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      一種非洲豬瘟抗原及其制備的熒光納米晶試紙條的制作方法

      文檔序號:6244480閱讀:484來源:國知局
      一種非洲豬瘟抗原及其制備的熒光納米晶試紙條的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種非洲豬瘟重組抗原及利用其制備的非洲豬瘟抗體檢測熒光納米晶試紙條。本發(fā)明利用基因工程的方法,獲得非洲豬瘟病毒的特異性結(jié)構(gòu)蛋白VP73蛋白作為重組抗原,其基因序列如序列表所示。將純化后的VP73蛋白劃線包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線,同樣將兔抗金黃色葡萄球菌A多抗劃線包被作為質(zhì)控線,與用熒光納米晶標記SPA制備試紙條的標記物釋放墊裝配成,獲得本發(fā)明的熒光納米晶試紙條。本發(fā)明可用于檢測豬血清中的非洲豬瘟抗體,具有特異性強、靈敏度高、重復性好、簡便快捷的特點,便于現(xiàn)場使用,對我國應對非洲豬瘟的威脅有實際應用價值。
      【專利說明】一種非洲豬瘟抗原及其制備的熒光納米晶試紙條

      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明涉及動物病毒抗體檢測領域檢測領域,特別是涉及一種用于非洲豬瘟病毒 抗原蛋白和利用該抗原蛋白制備的非洲豬瘟病毒抗體的快速檢測熒光納米晶試紙條。

      【背景技術】
      [0002] 非洲豬癌(African swine fever,ASF)是由非洲豬癌病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一種嚴重危害豬及野豬的動物傳染病,其病程短,死亡率高達 100%。該病屬于世界動物衛(wèi)生組織(0ΙΕ)要求法定報告的動物疫病,在我國動物病原微生 物名錄中列為一類動物疫病。目前,全球已有49個國家報道曾經(jīng)發(fā)生或仍有非洲豬瘟流 行,主要集中在非洲、歐洲、美洲和歐亞接壤地區(qū),尤其是2007年以來非洲豬瘟先后在格魯 吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯、烏克蘭、白俄羅斯等國暴發(fā),造成巨大的經(jīng)濟損失,也嚴 重威脅我國的養(yǎng)豬業(yè)。目前,我國雖然還沒有發(fā)現(xiàn)ASF疫情,但根據(jù)周邊國家的發(fā)病情況, 我國已面臨ASFV傳入和流行的嚴重威脅,一旦發(fā)病,由于無有效的疫苗和藥物可以預防和 治療,將造成巨大的經(jīng)濟損失,甚至會對我國養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性打擊。由于沒有有效的疫 苗,檢測技術是目前監(jiān)測和控制非洲豬瘟的有效方法。因此,為了有效地防制非洲豬瘟病毒 傳入我國,及時準確地掌握進出境貿(mào)易中疫情疫病狀況,迫切需要發(fā)明特異性強、靈敏度高 的現(xiàn)場快速檢測試紙條,應用于受威脅地區(qū)的監(jiān)測工作中,其具有重要的現(xiàn)實與實踐意義。
      [0003] 檢測非洲豬瘟的方法包括抗原檢測方法和抗體檢測方法,由于我國還未有該病 的發(fā)生,檢測抗原的方法難以驗證,故不具有現(xiàn)實意義。而檢測非洲豬瘟抗體則具有重要 意義,且其不存在疫苗免疫抗體的干擾。ASFV整個基因組含有160?175個開放閱讀框 (0RF),編碼150?200種蛋白質(zhì)。其中VP73蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,病毒離子20面體 衣殼的重要組成部分,產(chǎn)生與病毒感染的晚期,約占整個病毒粒子蛋白的32%。VP73蛋白 在ASFV結(jié)合和進入易感細胞的過程中有很重要的作用。ASFV大多數(shù)分離毒株免疫原性很 低,只有少數(shù)幾個蛋白具有免疫原型。研究表明,不同區(qū)域ASFV分離株誘導產(chǎn)生的抗VP73 蛋白抗體的相應抗原表位都相當保守。VP73蛋白免疫原性很穩(wěn)定,可以被用來作為血清學 檢測和免疫制劑。
      [0004] 目前,國外檢測非洲豬瘟抗體的方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接熒光抗體試驗、 免疫印跡試驗和對流免疫電泳試驗等,但這些方法均需要在專業(yè)實驗室中開展,不能滿足 現(xiàn)場快速檢測的實際工作需要。免疫層析技術自問世以來,得到了迅速發(fā)展,已廣泛應用 于生物檢測【技術領域】,特別是膠體金免疫層析技術具有操作簡單、結(jié)果清楚、易于判斷和保 存、無需任何儀器設備等優(yōu)點,適合于臨床的快速檢測和基層、農(nóng)村等流行病學調(diào)查,但是 其也存在檢測靈敏度低的不足。
      [0005] 高特性熒光納米晶的制備及其在免疫檢測中的應用是目前十分活躍的前沿研究 領域。將熒光納米晶新型標記材料引入到免疫層析試紙條中,通過熒光信號來得出檢測結(jié) 果,可以克服膠體金試紙條靈敏度不足的缺點。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術的不足,提供一種具有敏感性高、特異性強、檢 測快速、操作方便非洲豬瘟病毒抗體的快速檢測熒光納米晶試紙條。
      [0007] 本發(fā)明包括一種非洲豬瘟病毒重組抗原,其制備方法包括以下步驟:
      [0008] a)根據(jù)非洲豬瘟病毒VP73基因序列人工設計并合成該抗原表位的重組基因
      [0009] 序列,所述如序列表SeqlDNo. 1所示;
      [0010] b)將該序列克隆至載體中,用PCR方法擴增該片段;
      [0011] c)將步驟b)獲得的PCR產(chǎn)物,并與線性載體連接,構(gòu)建重組表達載體;
      [0012] d)將重組表達載體導入原核表達體系,誘導蛋白表達;
      [0013] e)對表達產(chǎn)物進行純化后獲得所述非洲豬瘟的重組抗原。
      [0014] 進一步的,步驟d)中,最佳誘導劑及濃度為IPTG1. Ommol/L,最佳誘導時間為3h。
      [0015] 進一步的,步驟b)中,用于所述重組基因序列特異性擴增的PCR引物為:
      [0016] PI:TAGATCCATGGCTTCTGGTGGCGCGTT
      [0017] P2:ATTCTCGAGGTCGACTTAGTGATGG,
      [0018] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括所述的非洲豬瘟病毒重組抗原,在制備用于檢測非洲豬瘟病 毒抗體的試劑中的應用。
      [0019] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種非洲豬瘟抗體檢測熒光納米晶試紙條,包括:依次連接 并固定于PVC襯板上樣品墊、熒光納米晶標記物釋放墊、包被權利要求1所述非洲豬瘟病毒 抗原作為檢測線和兔抗金黃色葡萄球菌A多克隆抗體作為質(zhì)控線的硝酸纖維素膜以及吸 水墊。
      [0020] 進一步的,所述標記結(jié)合物釋放墊為噴有標記物的玻璃纖維膜,所述標記物為金 黃色葡萄球菌A蛋白標記熒光納米晶。
      [0021] 進一步的,所述硝酸纖維素膜上的檢測線位于靠近所述標記物釋放墊的一端,所 述硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線位于靠近所述吸水墊的一端,所述質(zhì)控線與所述檢測線的垂直 距離為4mm?7mm。
      [0022] 進一步的,所述非洲豬瘟病毒抗原包被濃度為1. 5mg/mL,所述兔抗金黃色葡萄球 菌A多克隆抗體包被濃度為1. 5mg/mL。
      [0023] 本發(fā)明的非洲豬瘟抗體檢測熒光納米晶試紙條的有益效果在于特異性好、靈敏度 高、簡便快捷,主要是通過采用非洲豬瘟病毒主要免疫原性結(jié)構(gòu)蛋白VP73作為檢測抗原獲 得良好的檢測特異性、采用熒光納米晶標記材料獲得高靈敏度、采用免疫層析試紙條技術 使得檢測過程簡便快捷。
      [0024] 與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明具有可現(xiàn)場操作、檢測快速、結(jié)果清晰易于判讀,且無需 專業(yè)儀器設備等優(yōu)點,適合于非洲豬瘟抗體的快速檢測和基層流行病學調(diào)查應用,對我國 應對非洲豬瘟的威脅有實際應用價值。
      [0025] 為了更好地理解和實施,下面結(jié)合附圖詳細說明本發(fā)明。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0026] 圖1非洲豬瘟病毒VP73重組表達蛋白的SDS-PAGE分析。
      [0027] 圖2非洲豬瘟病毒VP73蛋白的WesternBlot分析。
      [0028] 圖3非洲豬瘟病毒VP73蛋白純化效果的SDS-PAGE分析。
      [0029] 圖4非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條的檢測結(jié)果圖。

      【具體實施方式】
      [0030] 以下實施例是為了進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容,但不應理解為對本發(fā)明的限制。若 未特別指明,實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
      [0031] 實施例1標記物釋放墊的制備
      [0032] 1、主要試驗材料
      [0033] 金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)、牛血清白蛋白(BSA)均為Sigma公司產(chǎn)品;熒光納 米晶顆粒、EDC、sulf〇-NHS生物素、BCA蛋白檢測試劑盒均為Thermo scientific公司產(chǎn)品; MES購自上海生物工程技術有限公司;玻璃纖維膜為Millipore公司產(chǎn)品。
      [0034] 2、實驗方法
      [0035] (1)熒光納米晶標記SPA的標記物制備
      [0036] 取熒光納米晶顆粒50 μ L,用50mM MES (pH6. 0)洗滌顆粒2次,lmL/次;用 600 μ L50mM MES(pH6. 0)重懸顆粒;加入 100mg/mL 的 sulfo-NHS 和 EDC 各 200 μ L,室溫 搖動反應30min后,離心,棄上清;用lmL50mM的MES(pH6. 0)洗漆顆粒一次;用lmL50mM 的MES (pH6. 0)重懸熒光納米晶顆粒,加入適量SPA,室溫振搖反應lh,使SPA和熒光納米 晶顆粒間形成穩(wěn)定的肽鍵共價結(jié)合;加入等體積的PBS-BSA(BSA含量2%,pH7. 4),繼續(xù)反 應lh ;離心,棄上清;用50mM MES (pH6. 0)洗滌顆粒3次,lmL/次;用300 μ L重懸液(10mM Tris-HCl (pH8. 0),10%蔗糖)重懸熒光納米晶標記SPA的標記物,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0037] (2)標記物釋放墊的制備
      [0038] 用含 2% TritonX100、l% BSA、1%蔗糖的 0· 02mol/L PBS(pH7. 4)溶液處理玻璃 纖維膜,真空抽濕4小時后,用上述膜處理緩沖液按1:100稀釋熒光納米晶標記SPA的標記 物,采用Bio-Dot XYZ3050噴膜系統(tǒng)將此稀釋抗體噴涂至上述處理過的玻璃纖維膜上制成 標記物釋放墊,真空抽濕干燥備用。
      [0039] (3) SPA與突光納米晶標記的最佳標記量確定
      [0040] 將 SPA 梯度稀釋后,分別取 50μ g、100y g、150y g、200y g、250y g、300y g 蛋白溶 液與50 μ Llmg/mL的突光納米晶顆粒偶聯(lián),用BCA蛋白檢測試劑盒檢測偶聯(lián)標記后的上清 中蛋白的濃度。取上清中的蛋白的濃度剛好升高的前一個濃度為最佳蛋白標記用量。
      [0041] 3、試驗結(jié)果
      [0042] 利用熒光納米晶標記SPA的試驗方法,分別將50μ g、100y g、150y g、200y g、 250 μ g、300 μ g的SPA蛋白溶液與50 μ Llmg/mL的熒光納米晶顆粒進行偶聯(lián)反應,反應后離 心取上清,分別檢測上清中的蛋白濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 μ gSPA的稀釋度開始出現(xiàn)明顯的蛋 白濃度升高,因此確定與50 μ Llmg/mL熒光納米晶顆粒共價偶聯(lián)的最佳SPA蛋白標記量為 150μ g (艮P 0· 15mg) 〇
      [0043] 實施例2非洲豬瘟病毒VP73蛋白的原核表達及純化
      [0044] 1、主要試驗材料
      [0045] 原核表達質(zhì)粒pGEX-KG由本單位保存、提供;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊 抗鼠 IgG購自Invitrogen公司;牛血清白蛋白(BSA)購自sigma公司;HRP底物顯色液 購自天根生化科技有限公司;蛋白電泳LoadingBuffer購自上海生工生物工程有限公 司;蛋白Marker購自紐英倫生物技術公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白純化試劑盒 (B_PERTM6XHis Fusion Protein Purification Kit)、蛋白穩(wěn)定劑(Protein Stabilizing Cocktail)購自 Thermo 公司。
      [0046] 2、試驗方法
      [0047] (1)VP73基因重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
      [0048] 在GenBankS89966. 1非洲豬瘟病毒VP73基因序列基礎之上優(yōu)化設計VP73基因全 長序列,氨基端加入起始密碼子ATG,羧基端加入6XHis標簽及終止密碼子。由上海生工 生物工程(上海)有限公司合成含有VP73基因全長序列的質(zhì)粒,合成的VP73基因長度為 1188bp。利用Primer Premier5. 0設ii^一對特異性引物(分別在上下游引入BamHI和Xhol 酶切位點),
      [0049] PI:TAGATCCATGGCTTCTGGTGGCGCGTT,
      [0050] P2:ATTCTCGAGGTCGACTTAGTGATGG,
      [0051] 通過PCR擴增得到1188bp的非洲豬瘟病毒VP73基因片段。將該片段與表達載體 pGEX-KG連接克隆至大腸桿菌DH5 α菌株,提取質(zhì)粒后,經(jīng)上海生工測序、PCR和雙酶切鑒 定,選取VP73基因讀碼框正確的陽性克隆,命名為pGEX-KG-VP73。
      [0052] (2) VP73蛋白的誘導表達
      [0053] 將重組原核表達質(zhì)粒PKG-VP73轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21 (DE3)菌,劃板篩選后獲 得用于表達目的蛋白的陽性菌。挑取單菌落接種到含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,置于 37°C搖床上,180r/min振蕩培養(yǎng)12h,第二天以1 :100的量轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng),振蕩培養(yǎng)使培養(yǎng) 基0D600值達到0. 6?0. 8之間,加入IPTG誘導劑至終濃度為1. 0mmol/L,繼續(xù)振蕩誘導 3h。誘導結(jié)束后,取lmL菌液于1.5mL EP管中,離心收集細菌,菌體用ddH20洗滌一次,取 適量的1倍蛋白電泳Loading Buffer重懸菌體,95°C加熱10min,處理后用于SDS-PAGE檢 測目的蛋白。同時以未加誘導劑誘導的陽性菌液和加誘導劑誘導的空載體(PGEX-KG)菌液 經(jīng)過同樣的處理后作為對照。
      [0054] (3)誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
      [0055] 按照常規(guī)方法制備SDS-PGAE凝膠,將處理后的待檢蛋白樣品及對照加入上樣 孔中,加入電泳緩沖液后開始電泳,電泳初始電壓為80V,樣品進入分離膠后,將電壓調(diào)到 120V,電泳結(jié)束后關閉電源,取下凝膠置于考馬斯亮藍染液中室溫振蕩染色3h。染色完畢, 將染色液換為脫色液,室溫振蕩脫色數(shù)次至蛋白條帶清晰時觀察結(jié)果。
      [0056] (4)誘導表達產(chǎn)物的Western blot分析
      [0057] IPTG誘導pGEX-KG-VP73陽性菌液和空載體菌液表達后,處理樣品經(jīng)SDS-PAGE電 泳,將電泳結(jié)束后的凝膠取下,采用濕法轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜(NC膜),350mAlh。把NC膜置 TBST中漂洗一下,置封閉液中4°C過夜。把NC膜放入一新的平皿中,以0. 1?0. 15mL/cm2 的量加入封閉液稀釋的非洲豬瘟標準陽性血清,置37°C水平搖床上溫育lh。用TBST洗滌NC 膜4?6遍,每次5min,加入封閉液稀釋的兔抗豬IgG-HRP,置37°C水平搖床上溫育45min, 洗滌同上,隨后再用TBS洗兩遍,吸干洗液后加入適量的HRP底物顯色液避光顯色至出現(xiàn)蛋 白帶時,立即用去離子水終止并觀察結(jié)果。
      [0058] (5)最佳誘導劑誘導濃度的確定
      [0059] 復蘇活化后的pGEX-KG-VP73菌液,振蕩培養(yǎng)使培養(yǎng)基0D600值達到0. 6?0. 8 之間時,等量分裝,每管5mL,分別加入IPTG誘導劑至終濃度為0. 2、0. 4、0. 8、1. 0、1. 2和 1. 4mmol/L,同時誘導表達3h,未加誘導劑誘導的陽性菌液和加1. Ommol/LIPTG誘導的空載 體菌液經(jīng)過同樣的處理作為對照。誘導后收集菌體,處理后的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析確定 VP73蛋白誘導表達的最佳誘導劑濃度。
      [0060] (6)最佳誘導時間的確定
      [0061] 復蘇活化后的PGEX-KG-VP73菌液,振蕩培養(yǎng)使培養(yǎng)基0D600值達到0. 6?0. 8之 間時,等量分裝,每管5mL,IPTG誘導劑至終濃度為1. Ommol/L,分別誘導表達lh、2h、3h、4h 和5h,未加誘導劑誘導的陽性菌液和加1. Ommol/L IPTG誘導的空載體菌液同時誘導3h作 為對照。誘導后收集菌體,處理后的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析確定VP73蛋白誘導表達的最佳 誘導時間。
      [0062] (7)VP73蛋白誘導表達形式的確定
      [0063] pGEX-KG-VP73菌液和空載體菌液同時以1. 0mmol/L IPTG誘導表達3h,收集菌體, 用ddH20重懸,高壓破碎。破碎后,4°C 12000r/min離心20min,收集上清,沉淀用ddH20重 懸。取適量上清和沉淀分別加入蛋白電泳Loading Buffer, 95?加熱10min,處理后的樣品 同時進行SDS-PAGE分析確定VP73蛋白誘導表達形式。
      [0064] (8) VP73蛋白的大量表達
      [0065] 取活化后的PGEX-KG-VP73菌液,以1:100的接種量接入到含相應抗生素的200mL LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)使培養(yǎng)基0D600值達到0. 6?0. 8,加入1. 0mmol/L IPTG誘導 表達3h,收集菌體,用20mL bufferA (含20yL DTT)重懸,高壓破碎。破碎后,4°C 12000r/ min離心20min,沉淀用ddH20洗漆兩次,沉淀中加入19. 7mL bufferA、0. 3mL SKL和20 μ L DTT,劇烈震蕩后冰上靜置0. 5?2h。4°C 12000r/min離心20min,棄沉淀取上清,加入20% PEG4000至終濃度為0. 2 %,加入50mmol/L氧化型谷胱甘肽至終濃度為lmmol/L,再加入 100mmol/L還原型谷胱甘肽至終濃度為2mmol/L,裝入透析袋,經(jīng)TE透析三天后,用PEG8000 濃縮蛋白,置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0066] (9)VP73 蛋白純化
      [0067] 按照 Thermo 公司 B_PERTM6XHis Fusion Protein Purification Kit 說明書對 誘導表達的VP73蛋白純化,純化后的蛋白加入適量Protein Stabilizing Cocktail,使用 Pierce BCA Protein Assay kit測定蛋白濃度,適量分裝后置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0068] 3、試驗結(jié)果
      [0069] (1)VP73基因重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
      [0070] BamHI+XhoI雙酶切重組原核表達質(zhì)粒pGEX-KG-VP73,得到預期大小的兩個片段, 目的片段大小約為1188bp,0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳圖譜上顯示目的片段條帶,表明重組質(zhì) 粒構(gòu)建正確。使用NCBI中Blast程序?qū)τ缮虾Iy定的重組質(zhì)粒pGEX-KG-VP73序列與 人工合成的ASFVVP73基因標準序列進行比較發(fā)現(xiàn),其同源性為100%,無堿基突變。
      [0071] (2) VP73蛋白誘導表達的SDS-PAGE分析
      [0072] SDS-PAGE分析結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pGEX-KG-VP73轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)后,經(jīng) 終濃度為1. 〇mm〇l/L的IPTG37°C誘導3h,產(chǎn)生約71KDa的特異性蛋白帶,與預期結(jié)果一致, 結(jié)果見圖1。
      [0073] (3) VP73蛋白誘導表達的Western blot分析
      [0074] 對誘導表達的VP73蛋白進行Western blot分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在約71KDa位置上出 現(xiàn)特異性雜交條帶,而對照則未出現(xiàn)條帶,如圖2。試驗表明體外表達的VP73蛋白與非洲豬 瘟標準陽性血清可以特異性結(jié)合,證實其具有良好的生物學活性。
      [0075] (4)最佳誘導劑誘導濃度的確立
      [0076] SDS-PAGE分析結(jié)果表明,VP73蛋白在不同誘導劑誘導濃度的作用下,表達量均較 高且相差不大,最終選擇1. Ommol/L為誘導劑IPTG的最佳誘導濃度。
      [0077] (5)最佳誘導時間的確立
      [0078] SDS-PAGE分析結(jié)果表明,VP73蛋白隨誘導時間的延長表達量逐漸增多,最終選擇 3h為最佳誘導時間。
      [0079] (6)VP73蛋白誘導表達形式的確立
      [0080] 對誘導表達的含VP73重組質(zhì)粒的菌株高壓破碎處理后,分別對收集的上清和沉 淀進行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明VP73蛋白主要以包涵體的形式在大腸桿菌中表達,而空載 體GST蛋白表達在上清中。
      [0081] (7)VP73蛋白的純化
      [0082] 對大量表達的VP73蛋白進行純化后,經(jīng)SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)純化得到的VP73蛋 白純化效果好,條帶單一,純化量較高,結(jié)果見圖3。
      [0083] (8)VP73蛋白含量的測定
      [0084] 使用Pierce BCA Protein Assay kit測定純化后VP73蛋白的蛋白質(zhì)濃度,讀取 562納米處的吸光光度值,根據(jù)標準曲線計算出VP73純化蛋白的濃度為2. 24mg/mL。
      [0085] 實施例3非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條的制備及組裝
      [0086] 1、試驗材料
      [0087] PVC背襯、硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊和金標墊均為Millipore公司產(chǎn)品;兔抗 SPA多克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品。
      [0088] 2、試驗方法
      [0089] (1)非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條中硝酸纖維素膜的制備
      [0090] 以原核表達并純化的非洲豬瘟病毒VP73蛋白作為硝酸纖維素膜上的檢測線包 被蛋白,以兔抗SPA多克隆抗體作為硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線包被蛋白。采用0. 02mol/ L PBS (pH7. 4)緩沖液,將兔抗SPA多克隆抗體和非洲豬瘟病毒VP73蛋白的濃度均配制為 1. 5mg/mL,利用Bio-Dot XYZ3050噴膜系統(tǒng)將兔抗SPA多克隆抗體噴至硝酸纖維素膜的控 制線(Control Line,C線)位置,將非洲豬瘟病毒VP73蛋白噴至檢測線(Test Line,T線) 位置,C線與T線間的距離為5. 0mm噴樣速度為1.0 μ L/cm,然后于相對濕度為10%以下的 干燥條件下進行抽濕4小時后,干燥密封保存待用。
      [0091] (2)非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條的組裝
      [0092] 將噴膜包被了蛋白的硝酸纖維素膜粘貼于PVC襯板上,在硝酸纖維素膜(NC膜) 的兩端分別粘貼吸水墊和標記物釋放墊、樣品墊,吸水墊和標記物釋放墊均與NC膜重疊 3mm,樣品墊和標記物釋放墊重疊3mm,對齊抹平后進而采用Bio-Dot的CM4000切條機將其 裁成5mm寬的條狀,4 °C密封干燥保存?zhèn)溆谩?br> [0093] ⑶非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條的檢測反應結(jié)果
      [0094] 當待檢血清樣品沿著試紙條通過毛細作用由樣品墊向吸水墊泳動時,被檢樣品中 IgG免疫球蛋白首先與熒光納米晶顆粒上的SPA結(jié)合形成復合物,該復合物繼續(xù)流動。復合 物流經(jīng)檢測線時,如果被檢樣品中含有抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白的IgG抗體時,將與固定 在檢測線上的非洲豬瘟病毒VP73蛋白結(jié)合進而被捕獲富集,在紫外光照射激發(fā)下檢測線 處發(fā)出紅光;沒有被結(jié)合捕獲的復合物繼續(xù)向前流動,與固定在質(zhì)控線上的兔抗SPA多克 隆抗體結(jié)合,并在質(zhì)控線上富集,在紫外線照射激發(fā)下質(zhì)控線處發(fā)出紅光。
      [0095] 用試紙條檢測血清樣品時,在紫外光照射下,如在檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅色 條帶的判為陽性反應結(jié)果,只在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶的判為陰性反應結(jié)果,如果質(zhì)控線未 出現(xiàn)紅色條帶,則表明操作過程不正確或試紙條失效。
      [0096] 3、試驗結(jié)果
      [0097] 分別取一滴(約50 μ L)非洲豬瘟陽性血清和陰性血清,各滴加在制備好的試紙條 的樣品墊(加樣區(qū))上,樣品開始在硝酸纖維素膜上擴散,待標記物釋放墊釋放完全后,在 滴加非洲豬瘟陽性血清的試紙條上出現(xiàn)了清晰的Τ線和C線,而在在滴加非洲豬瘟陰性血 清的試紙條上只出現(xiàn)了清晰的C線,見圖4。
      [0098] 實施例4非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條技術指標驗證試驗
      [0099] 1、試驗材料
      [0100] (1)水泡性口炎病毒(VSV)、豬水泡病病毒(SVDV)、藍舌病病毒(BTV)、藍耳病病毒 (PRRSV)等多種疫病的陽性血清均由本單位保存。
      [0101] (2)非洲豬瘟標準陽性血清購自0ΙΕ設在英國的非洲豬瘟參考實驗室;30份非洲 豬瘟陰性血清采集于正常豬,并經(jīng)ELISA試劑盒檢測確認為陰性,由本單位保存、提供。
      [0102] 2、試驗方法
      [0103] (1)非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條的特異性試驗
      [0104] 用研制的非洲豬瘟熒光納米晶試紙條分別檢測非洲豬瘟標準陽性血清、30份非洲 豬瘟陰性血清和VSV、SVDV、BTV、PRRSV等4種疫病的陽性血清,在紫外光照射下觀察分析 結(jié)果,進而對該試紙條的特異性進行驗證評估。
      [0105] (2)非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條的敏感性試驗
      [0106] 選用非洲豬瘟標準陽性血清,用ELISA檢測其效價約為1:3200,用PBS分別稀釋為 1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400 的待檢樣品,分別用,用移液器取 待檢測樣品50 μ L垂直緩慢滴加在試紙條的樣品墊上,用手持式紫外燈進行照射,觀察檢 測結(jié)果。
      [0107] (3)非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條的重復性試驗
      [0108] 將5份非洲豬瘟陽性血清作為陽性樣品,5份正常豬血清作為陰性樣品,用于試紙 條的重復性試驗。隨機取出不同批次和同一批次的試紙條,分別對陽性樣品和陰性樣品進 行重復檢測,觀察結(jié)果評估其重復性。
      [0109] ⑷非洲豬瘟熒光納米晶抗體檢測試紙條的穩(wěn)定性試驗
      [0110] 取非洲豬瘟熒光納米晶試紙條1〇〇條,密封保存于4°c冰箱中,在保存后0、1、2、3、 4、5、6、7、8、9個月時分別取出10條,對非洲豬瘟陽性血清、陰性血清及PBS進行檢測,通過 結(jié)果分析來確定試紙條的質(zhì)保期限。
      [0111] 3、試驗結(jié)果
      [0112] (1)特異性試驗
      [0113] 用非洲豬瘟熒光納米晶試紙條分別對非洲豬瘟標準陽性血清以及VSV、SVDV、BTV、 PRRSV等多種疫病的陽性血清進行檢測,同時以非洲豬瘟陰性血清和PBS作為對照,結(jié)果發(fā) 現(xiàn)該試紙條只與非洲豬瘟標準陽性血清呈陽性反應,在紫外燈下有紅色檢測線出現(xiàn),而其 它檢測均為陰性反應,表明該試紙條具有很好的特異性
      [0114] (2)敏感性試驗
      [0115] 利用非洲豬瘟熒光納米晶快速檢測試紙條對不同稀釋度的非洲豬瘟標準陽性血 清樣品進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀釋到1:800以下樣品均為陽性結(jié)果,有明顯的檢測線;1:1600 的樣品檢測結(jié)果為可疑,檢測線模糊不清;1:3200的樣品檢測結(jié)果為陰性,從而表明該試 紙條的檢測靈敏度能達到標準陽性血清的1:800倍稀釋,低于ELISA方法的靈敏。
      [0116] (3)重復性試驗
      [0117] 對隨機挑取的3個不同批次間的試紙條進行重復試驗,每一批次挑取10個試紙條 分別對非洲豬瘟陽性血清和陰性血清進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與預期完全一致。取30 個同一批次的試紙條,分別對非洲豬瘟陽性血清和陰性血清進行3次重復檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn) 檢測結(jié)果完全一致。這些試驗結(jié)果表明,該非洲豬瘟熒光納米晶快速檢測試紙條的檢測重 復性良好。
      [0118] (4)穩(wěn)定性試驗
      [0119] 將同一批次的100個試紙條在4°C條件下保存不同時間(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9個 月),每次取出10條分別檢測非洲豬瘟陽性血清和陰性血清,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在4°c保存7個月 內(nèi),試紙條檢測結(jié)果沒有任何變化,用在4°C保存8個月試紙條檢測時,有2份為假陽性,用 在4°C保存9個月的試紙條檢測時,有2份為假陽性和1份假陰性。試驗結(jié)果表明,該試紙 條在4°C可以保存7個月,其檢測效果不受影響。
      [0120] 以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已,并不用于限制本發(fā)明,對于本領域的技術人 員來說,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進等,均應包含在本 發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
      【權利要求】
      1. 一種非洲豬瘟病毒重組抗原的制備方法,包括以下步驟: a) 人工設計并合成該抗原表位的重組基因序列,所述如序列表SeqlDNo. 1所示; b) 將該序列克隆至載體中,用PCR方法擴增該片段; c) 將步驟b)獲得的PCR產(chǎn)物,并與線性載體連接,構(gòu)建重組表達載體; d) 將重組表達載體導入原核表達體系,誘導蛋白表達; e) 對表達產(chǎn)物進行純化后獲得所述非洲豬瘟的重組抗原。
      2. 根據(jù)權利要求1所述的非洲豬瘟病毒重組抗原,其特征在于:步驟d)中,誘導劑及 濃度為IPTG1. Ommol/L,誘導時間為3h。
      3. 根據(jù)權利要求1所述的非洲豬瘟病毒重組抗原,其特征在于:步驟b)中,用于所述 重組基因序列特異性擴增的PCR引物為: PI:TAGATCCATGGCTTCTGGTGGCGCGTT P2:ATTCTCGAGGTCGACTTAGTGATGG。
      4. 權利要求1所述的非洲豬瘟病毒重組抗原,在制備用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的試 劑中的應用。
      5. -種非洲豬瘟抗體檢測熒光納米晶試紙條,包括:依次連接并固定于PVC襯板上的 樣品墊、熒光納米晶標記物釋放墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊;所述硝酸纖維膜包被有權利 要求1所述非洲豬瘟病毒抗原作為檢測線和兔抗金黃色葡萄球菌A多克隆抗體作為質(zhì)控 線。
      6. 根據(jù)權利要求5所述的非洲豬瘟抗體檢測熒光納米晶試紙條,其特征在于:所述標 記結(jié)合物釋放墊為噴有標記物的玻璃纖維膜,所述標記物為金黃色葡萄球菌A蛋白標記熒 光納米晶。
      7. 根據(jù)權利要求5所述的非洲豬瘟抗體檢測熒光納米晶試紙條,其特征在于:所述硝 酸纖維素膜上的檢測線位于靠近所述標記物釋放墊的一端,所述硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線 位于靠近所述吸水墊的一端,所述質(zhì)控線與所述檢測線的垂直距離為4_?7_。
      8. 根據(jù)權利要求5所述的非洲豬瘟抗體檢測熒光納米晶試紙條,其特征在于:所述非 洲豬瘟病毒抗原包被濃度為1. 5mg/mL,所述兔抗金黃色葡萄球菌A多克隆抗體包被濃度為 1. 5mg/mL〇
      【文檔編號】G01N33/569GK104267181SQ201410554936
      【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權日:2014年10月17日
      【發(fā)明者】呂建強, 花群義, 楊俊興, 張彩虹, 曹琛福, 孫潔, 劉建利, 陶虹, 宗卉, 廖立珊, 唐金明, 曾少靈, 阮周曦, 黃超華 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
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