非洲豬瘟病毒cp530r基因的熒光pcr檢測(cè)試劑及其制備方法與用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種非洲豬癌病毒CP530R基因的巧光PCR檢 測(cè)試劑及其制備方法與用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 非洲豬癌病毒是一種有囊膜的單分子線狀雙鏈DNA病毒，其基因組長(zhǎng)約170化~ 193化，含有151個(gè)~1650RF，其中的CP530R基因是非洲豬癌病毒在感染細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的 特有基因之一，其編碼合成的PP62前體蛋白經(jīng)PS273R色氨酸蛋白酶處理后裂解為成熟的 p35蛋白和pl5蛋白，該二種蛋白進(jìn)一步參與ASFV的衣殼組裝和成熟過程（Amlr6sG，Alejo A,SalasJ,SalasML.Africanswinefeverviruspolyproteinspp220andpp62assemble into化ecoreshell.JVirol.2002Dec;76(24):12473-82.)。因此，對(duì)CP530R基因的檢 測(cè)可作為樣本中含有非洲豬癌病毒核酸及污染過非洲豬癌病毒的一個(gè)證據(jù)。
[0003] 非洲豬癌病毒是豬的一種急性、高度接觸性傳染病一非洲豬癌的病原體，非洲 豬癌病毒在感染豬后侵入血流并吸附于血細(xì)胞而迅速散播至全身，在冰凍肉尸內(nèi)可W存 活15周，骨髓中達(dá)6個(gè)月，因此，耐過非洲豬癌的隱性感染豬W及受豬癌病毒污染的生 豬產(chǎn)品及其制品是非洲豬癌引入健康地區(qū)豬群的重要傳播媒介。此外，非洲豬癌病毒還 可感染野豬和軟婢，非洲豬癌病毒在家豬與野豬之間、野豬與軟婢之間W及家豬與軟婢之 間存在復(fù)雜的感染循環(huán)方式（Penrith,M.L. ,Vosloo,W. , 2009.ReviewofAfricanswine fever:transmission,spreadandcontrol.J.S.Afr.Vet.Assoc. 80, 58 - 62.)，對(duì)該些攜 帶非洲豬癌病毒的宿主監(jiān)測(cè)，能夠?yàn)榉侵挢i癌的監(jiān)測(cè)與防控提供病原學(xué)依據(jù)。
[0004] 目前，已建立的非洲豬癌病毒檢測(cè)方法包括病毒分離鑒定、病毒抗原檢測(cè)方法 和病毒核酸檢測(cè)方法（0IE, 2008.Qiapter2. 8.1.Africanswinefever.In:Manualof DiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals2008.OfficeInternati onaldesEpizooties,PariFrance,http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/ p壯/2. 08.OlASF.p壯.），非洲豬癌病毒的分離鑒定試驗(yàn)周期長(zhǎng)，不適合快速檢測(cè)。采用巧 光抗體試驗(yàn)和抗原捕獲化ISA試驗(yàn)檢測(cè)非洲豬癌病毒抗原，具備快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但對(duì)低 病毒載量樣本缺乏足夠的敏感性低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。巧光PCR技術(shù)將PCR與巧光檢測(cè) 結(jié)合起來，克服了傳統(tǒng)PCR費(fèi)時(shí)、易污染和擴(kuò)增后需電泳檢測(cè)等缺點(diǎn)，已在非洲豬癌病毒核 酸檢測(cè)方面得到應(yīng)用，目前已報(bào)道的巧光PCR方法所采用的引物和標(biāo)記探針，主要是針對(duì) 非洲豬癌病毒VP72、P54和K205R基因序列設(shè)計(jì)制備的OQNGD.P.，REIDS.M.，皿TCHINGS G.比，GRI邸SONS.S.，WILKINSONP.J.，DIXONL.K.，BAST0SA.D.S.&DREWT.W. (2003). DevelopmentofaTaqMan?PC民assaywithinternalamplificationcontrolforthe detectionofAfricanswinefevervirus.J.Virol.Methods, 107, 53 - 61.)，而用于檢 測(cè)非洲豬瘋病毒基因CP530R的焚光PCR檢測(cè)試劑產(chǎn)品及其使用方法，還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種非洲豬癌病毒CP530R基因的巧光PCR檢 測(cè)試劑及其制備方法與途，具體設(shè)及一種W非洲豬癌病毒CP530R基因?yàn)閿U(kuò)增祀序列而研 制的檢測(cè)試劑，該檢測(cè)試劑包括一對(duì)引物、一條標(biāo)記探針和一個(gè)陽性對(duì)照。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是通過W下步驟實(shí)現(xiàn)的；一種非 洲豬癌病毒CP530R基因的巧光PCR檢測(cè)試劑，包含一對(duì)特異性引物、一條特異性探針和一 個(gè)陽性對(duì)照，擴(kuò)增目標(biāo)長(zhǎng)度為73bp，引物和探針序列為：
[0007]上游引物；P530R-F:5, -GTGTCAATAATCCCTATCTTGCCA-3' SEQIDNO. 1
[0008]下游引物；P530R-R;5' -AACTCGGTGGGATGGTTGAG-3' 沈QIDNO. 2
[0009]探針；P530R-P:5' -FAM-TCCTTGCTGTCTTTCTTGTC-3'-MGB 沈QIDNO. 3
[0010]陽性對(duì)照；ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAATCAGTTTCCTTGCTGTCTTTCTTGT CGCTCAACCATCCCACCGAGTTTATTAAGGTACTGCCGCTTATAGAC； 沈QIDNO. 4
[0011] 上述的非洲豬癌病毒CP530R基因的巧光PCR檢測(cè)試劑的制備方法，包括w下步 驟：
[0012] (1)選擇非洲豬癌病毒CP530R基因序列保守片段為擴(kuò)增和制備陽性對(duì)照的祀目 標(biāo)序列，其核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示，為：
[0013]ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAATCAGTTTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCTCAACC ATCCCACCGAGTTTATTAAGGTACTGCCGCTTATAGAC；
[0014] (2)設(shè)計(jì)4條引物，W之PCR擴(kuò)增和制備CP530R基因陽性對(duì)照，引物序列SEQID NO. 5--SEQIDNO. 8 如下；
[00巧]CP530RF1 ;5>-TCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCCTCAACCATCCCACCGAG TT-3>
[0016] CP530RR1；5^ -AACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGACAAGAAAGACAGCAAGGAGACCGACTTGGCAA GA-3>
[0017]CP530RF2 ; 5' -ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTG-3'
[0018]CP530RR2 ;5' -GTCTATAAGCGGCAGTACCTTMTAACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGA-3，
[0019] (3)根據(jù)CP530R基因陽性對(duì)照序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物和多條探針，經(jīng)過大量的對(duì)比篩 選試驗(yàn)，確定最適的引物對(duì)和標(biāo)記探針組合：
[0020] 上游引物；P530R-F:5, -GTGTCAATAATCCCTATCTTGCCA-3， 沈QIDNO. 1
[00引]下游引物；P530R-R;5' -AACTCGGTGGGATGGTTGAG-3' SEQIDNO. 2
[0022] 探針；P530R-P:5, -FAM-TCCTTGCTGTCTTTCTTGTC-3,-MGB 沈QIDNO. 3
[0023] (4)探針的5'端標(biāo)記的巧光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的非巧光澤滅基團(tuán)為MGB;
[0024] (5)經(jīng)過大量的對(duì)比試驗(yàn)和反應(yīng)條件優(yōu)選，確定最適的反應(yīng)條件、引物及探針的特 異性和靈敏度。
[002引所述妨中的最適的反應(yīng)條件為上、下游引物使用濃度為7.5pmol/yL，探針的使 用濃度為2.化mol/yL，在25化體系中加入1yL引物及探針，引物及探針的特異性使其區(qū) 別于豬源其它病毒，靈敏度達(dá)到61個(gè)拷貝。
[0026] 上述的非洲豬癌病毒CP530R基因的巧光PCR檢測(cè)試劑在生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的 應(yīng)用。
[0027]上述的非洲豬癌病毒CP530R基因的巧光PCR檢測(cè)試劑在繪制非洲豬癌病毒巧光 定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的用途。
[002引本發(fā)明的有益效果是；（1)具有特異、敏感、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，可用于來自家豬、 野豬和軟婢的各種樣本中微量非洲豬癌病毒核酸的檢測(cè)。（2)本發(fā)明中的非洲豬癌病毒 CP530R基因陽性對(duì)照制備方法，既不設(shè)及非洲豬癌病毒及其基因組核酸的使用，也不需要 人工合成較長(zhǎng)的非洲豬癌病毒CP530R基因DNA片段，具有簡(jiǎn)便、安全和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。
【附圖說明】
[0029] 圖1為最適引物對(duì)與標(biāo)記探針對(duì)非洲豬癌病毒CP530R基因陽性對(duì)照的巧光PCR 擴(kuò)增曲線。
[0030] 圖2為最適引物對(duì)與標(biāo)記探針的巧光PCR特異性擴(kuò)增曲線。
[003。圖3為對(duì)6.lXl09~6.lX10lcopies/yL濃度范圍內(nèi)的非洲豬癌病毒CP530R基 因陽性對(duì)照的巧光定量擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。
[003引圖4為非洲豬癌病毒CP530R基因的巧光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0034] 本發(fā)明的非洲豬癌病毒CP530R基因的巧光PCR檢測(cè)試劑及其制備方法與用途，包 括W下步驟。
[00巧]第一步驟是制備CP530R基因的陽性對(duì)照物質(zhì)，過程包括：
[0036] (1)在GenBank數(shù)據(jù)庫中，對(duì)CP530R基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇一段保守序列 用于CP530R基因陽性對(duì)照制備，如SEQIDNO. 4所示。
[0037] 似基于SEQIDNO. 4序列設(shè)計(jì)合成4條引物，引物序列如下：
[0038]CP530RF15^-TCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCCTCAACCATCCCACCGAG TT-3>
[0039]CP530RR15 '-AACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGACAAGAAAGACAGCAAGGAGACCGACTTGGCAA GA-3>
[0040]CP530RF2 ;5' -ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTG-3'
[0041]CP530RR2 ;5' -GTCTATAAGCGGCAGTACCTTMTAACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGA-3';
[0042] (3) W兩條互補(bǔ)引物作為擴(kuò)增模板，另外二條與用作模板的引物序列部分重疊的 引物作為擴(kuò)增引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增；
[004引 （4)回收、純化含有SEQIDNO. 1序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與PCR2. 1克隆載體連接， 轉(zhuǎn)化至D冊(cè)a大腸桿菌基因工程菌，挑取、提取陽性克隆質(zhì)粒；
[0044] 妨用核酸分析儀進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定，按公式換算成拷貝數(shù)，即得已知拷貝數(shù)濃度的非 洲豬癌病毒CP530R基因陽性對(duì)照（質(zhì)粒）。
[0045] 第二步驟是設(shè)計(jì)合成與篩選檢測(cè)CP530R基因的引物、探針，過程包括：
[004引（1)基于SEQIDNO. 1所示序列，設(shè)計(jì)合成多對(duì)引物和多個(gè)標(biāo)記探針；
[0047] (2)W第一步驟制備的1000倍稀釋的CP530R基因陽性對(duì)照質(zhì)粒為模板，采 用PremixEx化q?(pr〇beqPCR)巧光PCR反應(yīng)擴(kuò)增試劑及推薦的反應(yīng)擴(kuò)增條件，在 Li曲tCycler? 480巧光PCR儀對(duì)所設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和標(biāo)記探針進(jìn)行篩選試驗(yàn)；
[0048] (3)在相同巧光PCR反應(yīng)擴(kuò)增試劑及推薦的反應(yīng)擴(kuò)增條件下，W出現(xiàn)最小的Ct 值、最高巧光強(qiáng)度增加值（A化）W及典型的S型擴(kuò)增曲線的綜合判定標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增曲線見圖 1，最終確定的檢測(cè)非洲豬癌病毒CP530R基因的最適引物和標(biāo)記探針序列分別為：
[0049]上游引物；CP530R-F:5, -GTGTCAATAATCCCTATCTTGCCA-3'
[0050]下游引物；CP530R-R;5' -AACTCGGTGGGATGGTTGAG-3'
[005