一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用。該中藥組合物是由連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁等藥味組成，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該中藥組合物可以破壞細(xì)菌生物被膜，有利于殺滅細(xì)菌，也可以提高普通抗生素的療效。
【專利說明】一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥組合物的新用途，具體地，涉及一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用，屬中藥應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]超過半數(shù)的感染性疾病都是由與人類息息相關(guān)的條件致病菌引起的，如金黃色葡萄球菌aureus, 51 a )和銅綠假單胞菌aeruginosa, P.a) 等，這些致病菌常能導(dǎo)致極為嚴(yán)重的慢性感染性疾病，不論是在生物材料相關(guān)的感染中，還是在其他的一些慢性感染性疾病如牙周炎及相關(guān)疾病、難治性呼吸道感染、前列腺炎等，都能發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞表面多聚物層層包繞的致病菌組成的膜狀物。這些膜狀物就是細(xì)菌生物被膜(Biofilm，BF)。據(jù)美國NIH的統(tǒng)計(jì)，約80%人類細(xì)菌感染性疾病是由BF的形成引起的， 雖然應(yīng)用各種抗感染藥，病原菌仍持續(xù)存在，導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染或感染反復(fù)發(fā)作，是臨床上一大難題。
[0003]BF是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境的一種生長方式，由于生物被膜的形態(tài)與正常菌落區(qū)別很大，且體外常規(guī)培養(yǎng)下生物被膜會(huì)消失，電鏡標(biāo)本的制作過程又易使這些含水份的多糖基質(zhì)壓縮，故人們很長時(shí)間未認(rèn)識(shí)生物被膜。1978年，才有人首先提出生物被膜的相關(guān)理論。 BF附著于組織或固體表面，由細(xì)菌分泌的胞外多糖復(fù)合物將自身克隆聚集包裹于其中而形成的一層膜樣物。BF中水份含量可高達(dá)97%，除了水和細(xì)菌外，BF還含有大分子多聚物，如蛋白質(zhì)，多糖，DNA, RNA，肽聚糖，脂和磷酯等，同時(shí)還 含有吸附的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。
[0004]BF具有極強(qiáng)的耐藥性及免疫逃避性，近年來人們針對(duì)BF形成的藥物滲透屏障，采取了聯(lián)合用藥方法，即用一種藥物破壞BF，另一種藥物進(jìn)入BF殺滅細(xì)菌。由于BF的頑固性，給藥劑量很難控制，如果用藥劑量低，不能完全去除BF，會(huì)誘導(dǎo)菌株的耐藥性，但是提高抗生素的用量又涉及藥物的毒性問題。
[0005]中國專利03143211.5公開了該中藥組合物具有抗病毒的作用，可應(yīng)用于流行性感冒，但該專利未提及該中藥組合物破壞細(xì)菌生物膜的作用。
[0006]本發(fā)明是在第03143211.5號(hào)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)發(fā)明，在此全文引用該專利文件記載的內(nèi)容。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明涉及一種中藥組合物的新用途，具體地，涉及一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所述中藥可以被有相同或相似功效的中藥代替，并且這些藥材均可按照 《全國中藥炮制規(guī)范》或《中藥大辭典》進(jìn)行炮制。
[0009]本發(fā)明目的是提供一種中藥組合物在制備治療破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用， 所述中藥組合物由如下重量份的原料藥制成:
連翹210-280，金銀花210-280，板藍(lán)根210-280，大黃45-55，廣藿香75-100，綿馬貫眾210-280,紅景天75-100，薄荷腦5.5-8.5，麻黃75-100，苦杏仁75-100，魚腥草210-280,甘草 75-100，石膏 210-280。
[0010]優(yōu)選地，該中藥組合物由如下重量份的原料藥制成:
連翹210，金銀花280，板藍(lán)根210，大黃55，廣藿香75，綿馬貫眾280，紅景天75，薄荷腦
8.5，麻黃75，苦杏仁100，魚腥草210，甘草100，石膏210。
[0011]或:
連翹280，金銀花210，板藍(lán)根280，大黃45，廣藿香100，綿馬貫眾210，紅景天75，薄荷腦5.5，麻黃100，苦杏仁75，魚腥草280，甘草75，石膏280。
[0012]或:
連翹258，金銀花258，板藍(lán)根258，大黃50，廣藿香88，綿馬貫眾258，紅景天88，薄荷腦
7.8，麻黃88，苦杏仁88，魚腥草258，甘草88，石膏258。
[0013]優(yōu)先地，所述中藥組合物所用原料藥中，麻黃可以為蜜麻黃，苦杏仁可以為炒苦杏仁。
[0014]本發(fā)明還提供了所述中 藥組合物的活性成分由以下步驟制成:
(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選；
(2)廣藿香碎斷，加5-10倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為 70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；
步驟(5)所得干膏粉、步驟(2)所得揮發(fā)油與薄荷腦共同構(gòu)成該中藥組合物的活性成分。
[0015]本發(fā)明藥物的劑型為膠囊劑、片劑、散劑、口服液、軟膠囊、丸劑、酊劑、糖漿劑、栓
劑、凝膠劑、噴霧劑或注射劑。
[0016]為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備這些劑型時(shí)加入藥學(xué)可接受的輔料，例如:填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)等。填充劑包括:淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括:淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括:硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括:糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括:甜味劑及各種香精；防腐劑包括:尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、 苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質(zhì)包括:PEG6000，PEG4000，蟲蠟等(范碧亭《中藥藥劑學(xué)》，上?？茖W(xué)出版社.1997年12月第I版.各劑型記載的輔料)。[0017]其中膠囊劑的制備方法，是由以下步驟制成:
(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選；
(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為 70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；
(6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；
(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝入膠囊，即得。
[0018]其中顆粒劑的制備方法，是由以下步驟制成:
(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為 70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；
(6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；
(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝袋，即得。
[0019]優(yōu)選的顆粒劑的制備方法為:
(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加6倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘?jiān)鼦壢ィ瑸V液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小時(shí)，第二次
1.5小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇,濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加9倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁、煎煮2次，第一次1.5小時(shí)，第二次I小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的水濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加95%乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏濾液；
(5)將步驟(4)所得清膏濾液與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.25-1.35的稠膏，備用；
(6)將步驟(5)所得稠膏加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；
(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝袋，即得。
[0020]本發(fā)明藥物的其他劑型按比例稱取原料藥后，采用常規(guī)的制備方法制備，例如，范碧亭《中藥藥劑學(xué)》(上?？茖W(xué)出版社1997年12月第I版)記載的制備工藝，制成藥劑學(xué)可接受的常規(guī)劑型。
[0021]該中藥組合物可以提高抗生素的抗菌療效，該中藥組合物可有效破壞細(xì)菌生物膜或者滲透入細(xì)菌生物膜殺滅細(xì)菌。
[0022]為證實(shí)本發(fā)明藥物組合物破壞細(xì)菌生物膜的作用效果，用按實(shí)施例1制得的膠囊劑 (以下稱本發(fā)明藥物)，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):
實(shí)驗(yàn)例1:本發(fā)明藥物破壞細(xì)菌生物膜的作用 1、材料和試劑
1.1 菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.a, ATCC 25923)。
[0023]1.2 藥物
本發(fā)明藥物(按照實(shí)施例1的方法制備)內(nèi)容物，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供， 每克含生藥9.78g，進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)時(shí)，配制浸膏粉濃度為12500ug/ml共10ml，靜止12小時(shí)后，取上清液，倍比稀釋，共10個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；注射用青霉素鈉，由華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。
[0024]1.3試劑與儀器
胰蛋白胨、酵母提取物(英國OXOID公司)，結(jié)晶紫(美國AMRESC0公司)，微生物活性檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability試劑盒(美國Molecular Probes公司)，戊二醛(上海化學(xué)試劑公司)，自動(dòng)洗板機(jī)(美國伯騰儀器有限公司)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，掃描電子顯微鏡(日本日立公司)。
[0025]2、試驗(yàn)方法
2.1最小抑菌濃度檢測:
將本發(fā)明藥物(200000 - 100ug/ml)和青霉素(2 - 0.001ug/ml)分別進(jìn)行倍比稀釋，加 A 96孔圓底培養(yǎng)板中，使板中的細(xì)菌濃度為0D600=0.05。將96孔板置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)，每孔取菌液，接種于LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，觀察無細(xì)菌生長的最小濃度即是藥物最小抑菌濃度。`
[0026]2.2藥物對(duì)S.a生物膜形成的影響:
觀察本發(fā)明藥物對(duì)S.a生物膜形成過程的作用，將本發(fā)明藥物(12500 - 24.4ug/ml)和青霉素(2 - 0.004ug/ml)分別用LB培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，加入96孔圓底培養(yǎng)板與細(xì)菌(細(xì)菌濃度為0D600=0.05)混合，陰性對(duì)照加入相同體積的LB培養(yǎng)液，終體積200ul，每個(gè)濃度 4個(gè)復(fù)孔，置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。用0.01M的PBS緩沖液清洗2次，去掉懸浮細(xì)菌。生物膜內(nèi)所有的物質(zhì)及活細(xì)菌數(shù)量分別通過結(jié)晶紫(Crastal Violet, CV)及WST染色法對(duì)每孔細(xì)菌生物膜的生物量進(jìn)行測定。
[0027]2.3藥物對(duì)成熟S.a生物膜的影響:
成熟S.a生物膜的培養(yǎng):將S.a用含葡萄糖的LB培養(yǎng)液稀釋至0D600=0.05，加入96孔圓底培養(yǎng)板，每孔200ul，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，形成S.a生物膜。
[0028]棄培養(yǎng)基，洗去懸浮細(xì)菌，將本發(fā)明藥物(12500 - 24.4ug/ml)和青霉素(20 -
0.04ug/ml)分別用含葡萄糖的LB培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，加入96孔板，陰性對(duì)照加入相同體積含葡萄糖的LB培養(yǎng)液，每孔200ul，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。用0.01M 的PBS緩沖液清洗2次，去掉懸浮細(xì)菌。利用CV染色和WST檢測方法對(duì)每孔細(xì)菌生物膜的生物量進(jìn)行測定。
[0029]2.4用掃描電子顯微鏡觀察藥物對(duì)S.a生物膜的影響:
藥物對(duì)S.a生物膜形成的影響:本發(fā)明藥物(濃度12500ug/ml浸膏粉上清倍比稀釋)和青霉素(終濃度2ug/ml)分別與細(xì)菌(細(xì)菌濃度為0D600=0.05)混合，共培養(yǎng)于24孔板，陰性對(duì)照加入相同體積的LB培養(yǎng)液，終體積500ul，置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。
[0030]藥物對(duì)成熟S.a生物膜的影響:將S.a用含葡萄糖的LB培養(yǎng)液稀釋至 0D600=0.05，加入24孔培養(yǎng)板，每孔500ul，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，形成S.a生物膜。棄上層培養(yǎng)基，洗去懸浮細(xì)菌，將本發(fā)明藥物(12500ug/ml)和青霉素(20ug/ml)分別用含葡萄糖的 LB培養(yǎng)液稀釋，加入有成熟細(xì)菌生物膜的24孔板中，空白對(duì)照加入相同體積含葡萄糖的LB 培養(yǎng)液，每孔500ul，置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。
[0031]各樣本經(jīng)2.5%戊二醛固定，乙醇逐級(jí)脫水，真空冷凍干燥、噴金，掃描電子顯微鏡下拍照觀察。
[0032]用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物對(duì)S.a生物膜的影響
藥物對(duì)S.a生物膜形成的影響:本發(fā)明藥物(終濃度12500ug/ml浸膏粉上清倍比稀釋) 和青霉素(終濃度2ug/ml)分別與細(xì)菌(細(xì)菌濃度為0D600=0.05)混合，共培養(yǎng)于35mm的小皿中，陰性對(duì)照加入相同體積的LB培養(yǎng)液，終體積2000ul，置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。
[0033]藥物對(duì)成熟S.a生物膜的影響:將S.a用含葡萄糖的LB培養(yǎng)液稀釋至 0D600=0.05，接種于35mm的小皿中，每孔2000ul，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，形成S.a生物膜。棄上層培養(yǎng)基，洗去懸浮細(xì)菌，將本發(fā)明藥物(12500ug/ml)和青霉素(20ug/ml)分別用含葡萄糖的LB培養(yǎng)液稀釋，加入有成熟細(xì)菌生物膜的小皿中，空白對(duì)照加入相同體積含葡萄糖的 LB培養(yǎng)液，每孔2000ul，置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。
[0034]各樣本用LIVE/DEAD? BacLight.Bacterial Viability Kits 染色,直接用共焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0035]2.6本發(fā)明藥物與抗生素的協(xié)同作用
將本發(fā)明藥物(200000 - 100ug/ml)和青霉素(2 - 0.001ug/ml)分別進(jìn)行倍比稀釋，按照藥物濃度從高到低，同時(shí)加入本發(fā)明藥物和青霉素至96孔圓底培養(yǎng)板中，使板中的細(xì)菌濃度為0D600=0.05，同時(shí)進(jìn)行二者單獨(dú)的抑菌試驗(yàn)和空白對(duì)照。將96孔板置于37°C培養(yǎng) 24小時(shí)，每孔取菌液，接種于LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，觀察無細(xì)菌生長的最小濃度既是二者協(xié)同作用的最小抑菌濃度。
[0036]3 結(jié)果
3.1本發(fā)明藥物對(duì)S.a最小抑菌濃度本發(fā)明藥物最小抑菌濃度為100mg/ml,青霉素最小抑菌濃度為2ug/ml。
[0037]3.2本發(fā)明藥物對(duì)S.a生物膜形成的影響
圖1示，CV染色本發(fā)明藥物(12500-781.25ug/ml)和青霉素(2_0.125ug/ml)可以抑制S.a生物膜的形成。圖2示，WST檢測本發(fā)明藥物(12500-1562.5ug/ml)和青霉素 (2-0.25ug/ml)可以減少形成金黃色葡萄球菌生物膜的活細(xì)菌數(shù)量。
[0038]3.3用掃描電鏡觀察藥物對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響
掃描電鏡圖片顯示，對(duì)照組有大量細(xì)菌密集疊加在一起，細(xì)菌形態(tài)正常，表面光滑，大小基本一致(圖3A);本發(fā)明藥物組細(xì)菌量較少，大小形態(tài)不一致，半數(shù)以上細(xì)胞腫脹，直徑增大，個(gè)別細(xì)菌塌陷萎縮(圖3B);青霉素組，細(xì)菌雖然數(shù)量較少，但大小形態(tài)規(guī)則，直徑基本一致(圖3C)。
[0039]3.4用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響
共聚焦顯微鏡圖片顯示，空白對(duì)照組形成細(xì)菌生物膜，細(xì)菌生物膜主要以活菌為主體， 其間散落死菌(或休眠細(xì)菌)；本發(fā)明藥物組和青霉素組，有少量細(xì)菌量散落分布，主要以死菌為主，活菌散落其間(見圖4)。
[0040]3.5藥物對(duì)成熟S.a生物膜的作用
圖5示，本發(fā)明藥物(12500-781.25ug/ml)可以顯著減少S.a生物膜的總的生物量(圖
5),而青霉素對(duì)成熟細(xì)菌生物膜作用不明顯。本發(fā)明藥物(12500-1562.5ug/ml)可以減少
S.a生物膜的活細(xì)菌數(shù)量(圖6)，而青霉素對(duì)生物膜作用不明顯。
[0041]3.6用掃描電鏡觀察藥物對(duì)成熟細(xì)菌生物膜的影響
掃描電鏡圖片顯示，空白對(duì)照組有大量細(xì)菌密集疊加在一起，細(xì)菌形態(tài)正常，表面光滑，大小基本一致(圖7A);本發(fā)明藥物組有散在細(xì)菌菌落存在，大小形態(tài)不一致，多數(shù)細(xì)菌腫脹破裂，直徑明顯增大(圖7B);青霉素組有大量細(xì)菌密集疊加在一起，細(xì)菌形態(tài)正常，個(gè)別細(xì)菌塌陷萎縮，但大體正常(圖7C)。
[0042]3.7用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響
共聚焦顯微鏡圖片顯示(綠色表示活菌、紅色表示死菌)，空白對(duì)照組細(xì)菌生物膜正常， 細(xì)菌生物膜主要以活菌為主體，其間散落死菌(或休眠細(xì)菌)；本發(fā)明藥物組細(xì)菌生物膜厚度顯著降低，死菌和活菌相互參雜，有大量死菌存在于膜內(nèi)；青霉素組細(xì)菌生物膜未見顯著下降，以活菌為主，活菌分布在細(xì)菌生物膜上層(圖8)。
[0043]3.8 二者的協(xié)同作用
測試結(jié)果，當(dāng)本發(fā)明藥物為12500ug/ml,青霉素濃度為0.125ug/ml時(shí)即可表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，二者單獨(dú)在此濃度時(shí)并沒有抑菌作用，可見本發(fā)明藥物對(duì)抗生素具有提高療效的作用，原因與本發(fā)明藥物可有效破壞細(xì)菌生物膜，使抗生素的藥效可直達(dá)細(xì)菌體而產(chǎn)生抗菌作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1本發(fā)明藥物和青霉素對(duì)S.a生物膜形成的作用(CV染色)；與對(duì)照組比較，
林*P〈0.001。
[0045]圖2本發(fā)明藥物和青霉素對(duì)S.a生物膜形成的作用(WST檢測)；與對(duì)照組比較， *P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.0Olo[0046]圖3用掃描電鏡觀察藥物對(duì)細(xì)菌生物膜一廂形成的影響(X500，10kv)。
[0047]圖4用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響(X100 oil)。
[0048]圖5本發(fā)明藥物和青霉素對(duì)成熟S.a生物膜的作用(CV染色)；與對(duì)照組比較， *P〈0.05, **P〈0.01。
[0049]圖6本發(fā)明藥物和青霉素對(duì)成熟S.a生物膜的作用(WST染色)與對(duì)照組比較，
林*P〈0.001。
[0050]圖7用掃描電鏡觀察藥物對(duì)成熟細(xì)菌生物膜影響(X500，10kv)。
[0051]圖8用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物對(duì)成熟細(xì)菌生物膜的影響(XIOOoil)。
【具體實(shí)施方式】
[0052]實(shí)施例1:
原料藥配方為:
連翹258g，金銀花258g，板藍(lán)根258g，大黃50g，廣藿香88g，綿馬貫眾258g，紅景天 88g,薄荷腦7.8g,麻黃88g,苦杏仁88g,魚腥草258g,甘草88g，石膏258g ；
制備方法為:
(1)按照上述處方稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加6倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘?jiān)鼦壢?，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小時(shí)，第二次
1.5小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇,濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加9倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次1.5小時(shí)，第二次I小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置24小時(shí)，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，噴霧干燥，得干膏粉，備用；
(5)將步驟(4)所得干膏粉加入淀粉138克，用85%乙醇制粒；
(6)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(5)所得顆粒，密閉，混勻，裝入1000粒膠囊，即得。
[0053]實(shí)施例2:
原料藥配方為:
連翹210g，金銀花280g，板藍(lán)根210g，大黃55g，廣藿香75g，綿馬貫眾280g，紅景天 75g,薄荷腦8.5g,麻黃75g,苦杏仁100g,魚腥草210g,甘草100g,石膏210g ;
制備方法為:
(1)按照上述處方 稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加5倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘?jiān)鼦壢?，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6倍量50%的乙醇提取2次，第一次3小時(shí)，第二次I 小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次0.5小時(shí)，第二次2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置24小時(shí)，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，噴霧干燥，得干膏粉，備用；(5)將步驟(4)所得干膏粉加入淀粉134克，用85%乙醇制粒；
(6)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(5)所得顆粒，按常規(guī)制劑方法制成片劑即得。
[0054]實(shí)施例3:
原料藥配方為:
連翹280g，金銀花210g，板藍(lán)根280g，大黃45g，廣藿香100g，綿馬貫眾210g，紅景天 75g,薄荷腦5.5g,麻黃100g,苦杏仁75g,魚腥草280g,甘草75g,石膏280g ；
制備方法為:
(1)按照上述處方稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加10倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘?jiān)鼦壢?，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用10倍量90%的乙醇提取2次，第一次I小時(shí)，第二次 3小時(shí),提取液合并過濾,回收乙醇,濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次2.5小時(shí)，第二次0.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置24小時(shí)，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，噴霧干燥，得干膏粉，備用；
(5)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(4)所得干膏粉，按常規(guī)制劑方法制成丸劑即得。
[0055]實(shí)施例4:
原料藥配方為:
連翹170g，金銀花170g，炙麻黃57g，炒苦杏仁57g，石膏170g，板藍(lán)根170g，綿馬貫眾 170g,魚腥草170g,廣藿香57g,大黃34g,紅景天57g,薄荷腦5.0g,甘草57g ；
制備方法:
(一)提取工藝:
(1)按照上述處方量稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香加6倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4h，收集揮發(fā)油，出油率為0.33±0.05%， 提取液過濾后備用，殘?jiān)鼦壢ィ?br> (3)連翹、炙麻黃、魚腥草、大黃，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小時(shí)，第二次
1.5小時(shí)，提取液過濾，濾液合并，回收乙醇至無醇味,備用；
(4)金銀花、炒苦杏仁、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加9倍量水煎煮至沸， 加入炒苦杏仁，煎煮2次，第一次1.5小時(shí)，第二次I小時(shí)，提取液過濾，濾液合并同時(shí)加入步驟(2)廣藿香提油后的水溶液，濃縮成60°C測定相對(duì)密度為1.10-1.15清膏，加95%乙醇，邊加邊攪拌，至醇濃度70%，冷藏放置24小時(shí)，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，與醇提液合并，濃縮至濃縮成60°C測定相對(duì)密度為1.25-1.35稠膏，備用；
(二)制劑工藝:
(5)制劑配方為:步驟(4)所得稠膏335.5g，薄荷腦5g，步驟(2)所得廣藿香油0.2ml, 糖粉 342.58，糊精514.0g；
(6)制粒:將糖粉和糊精混合均勻，用稠膏作粘合劑制軟材，14目篩網(wǎng)制粒，60—65°C 烘干，10目篩網(wǎng)整粒；
(7)分裝:篩出細(xì)粉適量，將薄荷腦、廣藿香揮發(fā)油加入適量乙醇，溶解，噴入細(xì)粉中， 混合均勻，并與顆?；旌暇鶆?，密閉半 小時(shí)，裝袋，即得，以上處方可制成顆粒1000g。
【權(quán)利要求】
1.一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用，其特征在于該中藥組合物由下列重量份的原料藥制成:連翹210-280，金銀花210-280，板藍(lán)根210-280，大黃45-55，廣藿香75-100，綿馬貫眾 210-280,紅景天75-100，薄荷腦5.5-8.5，麻黃75-100，苦杏仁75-100，魚腥草210-280,甘草 75-100，石膏 210-280。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于該中藥組合物由下列重量份的原料藥制成: 連翹210，金銀花280，板藍(lán)根210，大黃55，廣藿香75，綿馬貫眾280，紅景天75，薄荷腦8.5，麻黃75，苦杏仁100，魚腥草210，甘草100，石膏210。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于該中藥組合物由下列重量份的原料藥制成:連翹280，金銀花210，板藍(lán)根280，大黃45，廣藿香100，綿馬貫眾210，紅景天75，薄荷腦5.5，麻黃100，苦杏仁75，魚腥草280，甘草75，石膏280。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于該中藥組合物由下列重量份的原料藥制成:連翹258，金銀花258，板藍(lán)根258，大黃50，廣藿香88，綿馬貫眾258，紅景天88，薄荷腦7.8，麻黃88，苦杏仁88，魚腥草258，甘草88，石膏258。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述中藥組合物的活性成分由以下步驟制成:(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選；(2)廣藿香碎斷，加5-10倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為 70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；步驟(5)所得干膏粉、步驟(2)所得揮發(fā)油與薄荷腦共同構(gòu)成該中藥組合物的活性成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物劑型為膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、口服液、丸劑、酊劑、糖漿劑、栓劑、凝膠劑、噴霧劑或注射劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述膠囊劑是由以下步驟制成:(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選；(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為 70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；(6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝入膠囊，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述顆粒劑是由以下步驟制成:(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為 70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用 ；(6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝袋，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述顆粒劑是由以下步驟制成:(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；(2)廣藿香碎斷，加6倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘?jiān)鼦壢?，濾液備用；(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小時(shí)，第二次 1.5小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇,濾液備用；(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加9倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁、煎煮2次，第一次1.5小時(shí)，第二次I小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的水濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加95%乙醇， 調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏濾液；(5)將步驟(4)所得清膏濾液與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.25-1.35的稠膏，備用；(6)將步驟(5)所得稠膏加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝袋，即得。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一·項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述中藥組合物在制備提高抗生素療效的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K9/48GK103566006SQ201210267111
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月31日
【發(fā)明者】王宏濤, 魏聰, 安軍永, 張會(huì)欣, 秦?cái)n, 李向軍, 王永, 王猛, 王超 申請(qǐng)人:北京以嶺藥業(yè)有限公司