專利名稱：表達(dá)豬捷申病毒8型vp1蛋白的重組腺病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有豬捷申病毒8型VPl基因序列的重組腺病毒以及該重組腺病毒在預(yù)防或治療豬捷申病中的應(yīng)用，屬于豬捷申病的防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬捷申病(teschen diseaes)最初發(fā)現(xiàn)于捷克的捷申地區(qū)，是一種急性的致死性豬傳染性疾病，能引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，又命名為豬捷申病毒腦脊髓炎(teschovirus encephalomyelitis),該病是由Teschen毒株感染引起，屬于豬捷申病毒(Porcine teschovirus, PTV) I型。1956年英國威爾士出現(xiàn)了另一種形式的腦脊髓灰質(zhì)炎疾病，引起豬的神經(jīng)癥狀較輕，屬于溫和型腦脊髓灰質(zhì)炎，命名為塔爾凡病(talfandisease)，該病是由Talfan毒株感染引起，也屬于PTV-1。隨后在北美洲、澳大利亞、非洲以及亞洲等地區(qū)相繼分離到了 PTV的其他血清型毒株，而且引起的癥狀呈現(xiàn)多樣性神經(jīng)系 統(tǒng)紊亂、繁殖障礙、肺炎、鼻炎、腹瀉、心包炎和心肌炎以及皮膚損傷等。目前在我國主要和豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)混合感染較多，主要引起高熱病、流產(chǎn)、仔豬死亡以及腹瀉、腸炎等。PTV基因組為單股線狀正鏈RNA，只含有一個大的開放閱讀框，編碼翻譯合成一個大的多聚蛋白，最終形成4種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。PTV的衣殼蛋白由VPl、VP2、VP3、VP44種蛋白粒子構(gòu)成，它們可以保護(hù)病毒RNA不被環(huán)境中的RNA酶降解；識別宿主細(xì)胞編碼的位于細(xì)胞膜上的病毒受體；決定病毒宿主范圍；決定感染的組織特異性。這4種結(jié)構(gòu)蛋白分別由262、279、242、74個氨基酸組成。其中VP4蛋白最小，埋于病毒粒子內(nèi)部，與病毒基因組RNA相連。VPl、VP2、VP3蛋白位于病毒粒子的表面，連同VP4蛋白首先形成衣殼蛋白亞單位，進(jìn)而形成五聚體，最后由12個五聚體形成完整的病毒衣殼。這些結(jié)構(gòu)蛋白的性質(zhì)決定了病毒粒子的物理性狀及抗原性等。VPl蛋白空間結(jié)構(gòu)中含有8個β片層結(jié)構(gòu)和2個α螺旋結(jié)構(gòu)，位于殼粒表面的環(huán)形結(jié)構(gòu)與β片層相連，羧基端位于殼粒的外側(cè)，氨基端位于內(nèi)側(cè)，這些末端與其他蛋白末端結(jié)合，使病毒衣殼更加穩(wěn)定。PTV-8jilin/2003株的VPl蛋白由792個核苷酸編碼264個氨基酸組成，VPl蛋白含有病毒主要的抗原位點和中和位點，主要決定病毒的抗原性。2007年Kaku等通過單克隆抗體預(yù)測了 PTV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)，其中VPl蛋白的C末端突起結(jié)構(gòu)、G-H環(huán)以及VP2突起結(jié)構(gòu)決定了 PTV抗原性，是主要的抗原表位，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，同時還參與了細(xì)胞表面受體的識別和結(jié)合。目前針對本病沒有有效的治療藥物，只能以預(yù)防為主，同時采取綜合性措施，防止易感豬群被PTV感染。在該病暴發(fā)初期，主要是采取患病豬或人工感染豬的組織臟器制成懸液，以氫氧化鋁為佐劑制成的組織滅活苗。該疫苗在東歐地區(qū)應(yīng)用后大大降低了該病的病死率，證明其具有良好的保護(hù)力，在該病的防治中發(fā)揮了重要作用，目前國內(nèi)還沒有針對PTV的疫苗。豬捷申病毒腦脊髓炎已很少發(fā)生，而且有些國家早已撲滅了該病，對PTV的研究已處于停滯狀態(tài)，但不能排除在豬群中呈隱性感染的PTV毒株在長期的自然選擇和變異的過程中出現(xiàn)毒力增強(qiáng)，重新暴發(fā)大流行的可能性，所以必須提高警惕，做好豬捷申病的防治工作。由于弱毒苗存在安全性問題，滅活苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)慢，近年來基因工程活載體疫苗開始得到廣泛研究和應(yīng)用。其中腺病毒作為活載體已廣泛被用于疫苗研制，腺病毒作為載體有以下優(yōu)點基因組穩(wěn)定，易于用重組DNA技術(shù)操作；安全性較好，腺病毒無需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中；插入大片段外源性基因的潛力大；宿主范圍廣，可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；容易將外源基因直接導(dǎo)入靶細(xì)胞，并有效表達(dá)活性蛋白；外源基因表達(dá)水平較高。王先煒等構(gòu)建了含PCV2 Cap基因的重組腺病毒，免疫小鼠后經(jīng)中和試驗、間接ELISA和Western blot鑒定，能產(chǎn)生針對PCV2的抗體，可以作為預(yù)防PCV2感染的候選疫苗。孫元等將豬瘟病毒E2蛋白基因插入到腺病毒載體中，成功包裝出能高效表達(dá)E2蛋白的重組腺病毒，通過在兔子和豬體上進(jìn)行免疫和攻毒試驗，結(jié)果表明免疫重組腺病毒后能抵抗豬瘟強(qiáng)毒的攻擊。因此，以腺病毒為載體的基因工程活載體疫苗能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供豬捷申病毒8型VPl (PTV-8VP1)蛋白的氨基酸序列及編 碼其的核苷酸序列；本發(fā)明的目的之二在于提供一種含有PTV-8VP1基因序列的表達(dá)載體；本發(fā)明目的之三是提供一種含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；本發(fā)明目的之四是提供一種含有PTV-8VP1基因序列的重組腺病毒；本發(fā)明目的之五是提供所述的豬捷申病毒8型VPl (PTV-8VP1)蛋白及其表達(dá)載體在在制備診斷、預(yù)防或治療豬捷申病藥物中的用途。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明首先根據(jù)PTV-8 jilin/2003株VPl基因序列設(shè)計一對引物，RT-PCR擴(kuò)增出含有792個核苷酸的全長VPl基因，核苷酸序列見序列表SEQ ID NO. I所示。由其編碼豬捷申病毒8型VPl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。由于密碼子的簡并性，本發(fā)明所述的核苷酸序列也包括任何能夠編碼SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列或能夠編碼SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中；其中，所述的表達(dá)載體可以是穿梭載體或者是腺病毒表達(dá)載體等；本發(fā)明還提供了所述的豬捷申病毒8型VPl蛋白在制備診斷、預(yù)防或治療豬捷申病藥物中的用途。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種制備表達(dá)豬捷申病毒8型VPl蛋白的重組腺病毒的方法，包括將SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列克隆到pShuttIe-CMV中，獲得pS-VPl ；pS-VPl經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化至攜帶有腺病毒骨架質(zhì)粒的大腸桿菌中，并在細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得含有VPl基因的重組腺病毒表達(dá)載體pAdv-VPl。將pAdv-VPl線性化后，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，即可獲得表達(dá)VPl蛋白的重組腺病毒。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)豬捷申病毒8型VPl蛋白的重組腺病毒，其特征在于含有上述SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，所述的重組腺病毒命名為rAdv-VPl，分類命名為表達(dá)豬捷申病毒8型VPl蛋白的重組腺病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6340，保藏日期為2012年7月6日。本發(fā)明得到的重組腺病毒rAdv-VPl經(jīng)IFA和Western blot證明rAdv-VPl成功表達(dá)了 VPl蛋白，所表達(dá)蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID NO. 2所示。將rAdv-VPl在293細(xì)胞上連續(xù)傳代，獲得高滴度的表達(dá)VPl基因的重組腺病毒。將本發(fā)明rAdv-VPl以肌肉注射途徑免疫3周齡仔豬，可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生特異的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，表明本發(fā)明的rAdv-VPl可應(yīng)用于制備診斷、預(yù)防或治療豬捷申病藥物。本發(fā)明的詳細(xì)描述目的基因的獲得根據(jù)PTV_8jili/2003株VPl基因序列，利用01igo6和Primerf. O引物分析軟件，設(shè)計一對引物，用于特異性的擴(kuò)增VPl基因。提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增VPl基因，經(jīng)膠回收獲得VPl基因。rAdv-VPl的構(gòu)建及應(yīng)用將VPl基因片段(SEQ ID NO. I)定向克隆到·pShuttIe-CMV中，獲得pS-VPl ;pS_VPl經(jīng)Pme I線性化后轉(zhuǎn)化至攜帶有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι的大腸桿菌中，并在細(xì)菌內(nèi)發(fā)生同源重組獲得pAdv_VPl。pAdv-VPl經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞，成功包裝出 rAdv-VPl。rAdv-VPl 經(jīng) RT-PCR、IFA 和 Western blot證明該rAdv-VPl成功表達(dá)了 VPl蛋白。rAdv-VPl以肌肉注射途徑免疫3周齡仔豬，首免后第2周可檢測到抗體，第3周加強(qiáng)免疫，抗體水平增長明顯。淋巴細(xì)胞增殖試驗表明，該rAdv-VPl進(jìn)入免疫動物體內(nèi)后能有效誘導(dǎo)致敏淋巴細(xì)胞增殖，淋巴細(xì)胞受到刺激物的刺激后，大量增殖，免疫后刺激指數(shù)值不斷上升。本發(fā)明采用非復(fù)制型腺病毒為載體，構(gòu)建了表達(dá)PTV-8VP1基因的非復(fù)制型重組腺病毒。將VPl基因片段定向克隆到腺病毒穿梭載體PShuttle-CMV中，獲得重組穿梭載體；重組穿梭載體經(jīng)Pme I線性化后電轉(zhuǎn)化至攜帶有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι的大腸桿菌中，并在細(xì)菌內(nèi)發(fā)生同源重組獲得重組腺病毒載體。重組腺病毒載體經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，成功包裝出重組腺病毒。經(jīng)過RT-PCR、IFA和Western blot證明VPl基因在293細(xì)胞中獲得成功表達(dá)。為了研究重組腺病毒的免疫效果，構(gòu)建的重組腺病毒以肌肉注射途徑免疫3周齡仔豬。動物實驗結(jié)果表明本發(fā)明重組腺病毒能夠刺激豬體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明采用非復(fù)制型腺病毒AdEasy表達(dá)系統(tǒng)，它是通過缺失腺病毒基因組的El和E3區(qū)基因片段構(gòu)建而成的。與復(fù)制型腺病毒相比，非復(fù)制型腺病毒更安全，表達(dá)抗原持續(xù)時間長，能誘導(dǎo)長期的免疫反應(yīng)。重組腺病毒載體基因組穩(wěn)定，易于用重組DNA技術(shù)操作；安全性較好，腺病毒無需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中；插入大片段外源性基因的潛力大；宿主范圍廣，可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；容易將外源基因直接導(dǎo)入靶細(xì)胞，并有效表達(dá)活性蛋白；對動物無致癌性，對人類致病性極低。目前以腺病毒為載體已廣泛應(yīng)用于基因治療和疫苗研究等領(lǐng)域，所以本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病具有較好的應(yīng)用前景。


圖I為PTV-8VP1基因擴(kuò)增結(jié)果；M DNA Marker DL2000 ;1，2 :PTV_8PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；3 :陰性對照；圖2為pS-VPlPCR鑒定結(jié)果；
M DNA Marker DL2000 ;1，2 :PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；3 :陰性對照；圖3為pS-VPl雙酶切鑒定結(jié)果；M DNA Marker DL15000 ；1 :pS_VPlKpn I /Xho I 雙酶切；圖4 為 pAdv-VPl PCR 鑒定結(jié)果；M DNA Marker DL2000 ；1 :PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；2 :陰性對照；圖5為pAdv-VPl酶切鑒定結(jié)果；M:DNA Marker DL15000 ；1 :重組腺病毒質(zhì)粒 pAdv-VPl 酶切；圖6為VPl基因在rAdv-VPl感染的293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄結(jié)果； M DNA Marker DL2000 ；1 rAdv-VPl 感染 293 細(xì)胞；2 wtAdv 感染 293 細(xì)胞；圖7為IFA檢測VPl蛋白在rAdv-VPl感染的293細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果(X200)；A rAdv-VPl 感染 293 細(xì)胞；B wtAdv 感染 293 細(xì)胞；圖8為Western blot檢測VPl蛋白在rAdv-VPl感染的293細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果；M :蛋白 Marker ； I wtAdv 感染 293 細(xì)胞；2 rAdv-VPl 感染 293 細(xì)胞；圖9為rAdv-VPl的PCR穩(wěn)定性鑒定結(jié)果；M DNA Marker DL2000 ;1_4 :第 2、4、8、15 代 rAdv-VPl ；5 :陰性對照；圖10為rAdv-VPl和wtAdv的一步生長曲線；圖11為中和試驗測定豬血清中和抗體結(jié)果(丨表示免疫時間)；圖12為間接ELISA檢測抗體效價結(jié)果(丨表示免疫時間)；圖13為淋巴細(xì)胞增殖試驗結(jié)果(丨表示免疫時間)；圖14為對照非免疫豬群攻毒后豬腸絨毛脫落病理切片。
具體實施例方式下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實施例1PTV-8VP1基因重組腺病毒的構(gòu)建及表達(dá)I材料和方法I. I毒株、質(zhì)粒、細(xì)胞、菌株及血清PTV_8Jilin/2003、親本腺病毒(WtAdv)由本實驗室保存；pShuttle_CMV、含腺病毒骨架質(zhì)粒(pAdEasy-Ι)的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞均購自Stratagene公司；ST細(xì)胞、293細(xì)胞、大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞、PTV-8 jilin/2003陽性血清和陰性血清由本實驗室提供；3周齡仔豬購自哈爾濱道里區(qū)新立養(yǎng)殖場。I. 2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibico公司；青霉素、鏈霉素購自哈藥集團(tuán)制藥總廠；限制性內(nèi)切酶Kpn I、Xho I、Pme I、Pac I、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP、10XEx-Taq buffer>6XLoading buffer> DNA Marker DL2000、DNA MarkerDL15000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程公司(大連)；RNA提取試劑盒、組織/細(xì)胞總DNA提取試劑盒、DAB顯色液購自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、卡那霉素(Kanamycin)購自上海華舜生物工程有限公司；瓊脂糖購自Biowest公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；FITC標(biāo)記的鼠抗豬IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體均購自Sigma公司；伊文氏蘭、固定液(丙酮甲醇=1 I)為本實驗室配制并保存；蛋白Marker購自Fermentas公司；SDS_PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；WeStern及IP細(xì)胞裂解液試劑盒購自凱基生物公司；96孔非放射性細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自Promega公司；3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自Amresco公司；豬淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物公司。I. 3PTV-8VP1基因引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增根據(jù)PTV-8jili/2003株VPl基因序列，利用01igo6和Primer5. O引物分析軟件，設(shè)計一對引物，特異性的擴(kuò)增VPl基因，下劃線處分別是限制性內(nèi)切酶KpnI和Xho I的酶切位點，引物由大連寶生物公司合成，無菌水稀釋成100 μ mol/L，-20 V儲存?zhèn)溆?，使用濃度是ΙΟμπιο?L。引物的核苷酸序列為

PTV-R:5' -GGGGAGCTCAATTTGCAGTGACATAGTTGTCAAGG-3'培養(yǎng)ST細(xì)胞，待長成單層，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，按5%接種劑量，接種PTV-8 jilin/2003病毒液，37 °C 5%C02培養(yǎng)箱中孵育lh，然后加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C 5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長狀況，待有80%左右細(xì)胞發(fā)生病變，收集細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融三次，繼續(xù)在ST細(xì)胞上繁殖兩代以上，收集病毒液，按照天根生化科技有限公司總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒RNA提取，按照寶生物工程公司(大連)Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，25μL反應(yīng)體系10XEx Taq buffer5. O μ L, dNTP2. O μ L，Ex TaqO. 5 μ L，上下游引物(PTV-F/PTV-R)各 I. O μ L，cDNA2 μ L, ddH2013. 5 μ L。PCR 反應(yīng)條件94°C 5min，94°C 30s,56°C 45s, 72°C lmin，共進(jìn)行30個循環(huán)，72°C 7min，4°C終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段。I. 4構(gòu)建含VPl基因的pS-VPl上述回收產(chǎn)物用Kpn I和Xho I雙酶切與同樣酶切的pShuttIe-CMV連接后，轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。利用Kan抗性篩選重組質(zhì)粒，并經(jīng)PCR和Kpn I /Xho I雙酶切鑒定，獲得的PS-VPl送上海生工測序并分析目的序列。L 5 構(gòu)建含 VPl 基因的 pAdv-VPl提取陽性pS-VPl (測序結(jié)果顯示含有核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的片段的克隆。)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pme I酶切，向酶切產(chǎn)物中加入無水乙醇，輕輕混勻，_20°C放置過夜，離心，在無菌條件下倒掉無水乙醇，靜置使無水乙醇蒸發(fā)干凈，無菌水重懸沉淀。經(jīng)無水乙醇沉淀的線性化PS-VPl電轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架pAdEasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行同源重組，挑取Kan平板上的菌落，在含Kan抗性的液體LB中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用PCR和Pac I酶切鑒定。I. 6rAdv-VPI 的獲得提取pAdv-VPl，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pac I線性化，無水乙醇沉淀，利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，將線性化的pAdv-VPl轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞后，收取上清即為病毒原液，病毒原液可感染細(xì)胞用于病毒傳代。本發(fā)明獲得的一株含有上述SEQ ID NO 1核苷酸序列的重組腺病毒，所述的重組腺病毒命名為rAdv-VPl，分類命名為表達(dá)豬捷申病毒8型VPl蛋白的重組腺病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6340，保藏日期為2012年7月6曰。I. 7rAdv-VPI 的鑒定I. 7. IVPl基因在293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄rAdv-VPl和wtAdv分別接種293細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，離心，倒掉上清液，取細(xì)胞沉淀提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以合成的cDNA為模板，PTV-F和PTV-FR為引物PCR擴(kuò)增VPl基因，mRNA水平上鑒定VPl基因在293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。 I. 7. 2IFA檢測VPl基因在293細(xì)胞中的表達(dá)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)293細(xì)胞，待鋪滿單層，接種rAdv-VPl和wtAdv，觀察細(xì)胞病變，當(dāng)約70%接毒細(xì)胞變圓(未脫落)時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗板2次，室溫下晾干培養(yǎng)板，向每孔中加ImL固定液,室溫靜置15min,棄去固定液,PBS洗板3次,每次間隔5min,室溫晾干，作為IFA抗原板,用PBS浸洗抗原板一次，向rAdv-VPl和wtAdv接毒孔中分別加入PTV-8 jilin/2003陽性血清(I 100稀釋)，每孔加樣量為100 μ L，置于濕盒中37°C孵育ASmin15PBS洗滌3次，每次間隔5min。加入100 μ L FITC標(biāo)記的鼠抗豬IgG抗體(I 100稀釋)，同時向二抗中加I μ L伊文氏蘭(1:10000稀釋)充分混勻，置于濕盒中37°C孵育45min，PBS洗滌3次，每次間隔5min。最后加少量碳酸甘油，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。I. 7. 3ffestern blot檢測VPl蛋白在293細(xì)胞中的表達(dá)rAdv-VPl和wtAdv同時接293細(xì)胞，收集細(xì)胞，離心，預(yù)冷的PBS洗滌3次，最后取細(xì)胞沉淀，利用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜。加入I : 100稀釋的PTV-8陽性血清，室溫?fù)u床上孵育lh。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體(1:5000)，室溫?fù)u床上孵育lh，用DAB化學(xué)發(fā)光法顯色。I. 7. 4VP1基因穩(wěn)定性檢測選擇第2、4、8、15代細(xì)胞病毒培養(yǎng)液，提取細(xì)胞總的DNA。以提取的細(xì)胞總DNA為模板，利用PTV-F/PTV-R引物PCR擴(kuò)增VPl基因，檢測VPl基因的穩(wěn)定性。I. 7. 5rAdv_VPl—步生長曲線的測定24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)293細(xì)胞，待長至70%左右，每孔分別接rAdv-VPI和wtAdv, 370C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接毒后第12、24、36、48、60、72h收集細(xì)胞病毒培養(yǎng)懸液，反復(fù)凍融，按照Reed-Muench法測定病毒的TCID5tl,并繪制rAdv-VPl與wtAdv的一步生長曲線，測定rAdv-VPl增殖規(guī)律。2試驗結(jié)果2. IVPl基因的擴(kuò)增提取PTV-8 jilin/2003基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為792bp的目的條帶，與預(yù)期的VPl基因大小相符(見圖1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. 2pS_VPlPCR 鑒定
以pS-VPl為模板，PTV-F/PTV-R為引物，PCR進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出792bp大小的目的條帶，證明VPl基因成功插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒中(見圖2)。2. 3pS-VPl 酶切鑒定pS-VPl經(jīng)Kpn I /Xho I雙酶切獲得了大小為7500bp的穿梭載體和792bp的插入片段(見圖3)。2. 4pAdv-VPlPCR 鑒定線性化的pS-VPl與腺病毒骨架在BJ5183細(xì)胞中同源重組，獲得pAdv-VPl陽性克隆，并以PTV-F/PTV-R為引物，PCR擴(kuò)增目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增出了 792bp大小的目的條帶，說明VPl基因成功插入到腺病毒載體中(見圖4)。2. 5pAdv-VPl 酶切鑒定 獲得的pAdv-VPl經(jīng)Pac I酶切獲得了約30Kb和4. 5Kb大小的兩條片段(見圖5)，說明重組腺病毒載體構(gòu)建正確。2. 6RT-PCR檢測VPl基因在293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄rAdv-VPl和wtAdv分別接種293細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，以PTV-F/PTV-R為引物，PCR擴(kuò)增目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見rAdv-VPl接種的293細(xì)胞擴(kuò)增出與VPl基因大小一致的目的條帶，而對照組為擴(kuò)增出目的片段，說明VPl基因在293細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)錄(見圖6)。2. 7IFA檢測VPl蛋白在293細(xì)胞中的表達(dá)參照發(fā)表在《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》2011年01期，題為檢測豬捷申病毒抗體的間接免疫熒光方法的建立與初步應(yīng)用的文獻(xiàn)的方法進(jìn)行操作。rAdv-VPl和wtAdv分別接293細(xì)胞后，固定細(xì)胞，以PTV陽性血清為一抗，進(jìn)行IFA,倒置熒光顯微鏡下觀察可見接種rAdv-VPl的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的熒光，而接種wtAdv的細(xì)胞不出現(xiàn)熒光(見圖7)。2. 8ffestern blot檢測VPl蛋白在293細(xì)胞中的表達(dá)rAdv-VPl和wtAdv分別接293細(xì)胞后，待細(xì)胞80%變圓，收集細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，加上樣緩沖液煮沸，進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示rAdv-VPl感染的細(xì)胞樣品中出現(xiàn)大小約為29ku的目的蛋白條帶，而wtAdv感染的細(xì)胞樣品中未出現(xiàn)目的蛋白條帶(見圖8)，表達(dá)的VPl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. 9rAdv-VPI的穩(wěn)定性檢測取第2、4、8、15代rAdv-VPl細(xì)胞培養(yǎng)物，分別提取細(xì)胞總DNA，以PTV-F/PTV-R為引物，通過PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，均能檢測到目的基因，證明VPl基因在重組腺病毒中穩(wěn)定存在(見圖9)。2. IOrAdv-VPl 一步生長曲線的測定rAdv-VPl和wtAdv同時接種293細(xì)胞，接毒后12、24、36、48、60、72h分別收集細(xì)胞病毒培養(yǎng)液，通過測定病毒的TCID5tl,繪制rAdv-VPl和wtAdv的一步生長曲線，發(fā)現(xiàn)rAdv-VPl與wtAdv的增殖規(guī)律無明顯差異(見圖10)。實施例2重組腺病毒表達(dá)PTV-8VP1蛋白的免疫原性分析I、實驗方法I. I豬體免疫試驗
選取健康狀況良好且經(jīng)間接ELISA檢測為PTV抗體陰性的3周齡仔豬15頭，隨機(jī)分為三組，每組5頭，一組經(jīng)頸部肌肉注射108TCID5QrAdV-VPl，一組按相同的途徑和劑量注射wtAdv，一組頸部肌肉注射DMEM培養(yǎng)基作為空白對照。初次免疫后第3周加強(qiáng)免疫，免疫前和免疫后每周采血，分離血清，用中和試驗、間接ELISA試驗檢測血清抗體水平。采集抗凝血，淋巴細(xì)胞增殖試驗檢測細(xì)胞免疫水平。I. 2中和抗體測定保存的PTV-8 jilin/2003病毒液接種長滿單層的ST細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變，收集病毒液，如此擴(kuò)增3代。取擴(kuò)增的病毒液按Reed-Muench法測定病毒TCID5tl,并進(jìn)行病毒回歸試驗。采集免疫豬和對照豬血液，分離上清，56°C滅活30min，中和試驗測定血清中和抗體滴度。 I. 3間接ELISA抗體測定利用本實驗室已建立的間接ELISA方法檢測血清抗體效價。取包被好的ELISA板，室溫預(yù)熱，將待檢血清、陽性血清、陰性血清按1:100稀釋后，每孔加入100 μ L，37°C作用lh。每孔加入按1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體100yL，37°C作用lh，DAB顯色，IOmin, H2SO4終止顯色，用酶標(biāo)儀讀取OD45tlnm值，評價血清抗體效價，OD450nnm彡O. 3判定為陽性。I. 4淋巴細(xì)胞增殖試驗按照豬淋巴細(xì)胞分離液試劑盒操作說明書分離豬抗凝血中的淋巴細(xì)胞。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μ L細(xì)胞濃度為2Χ105個/mL的淋巴細(xì)胞懸液，并在每孔加入20 μ g/mL的PTV抗原作為刺激物100 μ L，同時設(shè)未刺激組對照孔，試驗孔和對照孔各作3個重復(fù)，37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約72h，按照細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書向96孔中加入MTS/PMS試劑，370C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，用酶標(biāo)儀在OD49tlnm處讀取OD值，計算刺激指數(shù)
(SI)，公式如下SI=刺激孔OD值/未刺激孔OD值I. 5表達(dá)PTV - VPl蛋白的重組腺病毒作為疫苗免疫期試驗篩選PTV抗體陰性豬40頭，以表達(dá)PTV - VPl蛋白的重組腺病毒為抗原，制備成疫苗(疫苗為5ML108TCID5(lrAdv-VPl，加入1ML20%的蔗糖作為賦形劑，凍干成疫苗，每瓶可以免疫豬5-10頭，稀釋液為O. OlM的PBS。)，進(jìn)行了動物實驗。用不同劑量ImL (上述凍干疫苗用O. OlM的PBS稀釋成10ML，免疫10頭豬)、2mL(上述凍干疫苗用O. OlM的PBS稀釋成10ML，免疫5頭豬)肌肉接種試驗豬，各個劑量接種4頭，同時設(shè)對照4頭。疫苗接種當(dāng)天及接種后7、14、21、30、45、90、150、180天進(jìn)行采血，檢測抗體應(yīng)答水平；同設(shè)同批的非免疫豬取同樣大小的樣本作為試驗對照，采集血樣。用IF方法檢測豬群血清抗體的產(chǎn)生情況。I. 6病毒攻擊試驗上述免疫期的免疫豬，疫苗接種后30天，隨機(jī)從ImL免疫豬抽取豬4頭，并從同批的非免疫豬群取同樣大小的樣本作為試驗對照，按7X 106 5TCID50/頭進(jìn)行PTV-8 Ji I in/2003分離株攻擊，進(jìn)行臨床觀察。2、實驗結(jié)果2. I中和試驗檢測中和抗體
以血清抑制病毒細(xì)胞病變的最大稀釋度為中和抗體滴度，計算結(jié)果以平均值表示。中和試驗檢測結(jié)果顯示rAdv-VPl組初免后一周5頭豬平均抗體滴度為I: I. 8。加免后中和抗體增長明顯，第7周有一頭豬的平均抗體滴度較明顯，達(dá)到1:32，5頭豬的平均抗體滴度達(dá)到I : 18。wtAdv免疫組和空白對照組未檢測到中和抗體，中和抗體滴度均為O(見圖11)。2. 2間接ELISA測抗體效價間接ELISA檢測結(jié)果表明，初免后第一周檢測5頭豬血清抗體OD45tlnm值均小于O. 3，第二周5頭豬平均抗體OD45tlnm值稍大于O. 3，其中I頭豬達(dá)到O. 326，加免后OD45tol值持續(xù)上升，第6周rAdv-VPl組5頭豬OD450nm平均值達(dá)到O. 679，第7周達(dá)到O. 697。wtAdv免疫組和空白對照組抗體檢測OD45tol值均小于O. 3 (見圖12)。
2. 3淋巴細(xì)胞增殖試驗淋巴細(xì)胞增殖試驗檢測結(jié)果顯示，rAdv-VPl免疫組血液淋巴細(xì)胞經(jīng)PTV刺激后出現(xiàn)特異的細(xì)胞活化增殖。初免后兩周SI值增長緩慢，第二周時5頭豬SI平均值僅為I. 18，加免后持續(xù)升高，第7周SI值平均值達(dá)到2. 78，而wtAdv免疫組和空白對照組沒有出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞增殖(見圖13)。2. 4表達(dá)PTV - VPl蛋白的重組腺病毒疫苗免疫期試驗檢測豬捷申病毒抗體的間接免疫熒光方法按照劉芹防等在檢測豬捷申病毒抗體的間接免疫熒光方法的建立與初步應(yīng)用，《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》2011 (01) 一文中記載的方法進(jìn)行。血清學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，Iml及2mL免疫組在免疫后第14天被免動物開始出現(xiàn)抗體反應(yīng)，效價達(dá)到I :100 200，21天全部陽轉(zhuǎn)，免疫后第45天達(dá)到抗體高峰，效價達(dá)為I :800 1600,隨后抗體效價逐漸消減,到150天抗體效價仍能達(dá)到I :200 400,180天抗體效價能達(dá)到I :200。2. 5病毒攻擊試驗疫苗接種后30天，隨機(jī)從免疫豬抽取豬4頭，并從同批的非免疫豬群取同樣大小的樣本作為試驗對照，按7X 106 5TCID50/頭進(jìn)行PTV-8Ji I in/2003分離株(該病毒株記載于“檢測豬捷申病毒抗體的間接免疫熒光方法的建立與初步應(yīng)用”，劉芹防等，《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》2011 (01)，現(xiàn)由哈爾濱獸醫(yī)研究所保存。)攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Iml免疫組豬群在免疫30天能夠獲得100%保護(hù)率；而對照豬有部分出現(xiàn)拉稀、發(fā)熱、食欲不振等現(xiàn)象；剖檢結(jié)果表明免疫IML以上的豬全部正常，對照豬出現(xiàn)腸道充血、出血變化，病理檢測見腸絨毛脫落等變化(見圖14)，部分豬肺臟等出現(xiàn)變化。RT-PCR檢測結(jié)果表明免疫IML以上的豬臟器未分離到病毒，而對照豬可以部分分離到病毒。
權(quán)利要求
1.豬捷申病毒8型VPl蛋白，其特征在于所述的VPl蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
2.編碼權(quán)利要求I所述的豬捷申病毒8型VPl蛋白的核苷酸序列，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.—種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求2所述的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的重組表達(dá)載體是重組腺病毒表達(dá)載體。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體。
6.權(quán)利要求I所述的豬捷申病毒8型VPl蛋白在制備診斷、預(yù)防或治療豬捷申病藥物中的用途。
7.權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體在制備診斷、預(yù)防或治療豬捷申病藥物中的用途。
8.一種制備表達(dá)豬捷申病毒8型VPl蛋白的重組腺病毒的方法，其特征在于包括將SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列克隆到pShuttle-CMV中，獲得pS-VPl ;pS_VPl經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化至攜帶有腺病毒骨架質(zhì)粒的大腸桿菌中，并在細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得含有VPl基因的重組腺病毒表達(dá)載體；將pAdv-VPl線性化后，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，即可獲得表達(dá)VPl蛋白的重組腺病毒。
9.一種表達(dá)豬捷申病毒8型VPl蛋白的重組腺病毒，其特征在于含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，所述的重組腺病毒，命名為rAdv-VPl，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6340。
10.權(quán)利要求9所述的重組腺病毒在制備診斷、預(yù)防或治療豬捷申病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達(dá)豬捷申病毒8型VP1蛋白的重組腺病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)VP1基因序列設(shè)計一對引物擴(kuò)增出VP1基因(SEQ ID NO.1所示)。將克隆獲得的VP1基因插入腺病毒穿梭載體中，獲得重組穿梭載體，經(jīng)Pme Ⅰ線性化后電轉(zhuǎn)化至攜帶有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌中，并在細(xì)菌內(nèi)發(fā)生同源重組產(chǎn)生含有VP1基因的重組腺病毒載體，經(jīng)Pac Ⅰ線性化，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，成功包裝出含VP1基因的重組腺病毒。將本發(fā)明的rAdv-VP1以肌肉注射途徑免疫3周齡仔豬，可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生特異體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并能抵抗現(xiàn)地分離株的攻擊，表明本發(fā)明的重組腺病毒rAdv-VP1可應(yīng)用于豬捷申病的防治。
文檔編號A61K48/00GK102757483SQ20121025750
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者崔尚金 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所