專利名稱：一種蔓越莓提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種蔓越莓提取物。
背景技術(shù)：
蔓越莓,又稱蔓越橘、小紅莓,英文名Cranberry,是杜醇花科越橘屬紅莓苔子亞屬(學(xué)名0XyCOCCOS，又名毛蒿豆亞屬)的俗稱，此亞屬的物種均為常綠灌木，主要生長在北半球的涼爽地帶酸性泥炭土壤中?；ㄉ罘奂t色，總狀花序。紅色漿果可做水果食用。目前在北美的一些地區(qū)被大量種植。蔓越莓植物所含的化學(xué)成分復(fù)雜，具有多種生物活性。近年來，國內(nèi)外學(xué)者分別從不同角度對其藥理作用、生物活性及臨床方面作了較為深入的研究，為其臨床療效提供了
依據(jù)。但是至今仍未發(fā)現(xiàn)其具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗過敏和抗炎作用的蔓越莓提取物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問題是提供一種蔓越莓提取物，本發(fā)明采用逆流提取法，能夠更加充分地對蔓越莓中原花青素成分進行提取，與現(xiàn)有技術(shù)方法相比具有原料處理更加容易、節(jié)省溶劑、提取效率高、成本低等特點，適于工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)；并且本發(fā)明的蔓越莓提取物中具有誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞凋亡并且活化MBP激酶的物質(zhì)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種蔓越莓提取物，采用逆流提取法進行提取得到，所述逆流提取法包括以下步驟步驟(I):取蔓越莓果實，粉碎；和步驟(2):加入PH值為I. 0-3. O、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65-85%的乙醇溶液，30-60°C下逆流提取4-6h，過濾后合并收集濾液，濃縮，得所述蔓越莓提取物。本文所述“濃縮”為低溫真空濃縮，其溫度控制在1(T20°C。濃縮的程度是使所得最終的蔓越莓提取物的固形物含量控制在其重量的0. 49Tl%。進一步的，在所述步驟(2)中，加入PH值為I. O、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%乙醇水溶液，在40°C下逆流提取6小時。進一步的，所述蔓越莓提取物具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。進一步的，所述蔓越莓提取物具有誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞凋亡的活性。進一步的，所述蔓越莓提取物能夠活化MBP激酶。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點( I)本發(fā)明采用逆流提取法，能夠更加充分地對原花青素成分進行提取，與現(xiàn)有技術(shù)方法相比具有原料處理更加容易、節(jié)省溶劑、提取效率高、成本低等特點，適于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明蔓越莓提取物在減少嗜酸粒細(xì)胞方面顯示出較好的效果，即其可以有效地用于預(yù)防和治療由過多的嗜酸粒細(xì)胞而引起的各種疾病。(3)本發(fā)明蔓越莓提取物可以作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、抗過敏、抗炎和保健食品。


圖I是乙醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(％)與浸出液原花青素含量(mg)的關(guān)系圖。圖2是接觸時間(h)與浸出液原花青素含量(mg)的關(guān)系圖。圖3是溫度(V )與浸出液原花青素含量(mg)的關(guān)系圖。圖4是本發(fā)明一種蔓越莓提取物的制備方法使用的裝置的示意圖。
具體實施例方式一、提取工藝條件考察I、浸出條件實驗(I)乙醇質(zhì)量百分?jǐn)?shù)對原花青素化合物浸出效果的影響工業(yè)生產(chǎn)中，由于原料中常含有一定的水分，乙醇經(jīng)循環(huán)使用后亦含有一定水分，乙醇質(zhì)量百分?jǐn)?shù)對原花青素化合物的浸出存在很大的影響，故以不同質(zhì)量百分?jǐn)?shù)乙醇水溶液對原花青素物質(zhì)進行浸出實驗，以原花青素含量跟蹤分析。在乙醇質(zhì)量百分?jǐn)?shù)對從原料中浸出原花青素的影響實驗中，分別取5份原料，每份50. 00g，進行實驗，以不同質(zhì)量百分?jǐn)?shù)、PH值為I. 0的乙醇水溶液各200. OOml,浸提6h，比較所得原花青素的量；同時比較乙醇質(zhì)量百分?jǐn)?shù)對浸出后的固液分離及渣含量的影響，其結(jié)果如圖I和表I所示。由圖I可知，相同條件下，浸出能力強弱依次為85% >80% >75% >70% >65%，因此，選擇85%乙醇水溶液作為浸出劑。(2)接觸時間對原花青素化合物浸出效果的影響分別取6份原料，每份50. 00g，各加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為85%、PH值為I. 0的乙醇水溶液200. OOml進行浸出，接觸時間分別為lh，2h，3h，4h，5h，6h，其浸出結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，室溫下(26°C )，浸出時間為6h，浸出反應(yīng)基本達到平衡；延長浸出時間，浸出率基本不變。(3)溫度對原花青素化合物浸出效果的影響分別取6份原料粉料，每份50. 00g，各加入200. OOml質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為75%、PH值為1.0的乙醇水溶液，在不同的溫度下浸出，浸出時間為2h，取樣檢測浸出液中蔓越莓原花青素含量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著浸出溫度的增加，原花青素的浸出率也相應(yīng)的增加；在溫度達到40°C時，增加溫度，原花青素的浸出率增加趨于緩慢。2、四段逆流滲漉法(工藝簡圖見圖4)共安裝了 6根￠25. 4mmX IOOOmrn玻璃括口管，做為四段逆流滲漉浸出實驗的浸出器(浸出柱)，其中四根運行，兩根做周轉(zhuǎn)用。每根柱中裝入150. OOg蔓越莓原料粉碎料(簡稱原料，以下同)，用計量泵將浸出劑(65-85%乙醇水溶液)，以約5ml mirT1的流量打入第一根浸出柱中，乙醇液以約Icn^mirT1速度滲漉，當(dāng)?shù)谝恢鞒?50ml浸出液后，將第一柱與第二柱接通。計量泵打入的新浸出劑經(jīng)第一柱，流出進入第二柱；與上相同，當(dāng)?shù)诙鞒?50ml黑色浸出液后，將第二柱與第三柱接通。依此類推，等到第四根柱流出450ml流出液后，將第四根柱與第五根柱接通。同時，將計量泵出口管從第一柱上端移至第二柱上端與第二柱接通(第一柱從系統(tǒng)中撤出)。此時，新的浸出劑，經(jīng)計量泵進第二柱，經(jīng)三、四、五柱后，從第五柱流出，同樣取450ml浸出液；此后，新浸出劑進第三柱，從第六柱出浸出液。依此類推，不斷循環(huán)進行四段逆流滲漉浸出實驗至達到浸出平衡。本試驗中第九柱開始至第十二柱止，這四根柱流出的浸出液已近似平衡時的浸出液，故當(dāng)新的浸出劑從從第九根柱進，經(jīng)十、^ 、十二柱，而從第十二柱下流出450ml黑色浸出液后,停止浸出試驗。將九、十、十一、十二柱流出的浸出液取樣，送檢，測定原花青素的含量。(注柱體均為循環(huán)使用，九，十，十一，十二僅代表標(biāo)號，不具實際意義)3、四段逆流滲漉浸出試驗結(jié)果如上述的逆流法進行試驗。每份樣品為150. Og,以85%乙醇為浸出液，40°C下浸提6h，液固比為5。取九、十、十一、十二柱流出的浸出液進行測定，其結(jié)果如表I所示。表I四段逆流滲漉浸出試驗結(jié)果·
浸出柱號浸出液體積浸出原花青素總殳浸出原花青素總量手均值得率(平均值) ' (ml)(mg)fmg)(%)
945(107424
H)4 S ().074.6974,47().()5
11450.074.38
12450.074.58從表I可知，曼越毒中原花青素平均得率為0. 05% (以原花青素計)。原花青素檢測方法為采用HPLC法檢測,標(biāo)準(zhǔn)品為兒茶素,色譜柱為C18親脂性柱,流動相A項為0. 4%磷酸、B項為95%甲醇和5% 0. 4%磷酸，流量為lml/min，進樣量為10^1，柱溫為30°C，檢測波長為280nm ；洗脫梯度為0-38min :79% A21 % B 到 35% A65% B 的雙溶劑線性梯度；38-60min 35% A65% B ；60_70min :100%的甲醇。二、實施例以下通過具體實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述。實施例I :取蔓越莓果實500g，粉碎，加入PH值為3. O、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液2. 5L，30°C下逆流提取4h，過濾后合并收集濾液，濃縮，得蔓越莓提取物61.56g。所述“濃縮”為低溫真空濃縮，其溫度控制在15°C。濃縮的程度是使所得最終的蔓越莓提取物的固形物含量控制在其重量的0. 5%。實施例2 取蔓越莓果實500g，粉碎，加入PH值為I. O、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液2. 5L，40°C下逆流提取6h，過濾后合并收集濾液，濃縮，得蔓越莓提取物62.37g。所述“濃縮”為低溫真空濃縮，其溫度控制在15°C。濃縮的程度是使所得最終的蔓越莓提取物的固形物含量控制在其重量的0. 5%。實施例3 取蔓越莓果實500g，粉碎，加入PH值為I. O、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液2. 5L，60°C下逆流提取6h，過濾后合并收集濾液，濃縮，得蔓越莓提取物61. 47g。所述“濃縮”為低溫真空濃縮，其溫度控制在15°C。濃縮的程度是使所得最終的蔓越莓提取物的固形物含量控制在其重量的0. 5%。實施例4嗜酸粒細(xì)胞性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試驗和MBP激酶活性實驗嗜酸粒細(xì)胞性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試驗試驗根據(jù)Vermes等的方法(Journal of
Immunological Methodsl84卷39-51頁1995年)進行。使嗜酸粒細(xì)胞性細(xì)胞HL-60細(xì)胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度為1-3 X IO6細(xì)胞/ml。向該細(xì)胞懸浮液500 中添加被檢測物質(zhì)(上述實施例1-3中最后收集得到的蔓越莓提取物)或培養(yǎng)基，使蔓越莓提取物在細(xì)胞懸浮液中的濃度為100 u g/ml，在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)6小時或24小時。離心洗凈后，加入磷脂酞結(jié)合蛋白(Annexin) V緩沖液,然后添加5ul磷脂酞結(jié)合蛋白V-FITC。通過流動血細(xì)胞計數(shù)法，以磷脂酞結(jié)合蛋白V陽性細(xì)胞作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞，用相對總細(xì)胞數(shù)的百分比評價。MBP激酶活性試驗試驗根據(jù)De Souza等的方法(Blood99卷3432-3438頁2002年)進行。將嗜酸粒細(xì)胞性細(xì)胞HL-60細(xì)胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度為1_3X IO6細(xì)胞/ml。該細(xì)胞懸浮液500 ill中添加被檢測物質(zhì)或培養(yǎng)基，使?jié)舛葹镮OOii g/ml，在37 °C、5%C02的條件下培養(yǎng)6小時或24小時。離心洗凈后，添加可溶解緩沖液，溶解細(xì)胞，使用含有MBP5mg/ml的凝膠進行電泳。凝膠經(jīng)脫變性、再變性處理后，用32P-ATP標(biāo)記，實施3小時的磷酸化反應(yīng)。凝膠干燥后，使用圖象分析儀解析放射活性。在36kDa生長出標(biāo)記帶時,記做MBP激酶活化陽性(+)。蔓越莓提取物在HL-60細(xì)胞中觀察到了濃度依賴性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。另外進行凝膠MBP激酶分析(In-gel MBP kinase assay)時，蔓越莓提取物激活36kDa MBP激酶。以上結(jié)果提示。蔓越莓提取物對嗜酸粒細(xì)胞能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該細(xì)胞凋亡與36kDa MBP激酶有關(guān)。由此推斷蔓越莓提取物中含有可以用于抗嗜酸粒細(xì)胞性炎癥作用藥物的成分。所得結(jié)果如下表2所示確認(rèn)實施例2和3具有強的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，并伴有MBP激酶的活化。表 權(quán)利要求
1.一種蔓越莓提取物，其特征在于，采用逆流提取法進行提取得到，所述逆流提取法包括以下步驟 步驟(I):取蔓越莓果實，粉碎；和 步驟(2):加入PH值為I. 0-3. O、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65-85%的乙醇溶液，30-60°C下逆流提取4_6h，過濾后合并收集濾液，濃縮，得所述蔓越莓提取物。
2.如權(quán)利要求I所述一種蔓越莓提取物，其特征在于，在所述步驟(2)中，加入PH值為I.O、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%乙醇水溶液，在40°C下逆流提取6小時。
3.如權(quán)利要求I或2所述的一種蔓越莓提取物，其特征在于，所述蔓越莓提取物具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。
4.如權(quán)利要求I或2所述的一種蔓越莓提取物，其特征在于，所述蔓越莓提取物具有誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞凋亡的活性。
5.如權(quán)利要求I或2所述的一種蔓越莓提取物，其特征在于，所述蔓越莓提取物能夠活化MBP激酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蔓越莓提取物，其特征在于，采用逆流提取法進行提取得到，所述逆流提取法包括以下步驟步驟(1)取蔓越莓果實，粉碎；和步驟(2)加入PH值為1.0-3.0、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65-85%的乙醇溶液，30-60℃下逆流提取4-6h，過濾后合并收集濾液，濃縮，得所述蔓越莓提取物。本發(fā)明采用逆流提取法，能夠更加充分地對蔓越莓中原花青素成分進行提取，與現(xiàn)有技術(shù)方法相比具有原料處理更加容易、節(jié)省溶劑、提取效率高、成本低等特點，適于工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)；并且本發(fā)明的蔓越莓提取物中具有誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞凋亡并且活化MBP激酶的物質(zhì)。
文檔編號A61K36/45GK102784189SQ201210279489
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者季進軍 申請人:寧波杰順生物科技有限公司