一種重組細(xì)菌素及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組細(xì)菌素及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種重組細(xì)菌素 LacAB及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌素的定義最早是在1953年由Jocob提出（JackRW，TaggJR，Ray B.Bacteriocinsofgram-positivebacteria.MicrobiolRev，1995,59 :171-200.)， 目前，文獻(xiàn)和研宄團(tuán)體采納的細(xì)菌素定義是：細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體產(chǎn)生的具 有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白類復(fù)合物，對(duì)親源關(guān)系較近的細(xì)菌有抑制作用，可以 殺滅或抑制與之相似生境的微生物，產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株具有自身特異免疫性不會(huì)殺害 產(chǎn)生菌G)attaV，MyskowskiSM，KwinnLA，ChiemDN，VarkiN，KansalRG，KotbM， NizetV.MutationalanalysisofthegroupAstreptococcaloperonencoding streptolysinSanditsvirulenceroleininvasiveinfection.MolMicrobiol， 2005,56 :681_695 ;Bowdish，D.M.，Davidson，D.J.Hancock，R.E.Are-evaluationof theroleofhostdefencepeptidesinmammalianimmunity.Curr.ProteinPept. Sci.，2005,6 :35 ~51；DeeganLH.，CotterP.D. ?HillC.，etal.Bacteriocins： Biologicaltoolsforbio-preservationandshelf-lifeextension.International DairyJournal.4thNIZODairyConference-ProspectsforHealth，Well-beingand Safety，2006，16:1058-1071.)。細(xì)菌素具有多樣性，目前研究較廣泛的是ClassIIa 和ClassIIb(Cotter，P.D.，Hill，C.，Ross，R.P..Bacteriocins:Developinginnate immunityforfood.NatureReviewsMicrobiology，2005,3:777-788.)，其中ClassIIb 細(xì)菌素是由兩個(gè)不同的肽組成的細(xì)菌素，最佳的抑菌活性是兩個(gè)肽同時(shí)存在的情況下。這 兩個(gè)肽預(yù)先合成一個(gè)N-端包含15-30個(gè)氨基酸前導(dǎo)序列的雙甘氨酸模型，并被C-端兩個(gè) 甘氨酸裂開，通過特定ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使細(xì)菌素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Ha°varsteinLS，DiepDB，Nes IF.AfamilyofbacteriocinABCtransporterscarryoutproteolyticprocessing oftheirsubstratesconcomitantwithexport.MolMicrobiol1995,16 :229_240.)〇 前導(dǎo)序列促進(jìn)特定的ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也有保持細(xì)菌素活性的功能直到細(xì)菌素分泌。編 碼兩個(gè)肽預(yù)先形成的基因和編碼免疫蛋白的基因在相同操縱子，免疫蛋白保護(hù)產(chǎn)生細(xì)菌 素的菌株不被自身細(xì)菌素殺死（Nissen-MeyerJ，RogneP，Oppega°rdC，HaugenHS， KristiansenPE.Structure-functionrelationshipsofnon-lanthioninecontaining peptide(classII)bacteriocinsproducedbygrampositivebacteria.CurrPharm Biotechnol. 2009,10 :19_37 ;0ppega〇rdC，RogneP，EmanuelsenL，KristiansenPE， FimlandG?Nissen-MeyerJ.Thetwo-peptideclassIIbacteriocins:structure， production，andmodeofaction.JMolMicrobiolBiotechnol. 2007,13 :210_219.) 〇 對(duì)于一些細(xì)菌素，操縱子也包括編碼特定的ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因并稱作輔助蛋白。編碼 ClassIIb細(xì)菌素基因至少需要有4個(gè)不同基因：編碼前導(dǎo)序列基因，特定的免疫基因，編 碼ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，細(xì)菌素表觀形成的附屬蛋白基因（Klaenhammer，T.R.Genetics ofbacteriocinsproducedbylacticacidbacteria.FEMSMicrobiolRev. 1993,12， 39-85.) 〇
[0003] 由于細(xì)菌素的抗菌活性能抑制食物傳染的致病菌和食品腐敗菌，因此乳酸菌細(xì)菌 素得到廣泛研宄。過去我們主要研宄的是遺傳基因、分子特性、生物合成的調(diào)節(jié)、抑菌譜等。 在研宄中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素的產(chǎn)量是一個(gè)值得關(guān)注的問題，在醫(yī)藥細(xì)菌素可以作為替代抗生素的 替代品，在食品工業(yè)中可作為天然防腐劑。然而細(xì)菌素的產(chǎn)量很低，研宄較深入的nisin和 pediocin，經(jīng)發(fā)酵過程的優(yōu)化，產(chǎn)量最大值在100-200mg/L。分離和純化來自于發(fā)酵上清液 中的細(xì)菌素需要很多復(fù)雜步驟，浪費(fèi)時(shí)間，結(jié)果蛋白產(chǎn)量也很低。因此，研宄和建立高穩(wěn)定 的細(xì)菌素重組表達(dá)體系成為必然的選擇。近年來，通過一些異源表達(dá)系統(tǒng)提高細(xì)菌素的產(chǎn) 量和純化，需要不同宿主以獲得高產(chǎn)量的重組蛋白產(chǎn)物，例如乳酸菌、大腸桿菌和酵母菌。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)便穩(wěn)定，但對(duì)于重組細(xì)菌素蛋白翻譯后修飾不完全，因此會(huì)影響重組 細(xì)菌素的活性。
[0004] 在大腸桿菌中表達(dá)的細(xì)菌素基因大部分以融合蛋白形成存在增強(qiáng)其穩(wěn)定性。融 合蛋白的表達(dá)方法是通過在細(xì)菌素基因的N-端連接一段易于在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白序 列，表達(dá)出的融合蛋白不會(huì)對(duì)宿主菌產(chǎn)生傷害，有效提高目的基因的表達(dá)水平。廣泛應(yīng)用的 表達(dá)載體有pGEX、pQE和pET等系列，pGEX載體具有高效表達(dá)融合蛋白的能力，受內(nèi)源基因 laclq的調(diào)控，laclq的表達(dá)產(chǎn)物與啟動(dòng)子tac結(jié)合阻止蛋白質(zhì)的表達(dá)，因此pGEX載體中 的插入片段受啟動(dòng)子tac控制。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST)是pGEX載體連接的常用的融合蛋 白表達(dá)載體，分子量較大需要用凝血酶或Xa-因子切除，獲得目的蛋白。GST作為蛋白識(shí)別 標(biāo)簽可保護(hù)重組蛋白不受外界蛋白酶的降解，增加目的蛋白的可溶性，提高表達(dá)的穩(wěn)定性。 實(shí)現(xiàn)重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中高效表達(dá)，合適的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度、IPTG濃度、pH、 培養(yǎng)時(shí)間等）對(duì)于發(fā)揮其潛在的活性具有重要意義。研宄發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌最適生長(zhǎng)溫度為 37°C，在此溫度下極易形成包涵體，降低溫度可增加重組蛋白的表達(dá)量。培養(yǎng)基成分可以抑 制菌體過快生長(zhǎng)，從而降低包涵體的形成量。然而經(jīng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)得到無活性的重組 蛋白，其原因一方面為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中重組蛋白的二硫鍵的缺失，影響蛋白的正確折 疊，使重組蛋白失去活性，趙愛珍（2011)通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EnterocinA重組突 變體，證明二硫鍵為EnterocinA活性的重要影響因素。另一方面為大腸桿菌系統(tǒng)中重組 細(xì)菌素蛋白經(jīng)翻譯后無法得到酰胺化修飾影響其活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種重組細(xì)菌素LacAB基因；
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種包含重組細(xì)菌素LacAB基因的重組表達(dá)載體 pGEX-4T-l-LacAB及其構(gòu)建方法；
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種重組細(xì)菌素LacAB的制備方法；
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種重組細(xì)菌素LacAB的用途。
[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0010] 一種重組細(xì)菌素LacAB基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0011] 含有該核苷酸序列的重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-LacAB也當(dāng)然屬于本發(fā)明的保護(hù) 范疇之內(nèi)。以及
[0012] 含有該重組表達(dá)載體pGEX-4T-l_LacAB的宿主細(xì)胞也當(dāng)然屬于本發(fā)明的保護(hù)范 疇之內(nèi)，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌T0P10, DH5 a和BL21。
[0013] 構(gòu)建所述重組表達(dá)載體pGEX-4T-l_LacAB的方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0014] (1)以干酪乳桿菌基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增得到ClassIIb細(xì)菌素 基因的兩段片段，分別為ClassIIb-LacA片段和ClassIIb-LacB片段；
[0015] (2)根據(jù)步驟（1)獲得的細(xì)菌素基因ClassIIb-LacA序列和ClassIIb-LacB序 列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異引物采用重疊PCR方法擴(kuò)增LacAB重組基因序列，擴(kuò)增得到的 LacAB基因產(chǎn)物與同樣酶切的pMD18-T載體連接；
[0016] (3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliT0P10,菌落PCR鑒定陽性克隆，陽 性克隆經(jīng)酶切驗(yàn)證和測(cè)序，得到pMD18-T-LacAB重組克隆載體；
[0017] (4)將pMD18-T-LacAB重組克隆載體與表達(dá)載體pGEX-4T-l用EcoRI和SalI 限制性內(nèi)切酶雙酶切，pMD18-T-LacAB重組克隆載體的酶切產(chǎn)物L(fēng)acAB克隆到pGEX-4T-l 載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-LacAB，重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 E.coliTOPIO,菌落PCR鑒定陽性克隆，陽性克隆經(jīng)酶切驗(yàn)證和測(cè)序，得到pGEX-4T-l-LacAB 重組表達(dá)載體。
[0018] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)中擴(kuò)增LacA片段的特異性引物的核苷酸序列如SEQ IDN0:2和SEQIDN0:3所示；擴(kuò)增LacB片段的特異性引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 4和SEQIDN0:5所示；所述酶切產(chǎn)物L(fēng)acAB與pGEX-4T-l載體按照摩爾比3 : 1進(jìn)行混 合，16°C金屬浴過夜連接。
[0019] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（2)中擴(kuò)增LacA片段的特異性引物P1/P2的核苷酸序 列分別如SEQIDN0:6和SEQIDN0:7所示；擴(kuò)增LacB片段的特異性引物P3/P4的核苷 酸序列如SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示，且LacA下游引物P2的3'端與LacB的上游 引物P3的5'端有15個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)；所述重疊PCR方法的具體步驟：第一步，分別以P1/ P2、P3/P4為引物，ClassIIb-LacA基因和ClassIIb-LacB基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得 彼此互補(bǔ)配對(duì)的粘性末端的LacA和LacB;第二步，以P1/P4為引物，LacA/LacB模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得重組細(xì)菌素基因LacAB。
[0020] 一種制備重組細(xì)菌素LacAB的方法，其特征在于，將含有重組表達(dá)載體 pGEX-4T-l-LacAB的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，收集菌液，提取菌液中的重 組蛋白，得到的重組蛋白溶液通過GST純化柱，GST標(biāo)簽和柱子上的GST親和蛋白結(jié)合，通 過洗脫液得到純化的GST-LacAB蛋白，用凝血酶切除GST標(biāo)簽后，用GST純化試劑盒純化， 得到單一的重組細(xì)菌素LacAB。
[0021] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，具體包括以下步驟：
[0022] (l)pGEX-4T-l_LacAB重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)
[0023] 將含有重組表達(dá)載體pGEX-4T-l-LacAB的大腸桿菌BL21于含100mg/LAmp的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，按照1 : 50 (V/V)的比例轉(zhuǎn)接到含100mg/LAmp的LB液體培養(yǎng)基中， 以200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2~3h，菌液0D600達(dá)到0. 6~1. 0時(shí)，按濃度0. 2~1. 2mmol/L加入 IPTG誘導(dǎo)1~5h，5000rpm離心10min，獲得菌體培養(yǎng)物；
[0024] (2)重組蛋白的提取
[0025] 在收集的菌體中加入細(xì)菌裂解液。4°C裂解lOmin，12000rpm離心5min，取上清液， 上清液與2XSDSPAGEloadingbufferl: 1混合。用漩渦器劇烈振蕩，確保將管底沉淀 振散，將樣品于100°C恒溫加熱器上開蓋加熱lOmin。樣品涼后，12000r/min離心3min，樣 品-80 °C保存待用或直接上樣；
[0026]所述細(xì)菌裂解液含有 50mMTris-HCl(pH8. 5 ~9. 0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0. 5 % TritonX-100,lmg/mL溶菌酶；
[0027] (3)重組蛋白的純化
[0028] 將樣品與GSH-S印harose 4B懸液混合，室溫作用lOmin，GST標(biāo)簽和柱子上的GST 親和蛋白結(jié)合，收集洗脫液，得到純化的GST-LacAB蛋白；
[0029] (4)重組蛋白的酶切
[0030] 按100ug的GST-LacAB蛋白加入1單位的凝血酶常溫反應(yīng)16h，使酶切程度達(dá)到 90%以上；
[00