專利名稱：地黃飲在制備促脊髓損傷修復(fù)藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及地黃飲的醫(yī)藥新用途，尤其是在制備促進(jìn)脊髓損傷后的修復(fù)的藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脊髓損傷治療的進(jìn)展和困境脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是平戰(zhàn)時(shí)常見(jiàn)的一種嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，常導(dǎo)致病人四肢不同程度的癱瘓或大小便障礙，不僅給病人造成痛苦，同時(shí)加重社會(huì)及家庭負(fù)擔(dān)。SCI在世界上總發(fā)生率20-40人/百萬(wàn)人/年，美國(guó)發(fā)生率為28 55人/百萬(wàn)人/年，每年新增病例約I萬(wàn)人[1]。每年護(hù)理與治療這些病人的總費(fèi)用超過(guò)70億美元。我國(guó)沒(méi) 有全面的統(tǒng)計(jì)，但北京市統(tǒng)計(jì)2002年脊髓損傷發(fā)病率為60人/百萬(wàn)，遠(yuǎn)高于美國(guó)和世界總體水平，且近年來(lái)有上升趨勢(shì)[2]。脊髓損傷所致殘疾目前尚無(wú)有效治療方法，神經(jīng)功能恢復(fù)一直是臨床治療的難題。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)SCI病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，認(rèn)識(shí)到SCI主要由不可逆的原發(fā)損傷和可逆轉(zhuǎn)的繼發(fā)損傷所致，而且我們及他人研究顯示繼發(fā)損傷的范圍和程度均大于原發(fā)損傷[3]。所以神經(jīng)保護(hù)防止繼發(fā)損傷以促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)是SCI治療的重要策略[4]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)多種繼發(fā)損傷機(jī)制參與了 SCI后病理生理過(guò)程，包括興奮性氨基酸毒性、微循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)、自由基氧化應(yīng)激、鈣超載、凋亡等機(jī)制，針對(duì)上述發(fā)病機(jī)制和治療策略，目前研發(fā)了多種SCI治療藥物，包括興奮性氨基酸受體拮抗劑，鈣通道阻滯劑，自由基清除劑，凋亡抑制和控制炎癥等相應(yīng)措施[5]。遺憾的是，目前循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)表明，迄今沒(méi)有一種藥物被證實(shí)對(duì)SCI患者有確切臨床療效[4]。由此可見(jiàn)SCI后病理生理過(guò)程是一多因素、多機(jī)制、多階段的細(xì)胞分子事件，針對(duì)其中某一因素或機(jī)制可能很難取得良好的療效，這是目前SCI治療的困境所在。地黃飲子是有名的古方，出自劉河間的《黃帝素問(wèn)宣明論方》，“主治喑痱腎虛弱厥逆語(yǔ)聲不出足廢不用”者。方用熟地黃、山茱萸滋補(bǔ)腎陰，肉蓯蓉、巴戟天溫壯腎陽(yáng)，四味共為君藥。配伍附子、肉桂之辛熱，以助溫養(yǎng)下元，攝納浮陽(yáng)，引火歸原；石斛、麥冬、五味子滋養(yǎng)肺腎，金水相生，壯水以濟(jì)火，均為臣藥。石菖蒲與遠(yuǎn)志、茯苓合用，是開(kāi)竅化痰，交通心腎是為佐藥。姜、棗、薄荷和中調(diào)藥，功兼佐使。綜觀全方，陰陽(yáng)雙補(bǔ)、化痰開(kāi)竅、標(biāo)本兼顧、上下并調(diào)，可治療語(yǔ)聲不出、足廢不用等多種病證。所以，地黃飲傳統(tǒng)上主要用于腦缺血、癡呆癥、腎病、糖尿病等的治療[6_8]，但是在脊髓損傷中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供地黃飲的新用途，即在制藥領(lǐng)域中的新應(yīng)用。實(shí)際上，本發(fā)明涉及地黃飲作為制備促脊髓損傷修復(fù)藥中的應(yīng)用。本發(fā)明所述地黃飲由熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、巴戟天四味君藥配合臣藥、佐藥組成。
上述地黃飲作為制備促脊髓損傷修復(fù)的藥中的應(yīng)用，具體來(lái)說(shuō)可以采用中藥制劑常規(guī)方法如水提法制備；然后將提取的生藥成份通過(guò)硫化噴霧制粒法制作成顆粒劑；或進(jìn)一步制成片劑、雙層片、速崩片、緩控釋片；或制備成水煎劑，由于水煎劑在胃腸道中吸收比較快，作用也較速，并可隨癥靈活加減；也可將這些原料藥研成粉末、混勻制成散劑沖服；也可制備成其他含本方劑主要成份的藥物組合物，如注射劑，如注射用粉劑、注射用凍干粉，以及膠囊劑軟膠囊、噴霧劑、膏劑等，以上劑型均為常規(guī)方法制得。上述地黃飲在用作促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)藥物使用時(shí)可以根據(jù)病人的情況確定用法用量，但每日各生藥量以國(guó)家藥典用藥量為準(zhǔn)，不超過(guò)藥典規(guī)定量。本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明地黃飲新醫(yī)藥用途將成為高效低毒的脊髓損傷治療藥物的重要補(bǔ)充；且地黃飲的原料易得，制備工藝簡(jiǎn)單，得率高，成本低，藥用前景廣闊。


圖I :圖I-A為地黃飲降低損傷后脊髓乳酸脫氫酶的釋放圖；圖I-B為地黃飲減輕損傷后脊髓細(xì)胞丟失的觀察圖。圖2 :圖2-A為給予生理鹽水無(wú)法減輕SCI后的細(xì)胞凋亡圖；圖2-B為灌服地黃飲低劑量組減輕SCI后的細(xì)胞凋亡圖；圖2-C為灌服地黃飲高劑量組顯著減輕SCI后的細(xì)胞凋亡圖；圖2-D為對(duì)A、B、C的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析圖，*表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。圖3 :圖3-A為脊髓損傷后大片組織壞死、缺失觀察圖；圖3-B為地黃飲低劑量組減輕SCI后脊髓組織缺失觀察圖；圖3-C為地黃飲高劑量組顯著減輕組織壞死缺失觀察圖。圖4 :圖4-A為脊髓損傷后膠質(zhì)增生、突起發(fā)達(dá)相互交錯(cuò)的觀察圖；圖4-B為地黃飲低劑量灌服組膠質(zhì)增生和突起延伸明顯較少的觀察圖；圖4-C為地黃飲高劑量灌服組則膠質(zhì)增生顯著抑制，膠質(zhì)細(xì)胞突起短的觀察圖。圖5 :圖5-A為脊髓損傷后大而不規(guī)則的囊腔空洞形成的觀察圖；圖53為地黃飲低劑量組囊腔明顯縮小的觀察圖；圖5-C為地黃飲高劑量組囊腔顯著縮小的觀察圖。圖6 :圖6-A為假手術(shù)組脊髓前角區(qū)突觸囊泡素synaptophysin的表達(dá)豐富(顏色深)觀察圖；圖6-B為脊髓損傷后突觸synaptophysin表達(dá)顯著下降的觀察圖；圖6_C為地黃飲低劑量組能稍微阻止脊髓損傷導(dǎo)致的synaptophysin的表達(dá)下降的觀察圖；圖6-D為地黃飲高劑量組明顯阻止脊髓損傷后synaptophysin的表達(dá)下降的觀察圖；圖6-E為假手術(shù)、脊髓損傷、地黃飲低劑量、地黃飲高劑量下脊髓損傷的髓前角區(qū)突觸囊泡素synaptophysin表達(dá)水平分析圖。圖7 :地黃飲促進(jìn)SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)程度比較圖。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用地黃飲有效保護(hù)脊髓損傷后神經(jīng)元的損傷，抑制凋亡，減輕組織損傷，促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)等試驗(yàn)及結(jié)果，說(shuō)明地黃飲在醫(yī)藥領(lǐng)域的新用途。以下實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明的限制。以下通過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界廣泛應(yīng)用、公認(rèn)的重物墜落脊髓撞擊致傷模型，制作穩(wěn)定、可靠的大鼠脊髓損傷模型，模型成功后大鼠雙后肢癱瘓。模型動(dòng)物給予灌服地黃飲子水煎齊U，每日I次，連續(xù)灌服30天。I.材料與方法I. I動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)健康成年Wistar大鼠，體重250g左右，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，室溫25 ± 2 °C飼養(yǎng)，空氣新鮮，自由飲水、攝食。I. 2藥品原料藥為熟地黃12g、肉蓯蓉9g、巴戟天9g、山茱萸9g、石斛9g、附子6g、五味子6g、肉桂6g、獲茶6g、麥冬6g、石菖蒲6g、遠(yuǎn)志6g、生姜3g、大率3g、薄荷3g。所用中藥材一次性購(gòu)于重慶市中藥材公司，并經(jīng)鑒定為純正中藥材。以藥物總體積的5倍量水浸泡45min，煮沸后改文火煎30min，取煎液，繼用藥物體積3倍量水，先后再煎2次，合并3次煎液，濾過(guò)，濾液用文火濃縮至藥液濃度為2g/ml (生藥量)，無(wú)菌條件裝瓶，置4°C冰箱備用。I. 3分組和給藥假手術(shù)組(即正常對(duì)照組)，生理鹽水對(duì)照組(灌服生理鹽水6ml/d)，地黃飲低劑量組6g/kg/d灌胃給藥，高劑量組18g/kg/d灌胃給藥，連續(xù)灌服30天。 I. 4取材范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)束麻醉處死動(dòng)物后，打開(kāi)椎管暴露脊髓，以脊髓損傷傷處為中心，取出包括損傷區(qū)及其頭尾側(cè)總長(zhǎng)為I. 2cm的脊髓組織，進(jìn)行組織切片或勻漿抽提蛋白等。I. 5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS10. 0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，全部結(jié)果均用“均值土標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P〈0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. I地黃飲有效減輕SCI后細(xì)胞損傷為觀察地黃飲對(duì)SCI的保護(hù)作用，首先我們觀察了 SCI后細(xì)胞損傷的情況。將上述各組動(dòng)物處死取出損傷區(qū)及其周圍脊髓組織，勻漿后應(yīng)用乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)反應(yīng)細(xì)胞損傷的LDH釋放水平，因?yàn)榧?xì)胞損傷后會(huì)釋放乳酸脫氫酶，它的水平可以反映脊髓細(xì)胞損傷程度。結(jié)果顯示脊髓損傷后細(xì)胞損傷較重，與假手術(shù)對(duì)照組相比，LDH釋放上升2. 5倍，而地黃飲灌服組動(dòng)物L(fēng)DH釋放明顯下降，并且呈量效關(guān)系(見(jiàn)圖1-A)，說(shuō)明地黃飲能有效抑制SCI后所致細(xì)胞的損傷。其次，應(yīng)用神經(jīng)元特異性染色-Nissl染色法發(fā)現(xiàn)，SCI后脊髓損傷區(qū)神經(jīng)元損傷嚴(yán)重、細(xì)胞喪失明顯(圖1-B)，但給予地黃飲則可有效抑制神經(jīng)元的丟失，明顯發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。2. 2地黃飲有效降低SCI后細(xì)胞凋亡SCI后脊髓受到原發(fā)損傷，損傷中心區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)死亡、丟失，原發(fā)損傷所致細(xì)胞壞死是不可逆的，而損傷周圍區(qū)的細(xì)胞的繼發(fā)死亡是可逆的，其中細(xì)胞凋亡是SCI后損傷區(qū)周圍細(xì)胞繼發(fā)死亡、丟失的重要原因，應(yīng)用凋亡特異性染色方法-TUNEL染色法，觀察發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后細(xì)胞凋亡明顯，與灌服生理鹽水對(duì)照組相比，灌服地黃飲可有效抑制細(xì)胞凋亡，高、低劑量組均有明顯抑制效果，并且高劑量組的抑制效果優(yōu)于低劑量組(見(jiàn)圖2 )。2. 3地黃飲減輕SCI后組織病理?yè)p傷為進(jìn)一步觀察地黃飲對(duì)脊髓組織層面的損傷保護(hù)效應(yīng)，應(yīng)用HE染色觀察地黃飲對(duì)SCI后脊髓組織病理變化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脊髓損傷后由于前述的細(xì)胞損傷、死亡，最終導(dǎo)致脊髓組織的大片壞死和缺失。組織橫切片也顯示SCI后組織損傷嚴(yán)重，組織缺失明顯(見(jiàn)圖-3A)，而灌服地黃飲則可有效減輕組織損傷，組織壞死與缺失面積明顯縮小，并且地黃飲高劑量組的療效優(yōu)于低劑量組的療效(見(jiàn)圖-3B和C)。2. 4地黃飲減輕SCI后膠質(zhì)瘢痕形成SCI后由于組織損傷的刺激，星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)增生、活化，稱為膠質(zhì)反應(yīng)，由于膠質(zhì)細(xì)胞的大量增殖、活化，在脊髓損傷的后期則成為膠質(zhì)瘢痕，現(xiàn)代研究表明膠質(zhì)瘢痕是阻止脊髓自發(fā)神經(jīng)再生的天然屏障，因此抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化和瘢痕的形成是目前國(guó)際上促進(jìn)神經(jīng)再生與脊髓功能修復(fù)的重要策略。應(yīng)用星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，細(xì)胞突起發(fā)達(dá)延伸，相互交錯(cuò)，形成屏障(見(jiàn)圖-4A)，而給SCI動(dòng)物灌服地黃飲，則明顯抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增生、突起的延伸。且地黃飲高劑量組抑制效果優(yōu)于低劑量組(見(jiàn)圖-4B和C)2. 5地黃飲縮小SCI后囊腔的形成另外，SCI后慢性期前述的細(xì)胞損傷、組織壞死、缺失，最終形成囊腔，也是SCI后組織修復(fù)、神經(jīng)再生的一重要物理屏障。如圖-5A所示，SCI后脊髓損傷區(qū)及其周圍形成了 長(zhǎng)距離的形狀不規(guī)則的囊腔空洞，而灌服地黃飲可有效縮小囊腔空洞的形成，并且呈劑量依賴性。2. 6地黃飲促進(jìn)SCI后突觸可塑性突觸是神經(jīng)元之間連接的特化區(qū)域，是神經(jīng)元之間信號(hào)傳遞的通路，大腦皮質(zhì)通過(guò)突觸對(duì)脊髓神經(jīng)元進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而支配其管控的肌肉。因此，突觸是SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。應(yīng)用免疫組化技術(shù)，觀察發(fā)現(xiàn)SCI后突觸特異性標(biāo)記物突觸囊泡素synaptophysin表達(dá)顯著下降，灌服地黃飲則明顯保護(hù)突觸，減輕損傷，有效抑制synaptophysin的表達(dá)下降。其中地黃飲高劑量組療效優(yōu)于地黃飲低劑量組，提示地黃飲抑制突觸synaptophysin表達(dá)下降的作用有較好的量效關(guān)系。圖6-A :假手術(shù)組脊髓前角區(qū)突觸囊泡素synaptophysin的表達(dá)豐富(顏色深);圖6-B :脊髓損傷后突觸synaptophysin表達(dá)顯著下降；圖6-C :地黃飲低劑量組能稍微阻止脊髓損傷導(dǎo)致的synaptophysin的表達(dá)下降；圖6-D :地黃飲高劑量組明顯阻止脊髓損傷后synaptophysin的表達(dá)下降；圖6-E :數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示地黃飲灌服可有效阻止SCI后synaptophysin的表達(dá)下降，并呈劑量依賴性。2. 7地黃飲促進(jìn)SCI動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)脊髓損傷(SCI)患者的最大問(wèn)題就是肢體運(yùn)動(dòng)功能的喪失、癱瘓，所以任何治療藥物或措施均以促進(jìn)患者運(yùn)動(dòng)功能的最終目標(biāo)。為進(jìn)一步檢測(cè)地黃飲的神經(jīng)保護(hù)和促神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，則應(yīng)用動(dòng)物雙后肢行為學(xué)功能BBB評(píng)分來(lái)檢測(cè)不同處理組SCI動(dòng)物。假手術(shù)組動(dòng)物雙后肢運(yùn)動(dòng)功能和正常大鼠完全一致，評(píng)分為滿分(21分)，而SCI組動(dòng)物后雙側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)功能喪失、癱瘓(為最低0分),隨著損傷后時(shí)間的推移，SCI動(dòng)物會(huì)有一個(gè)自發(fā)、但非常有限的功能恢復(fù)過(guò)程。而服用地黃飲的SCI動(dòng)物則運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)明顯提高。即使低劑量組也顯著促進(jìn)SCI動(dòng)物雙后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，而高劑量組SCI動(dòng)物行為學(xué)功能恢復(fù)更好，呈明顯的量效關(guān)系。綜上所述，應(yīng)用上述形態(tài)學(xué)、生化與分子生物學(xué)、行為學(xué)等方法系統(tǒng)地評(píng)估了地黃飲在脊髓損傷中的作用，結(jié)果充分表明脊髓損傷后灌服地黃飲可有效減輕細(xì)胞損傷、凋亡，減輕組織壞死與缺失，抑制膠質(zhì)瘢痕和囊腔空洞的形成，促進(jìn)突觸可塑性，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。地黃飲在促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的藥中應(yīng)用效果顯著。
權(quán)利要求
1.地黃飲在制備促脊髓損傷修復(fù)藥中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述地黃飲由熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、巴戟天四味君藥配合臣藥、佐藥組成?！?br> 全文摘要
本發(fā)明提供地黃飲在制備促脊髓損傷修復(fù)藥中的應(yīng)用。本發(fā)明地黃飲新醫(yī)藥用途將成為高效低毒的脊髓損傷治療藥物的重要補(bǔ)充；且地黃飲的原料易得，制備工藝簡(jiǎn)單，得率高，成本低，藥用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102743494SQ201210257619
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者馮華, 張倩, 胡榮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院