專(zhuān)利名稱：Klotho腺相關(guān)病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種Klotho腺相關(guān)病毒的新用途。
背景技術(shù)：
研究表明高血壓病及其相關(guān)的心血管疾病已成為危及人群健康的常見(jiàn)?。欢夏耆艘蝾净夹难懿《碌乃劳雒黠@高于年輕人。因此，高血壓病以及相關(guān)心血管并發(fā)癥與衰老密切相關(guān)，也是影響其預(yù)后的重要因素。已有研究證實(shí)自發(fā)性高血壓(spontaneoushypertensive rat, SHR)大鼠具有許多人類(lèi)自發(fā)性高血壓的特征,是一種很好的高血壓模型動(dòng)物，其血壓水平有隨年齡增長(zhǎng)而增高的特點(diǎn)，常伴發(fā)心、腎及血管等靶器官損傷，其中高血壓心臟病以心肌肥大、心肌纖維化、心室重塑等損害更為重要。 Klotho基因作為一種于1997年被KuiX)等人發(fā)現(xiàn)的新型衰老相關(guān)基因，其研究發(fā)現(xiàn)在Klotho基因敲除小鼠模型上Klotho可以抑制多種類(lèi)似人類(lèi)衰老相關(guān)表型，如動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、生殖功能減退、肺氣腫、壽命縮短等。而Klotho的過(guò)表達(dá)可以延長(zhǎng)壽命。研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因可以抑制胰島素IGF-I信號(hào)通路，增加NO活性，調(diào)節(jié)離子通道活性。Klotho還可以對(duì)抗內(nèi)皮功能障礙。肖明能等研究報(bào)道40歲以后血漿Klotho蛋白水平隨年齡增加而有下降趨勢(shì)。Wang等報(bào)道Klotho在體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以阻止高血壓的進(jìn)程和保護(hù)腎臟功能。但就Klotho在心臟靶器官損傷中是否也發(fā)揮了作用，以及是否對(duì)高血壓心臟病有治療作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種Klotho腺相關(guān)病毒作為制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物的新用途。本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的=Klotho腺相關(guān)病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應(yīng)用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)I.材料I. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10周齡雄性SHR大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，10周齡雄性SD大鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。I. 2 試劑多克隆兔來(lái)源IGF-I、IGF-1R、p-Akt (Ser473)、t-Akt—抗購(gòu)自北京博奧森生物公司；IGF-U Rat Insulin ELISA kit為R&D公司分裝產(chǎn)品；RIPA蛋白裂解液(漿)、PMSF、SDS-PAGE配膠試劑盒、轉(zhuǎn)膜液、電泳液、蛋白Maker、PVDF膜均為碧云天產(chǎn)品。2.方法2. I動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案
實(shí)驗(yàn)研究分4組，實(shí)驗(yàn)組A、B、C 3組均為SHR大鼠，對(duì)照組(D組)為年齡、性別一致的SD大鼠，每組5只。所有大鼠均在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房SPF級(jí)飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，飲水中加復(fù)合維生素B。自由取食飲水。采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈袖帶法測(cè)量大鼠靜息收縮壓。無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈袖帶法是一種常用的血壓檢測(cè)方法[6，7]。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)血壓、體重。實(shí)驗(yàn)組即A、B、C組SHR大鼠分別行尾靜脈注射PBS(0. 5ml/只)、rAAV. mKL (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml)和 rAAV. EGFP (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml);對(duì)照組 SD 大鼠尾靜脈注射PBS 0.5ml作為對(duì)照研究。隨后每?jī)芍軠y(cè)體重、血壓一次，連續(xù)觀察12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死全部大鼠。處死前用水合氯醛腹腔注射麻醉，采血分離血漿。分離心臟，去除血液、大血管稱重。取部分左心室用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片做HE、MaSSon染色；部分OCT包埋，做冰凍切片，熒光顯微鏡觀察熒光。2. 2免疫組化檢測(cè)心臟klotho蛋白表達(dá)使用博奧森SP免疫組化染色試劑盒，步驟如下大鼠心臟組織切片脫蠟至水，1%胰酶37°C 25min抗原修復(fù)，3 %過(guò)氧化氫孵育lOmin，封閉液37°C封閉25min，4°C孵育一抗 (Anti-Klotho,l 50)過(guò)夜，I 100 二抗37°C孵育30min，HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育30min，DAB顯色l-5min。復(fù)染、脫水、透明、封片、晾干。Leica正置顯微鏡觀察、采圖，Image-Pro Plus 6. O 軟件分析陽(yáng)性異染顆粒 IOD (Integrated Optical Density)值。2. 3 心臟 HE 及 Masson 染色各組大鼠心臟組織切片，常規(guī)HEQiematoxylin)染色觀察心肌細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行Masson三色法膠原纖維染色，Leica正置顯微鏡觀察并采圖。2. 4RT-PCR法檢測(cè)心臟小鼠Klotho mRNA表達(dá)用RNAiso Plus按說(shuō)明書(shū)提取心臟總RNA，Nanodrop2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度計(jì)A260/A280比值。總RNA濃度在3-5 μ g/μ L，Α260/Α280比值在I. 8-2. O之間，無(wú)明顯降解及蛋白污染，滿足逆轉(zhuǎn)錄需要。取I μ g總RNA,用PrimeScriptRT reagent Kit按說(shuō)明書(shū)20 μ L體系逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA-20°C保存。根據(jù)NCBI GenBank收錄mRNA蛋白編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物。小鼠Klotho (NCBI Reference Sequence NM_013823. 2):上游5，-GGG TCA CTG GGTCAA TCT-3，;下游 5’ -GCA AAG TAG CCA CAA AGG-3，，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為 710bp。取 2μ L逆轉(zhuǎn)錄所得 cDNA，用 Premix Taq Version 2. OPCR 擴(kuò)增小鼠 Klotho 基因。小鼠Klotho PCR產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳觀察分析。β-actin PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為157bp。2.5GFP蛋白檢測(cè)新鮮心臟組織用OCT包埋，冰凍切片(20 μ m)。用Leica DM6000熒光正置顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況，并采圖。2. OTestern blot 檢測(cè) Klotho 蛋白表達(dá)取新鮮心臟組織約lOOmg，盡量剪碎，加400 μ L RIPA蛋白裂解液(含4 μ L ImMPMSF)冰上充分裂解30min，14，000g 4°C離心5min。收集上清，取IyL BCA法測(cè)蛋白濃度。另取20(^1^加同體積蛋白上樣緩沖液，沸水煮511^11，-201保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?% SDS-PAGE分離膠，每孔加總蛋白40 μ g，蛋白電泳分離，根據(jù)蛋白Maker切膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜。在含5 % BSA的TBST中37°C封閉lh。I : 750稀釋的Klotho—抗4°C孵育過(guò)夜。GAPDH—抗I : 1000稀釋后孵育。次日HRP標(biāo)記二抗(I 3000) 37°C孵育Ihour。加ECL后X膠片曝光、顯影、定影。Quantity One軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值。Klotho蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值為Klotho蛋白相對(duì)表達(dá)量。2. 7心臟體重指數(shù)大鼠處死前稱體重，處死后分離心臟，去除血液、大血管后稱重。心臟左心室體重指數(shù)=大鼠心臟左心室重量(g) XlOOO+大鼠體重(g)。2. 8數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用PASW 18軟件分析。體重、血壓數(shù)據(jù)應(yīng)用one-way ANOV A分析，其余數(shù)據(jù)應(yīng)用two-ways ANOVA分析,其顯著性檢驗(yàn)設(shè)置為95%可信區(qū)間，P < O. 05即為顯著性。3.結(jié)果3. IKlotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)SHR大鼠血壓的影響在rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)前，17周齡的SHR大鼠基礎(chǔ)血壓明顯高于17周齡的SD大鼠(圖I)。12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，SHR-mKL組SHR大鼠其血壓與干預(yù)前相比并無(wú)明顯升高，而SHR-PBS組和SHR-EGFP組血壓則繼續(xù)升高，在實(shí)驗(yàn)12周結(jié)束時(shí)血壓高達(dá)204. 2±10. 6mmHg。本研究證實(shí)單劑量的rAAV. mKL (3 X IO8Vg)能阻止SHR大鼠高血壓的進(jìn)展至少12周。如圖I所示.rAAV. mKL轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)SHR大鼠血壓的影響。SHR和SD大鼠在17周齡時(shí)，尾靜脈注射rAAV. mKL、rAAV. EGFP及PBS。數(shù)據(jù)為均值土標(biāo)準(zhǔn)差，* :與SHR-PBS組相比P< O. 05。N = 5 只 / 組。3. 2檢測(cè)大鼠心臟GFP及mKL mRNA表達(dá)情況在rAAV. mKL和rAAV. EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)12周后，在SHR-mKL組和SHR-EGFP組大鼠心臟中仍觀察到綠色熒光EGFP表達(dá)。而SHR-PBS組和SD-PBS組大鼠心臟中未觀察到綠色熒光。此結(jié)果提示rAAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以在心臟中較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，并維持到12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束之時(shí)。rAAV. mKL轉(zhuǎn)導(dǎo)SHR大鼠12周后，心臟中檢測(cè)到小鼠Klotho mRNA表達(dá)，提示rAAV成功地將小鼠Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至心臟。而其他三組中未檢測(cè)到小鼠mKLmRNA表達(dá)。GFP和小鼠Klotho mRNA在心臟中的表達(dá)。在熒光顯微鏡下，可見(jiàn)rAAV. mKL和rAAV. EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的大鼠心臟有GFP表達(dá)，PBS注射大鼠心臟未見(jiàn)綠色熒光(如圖2)。用小鼠Klotho特異性引物RT-PCR檢測(cè)小鼠心臟Klotho mRNA表達(dá)(如圖3)，發(fā)現(xiàn)除rAAV. mKL轉(zhuǎn)導(dǎo)SHR大鼠外，其余三組均未見(jiàn)小鼠mKL mRNA表達(dá)3. 3Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)SHR大鼠心肌肥大、心肌纖維化及心臟左心室重量指數(shù)的影響。rAAV. mKL對(duì)心肌肥大、心肌纖維化及Klotho蛋白表達(dá)的影響。如圖4所示，rAAV.mKL對(duì)心肌肥大的影響(HE染色)。如圖5所示,rAAV. mKL對(duì)心臟膠原纖維(Masson染色)表達(dá)的影響。如圖6所示，rAAV.mKL對(duì)大鼠心臟體重指數(shù)的影響。數(shù)據(jù)=均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差。* 與 SHR-PBS 組相比 P < O. 05 ;林 與 SHR-PBS 相比 P < O. 01，N = 5 只 / 組。3組SHR大鼠心臟切片HE染色后，均可見(jiàn)肥大心肌細(xì)胞，但是在SD大鼠心臟切片未見(jiàn)明顯肥大心肌細(xì)胞(如圖4)。上述各組相互比較后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)rAAV.mKL大鼠心臟中肥大心肌細(xì)胞明顯少于PBS和rAAV. EGFP處理大鼠。Masson三色染色后看到，SHR大鼠心臟比SD大鼠心臟膠原纖維明顯增生(如圖5)。但經(jīng)rAAV. mKL處理后大鼠心臟膠原纖維表達(dá)明顯少于rAAV. EGFP和PBS處理組，即提示Klotho基因明顯抑制心臟膠原纖維表達(dá)。3組SHR大鼠心臟左心室體重指數(shù)明顯高于SD大鼠(如圖6)，其中SHR-mKL組心臟體重指數(shù)也明顯低于SHR-EGFP組和SHR-PBS組(p < O. 05)。另外在SHR-EGFP組和SHR-PBS組之間心臟體重指數(shù)無(wú)明顯差異，即提示rAAV載體本身不影響SHR大鼠心臟體重指數(shù)。3. 4Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)SHR心臟Klotho蛋白的影響SHR大鼠心臟Klotho蛋白表達(dá)較同齡SD大鼠少，其中SHR-mKL組Klotho蛋白表達(dá)較其他兩組明顯增加，Klotho蛋白表達(dá)在SHR-mKL組和SD-PBS組之間無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖 7、8)。rAAV. mKL對(duì)大鼠心臟Klotho蛋白表達(dá)的影響。如圖7所示,Klotho、GAPDHWesternblot條帶；如圖8所示，Klotho蛋白表達(dá)定量分析。 三·結(jié)論本研究采用的重組腺相關(guān)病毒載體與其他基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體相比，有許多特有的優(yōu)勢(shì)首先，由于腺相關(guān)病毒可以將外源基因插入到宿主基因組，rAAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。本研究采用rAAV. mKL轉(zhuǎn)導(dǎo)SHR大鼠12周后，其心肌中仍可檢測(cè)到GFP表達(dá)及mKL mRNA表達(dá)，也證明了這一特點(diǎn)；而rAAV. mKL的長(zhǎng)效作用主要?dú)w功于長(zhǎng)效的AAV載體。其次，AAV載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)沒(méi)發(fā)現(xiàn)明顯免疫反應(yīng)，在組織學(xué)檢查中沒(méi)發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)跡象，在后期數(shù)據(jù)分析中也沒(méi)觀察到AAV載體的毒性反應(yīng)；而上述這些特征對(duì)于像高血壓這種慢性疾病的治療至關(guān)重要。因此，AAV介導(dǎo)的Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)為高血壓及相關(guān)心血管疾病的長(zhǎng)期治療提供了新的方向。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)rAAV. mKL可以顯著增加SHR大鼠心臟Klotho mRNA及蛋白的表達(dá)，同時(shí)Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以阻止SHR大鼠血壓的升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。通過(guò)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠行Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)rAAV. mKL轉(zhuǎn)導(dǎo)的SHR大鼠其心臟組織的心肌肥大和心肌纖維化較SHR對(duì)照組明顯受到抑制、其心臟體重指數(shù)也較對(duì)照組降低，由此推測(cè)，Klotho基因表達(dá)上調(diào)在SHR大鼠心肌肥大和心肌纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了作用，降低了左心室質(zhì)量指數(shù)，而這三方面也是高血壓心臟病的重要病理過(guò)程和評(píng)價(jià)指標(biāo)。同時(shí)研究也證實(shí)了心臟是Klotho作用的靶器官之一。眾所周知，高血壓病持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致心肌肥大、心肌纖維化、心臟增大，這正是其發(fā)生心肌重塑、心肌損害的重要表現(xiàn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究報(bào)道血漿Klotho蛋白水平隨年齡增加而降低，同時(shí)研究證實(shí)高血壓病發(fā)病隨著年齡增加而增加。為此，研究Klotho基因在高血壓以及心肌肥大、心肌纖維化進(jìn)程中的作用及機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)組SHR大鼠其肥大心肌細(xì)胞和心肌膠原纖維較對(duì)照組減少，心臟體重指數(shù)也較對(duì)照組降低。上述結(jié)果表明Klotho基因及蛋白不僅在心臟組織中的表達(dá)，而且對(duì)心臟靶器官損傷也有保護(hù)作用=Klotho可以抑制心肌肥大，減少肥大心肌細(xì)胞，進(jìn)而減少心臟體重指數(shù)。此外，Klotho可以抑制心臟膠原纖維增生即抑制心肌纖維化。研究證實(shí)AAV介導(dǎo)的Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以長(zhǎng)時(shí)表達(dá)，為長(zhǎng)期有效的心臟保護(hù)提供了一條新的干預(yù)途徑。有益效果本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯不,通過(guò)Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以控制SHR大鼠血壓進(jìn)一步升高，減輕高血壓心臟病心臟損害即可以保護(hù)SHR大鼠心臟，至少可以持續(xù)12周，Klotho腺相關(guān)病毒完全可以作為制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物對(duì)高血壓及相關(guān)心血管疾病進(jìn)行治療。


圖I為尾靜脈收縮壓與大鼠周齡坐標(biāo)圖；圖2為4組大鼠心臟切片熒光顯微鏡圖；圖3為4組大鼠心臟組織的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4為4組大鼠心臟常規(guī)HE染色顯微鏡圖；圖5為4組大鼠Masson三色染色顯微鏡圖；圖6為4組大鼠心臟體重坐標(biāo)圖；圖7為4組大鼠心臟蛋白條帶灰度值圖；圖8為4組大鼠心臟蛋白表達(dá)定量坐標(biāo)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一、Klotho腺相關(guān)病毒制備I.材料I. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5周齡昆明小鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。I. 2 試劑RNAiso Plus>PrimeScript RT reagent Kit、加A尾試劑盒、pMD19_T vector>EcoR
I和 Xho I 限制性內(nèi)切酶 Premix Taq Version 2. O, SYBR Premix Ex Taq II,DLIOOODNAMaker購(gòu)自大連寶生物公司；pAAV-IRES_HnGFP質(zhì)粒為Stratagene公司產(chǎn)品。2 方法參照本課題組研究，用RNAiso Plus從新鮮小鼠腎臟組織提取總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit按使用說(shuō)明，用Klotho特異性下游引物替代隨機(jī)引物和Oligo dT引物逆轉(zhuǎn)錄。從NCBI GenBank獲取小鼠Klotho mRNA編碼區(qū)序列(ΝΜ_013823· 2),設(shè)計(jì)小鼠Klotho特異性引物上游 5' ccggaattcatgctagcccg 3',下游51 gccgctcgagttacttataacttctc 31。取 2 μ L 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，25 μ L 體系擴(kuò)增小鼠 Klotho編碼序列。PCR產(chǎn)物加A尾后連接至pMD19-T載體，EcoR I and Xho I雙酶切及寶生物公司基因測(cè)序鑒定。EcoR I and Xho I雙酶切pMD19_T. mKL,獲得小鼠Klotho全長(zhǎng)cDNA,亞克隆至pAAV-IRES-HnGFP多克隆位點(diǎn)EcoR I和Xho I之間，獲得質(zhì)粒AAV. mKL (pAAV. mKL)，經(jīng)測(cè)序鑒定pAAV. mKL符合實(shí)驗(yàn)要求。pAAV. mkl與RC、Phelpr質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞包裝 AAV. EGFP rAAV. mKL ;pAAV_IRES-HnGFP 空質(zhì)粒與 RC、Phelpr 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 AAV-293 細(xì)胞包裝rAAV. EGFP，rAAV. EGFP做為空白對(duì)照病毒。3 結(jié)果成功獲得rAAV. mKL和rAAV. EGFP，測(cè)定rAAV. mKL和rAAV. EGFP的滴度分別為3 X 10nvg/ml 和 I X 1012vg/ml。兩次基因測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank中小鼠Klotho mRNA蛋白編碼區(qū)(⑶S)序列(編號(hào)NM—013823. 2，網(wǎng)址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NM—013823. 2)完全
—致111-3155，atg起始，taa結(jié)束。測(cè)序結(jié)果與以下序列一致。I gataatcatt gctcgtgggg cggcgggagc gggggtgggc accgcgtagggagggcggcg61 gggcgcgggc atataggggc gcggcgcggt gccctcccgg ctcccgcagc atg ctagccc121 gcgcccctcc tcgccgcccg ccgcggctgg tgctgctccg tttgctgttgctgcatctgc181 tgctgctcgc cctgcgcgcc cgctgcctga gcgctgagcc gggtcagggcgcgcagacct 241 gggctcgctt cgcgcgcgct cctgccccag aggccgctgg cctcctccacgacaccttcc301 ccgacggttt cctctgggcg gtaggcagcg ccgcctatca gaccgagggcggctggcgac361 agcacggcaa aggcgcgtcc atctgggaca ctttcaccca tcactctggggcggccccgt421 ccgactcccc gatcgtcgtg gcgccgtcgg gtgccccgtc gcctcccctgtcctccactg481 gagatgtggc cagcgatagt tacaacaacg tctaccgcga cacagaggggctgcgcgaac541 tgggggtcac ccactaccgc ttctccatat cgtgggcgcg ggtgctccccaatggcaccg601 cgggcactcc caaccgcgag gggctgcgct actaccggcg gctgctggagcggctgcggg661 agctgggcgt gcagccggtg gttaccctgt accattggga cctgccacagcgcctgcagg721 acacctatgg cggatgggcc aatcgcgccc tggccgacca tttcagggattatgccgagc781 tctgcttccg ccacttcggt ggtcaggtca agtactggat caccattgacaacccctacg841 tggtggcctg gcacgggtat gccaccgggc gcctggcccc gggcgtgaggggcagctcca901 ggctcgggta cctggttgcc cacaacctac ttttggctca tgccaaagtctggcatctct961 acaacacctc tttccgcccc acacagggag gccgggtgtc tatcgccttaagctcccatt1021 ggatcaatcc tcgaagaatg actgactata atatcagaga atgccagaagtctcttgact1081 ttgtgctagg ctggtttgcc aaacccatat ttattgatgg cgactacccagagagtatga1141 agaacaacct ctcgtctctt ctgcctgatt ttactgaatc tgagaagaggctcatcagag1201 gaactgctga cttttttgct ctctccttcg gaccaacctt gagctttcagctattggacc1261 ctaacatgaa gttccgccaa ttggagtctc ccaacctgag gcagcttctgtcttggatag1321 atctggaata taaccaccct ccaatattta ttgtggaaaa tggctggtttgtctcgggaa1381 ccaccaaaag ggatgatgcc aaatatatgt attatctcaa gaagttcataatggaaacct1441 taaaagcaat cagactggat ggggtcgacg tcattgggta caccgcgtggtcgctcatgg1501 acggtttcga gtggcatagg ggctacagca tccggcgagg actcttctacgttgactttc1561 tgagtcagga caaggagctg ttgccaaagt cttcggcctt gttctaccaaaagctgatag1621 aggacaatgg ctttcctcct ttacctgaaa accagcccct tgaagggacatttccctgtg1681 actttgcttg gggagttgtt gacaactacg ttcaagtgga cactactctctctcagttta1741 ctgacccgaa tgtctatctg tgggatgtgc atcacagtaa gaggcttattaaagtagacg1801 gggttgtagc caagaagaga aaaccttact gtgttgattt ctctgccatccggcctcaga1861 taaccttact tcgagaaatg cgggtcaccc actttcgctt ctccctggactgggccctga1921 tcttgcctct gggtaaccag acccaagtga accacacggt tctgcacttctaccgctgca1981 tgatcagcga gctggtgcac gccaacatca ctccagtggt ggccctgtggcagccagcag2041 ccccgcacca aggcctgcca catgcccttg caaaacatgg ggcctgggagaacccgcaca2101 ctgctctggc gtttgcagac tacgcaaacc tgtgttttaa agagttgggtcactgggtca
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權(quán)利要求
1. Klotho腺相關(guān)病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為一種Klotho腺相關(guān)病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應(yīng)用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，通過(guò)Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以控制SHR大鼠血壓進(jìn)一步升高，減輕高血壓心臟病心臟損害即可以保護(hù)SHR大鼠心臟，至少可以持續(xù)12周，Klotho腺相關(guān)病毒完全可以作為制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物對(duì)高血壓及相關(guān)心血管疾病進(jìn)行治療。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102886051SQ20121027913
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者馬厚勛, 李寶善, 王艷嬌, 吳平, 鄧明洪, 羅玉梅, 李運(yùn)奎, 周婷, 楊秋晨, 鄧小琴 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院