG-CA-STPP納米粒溶液。
5.一種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的功能性近紅外熒光納米微粒在生物分子標(biāo)記中的應(yīng)用，其特征在于:所述生物分子包括多肽、抗體、抗原、蛋白、核酸等分子中的一種或二種以上。
6.一種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的功能性近紅外熒光納米微粒在生物體內(nèi)活體熒光成像中的應(yīng)用。
7.一種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的功能性近紅外熒光納米微粒在藥物分子標(biāo)記中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK103509552SQ201210222884
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】馬小軍, 譚明乾, 吳昊 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所