專利名稱：Snx家族新基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，尤其是，本發(fā)明涉及SNXll基因及其用途。
背景技術：
內涵體是真核細胞內部眾多獨立的膜泡結構，分布于整個細胞質之中，負責在細胞不同部位之間的物質轉運，對細胞內物質轉運意義重大。一旦內涵體轉運出現(xiàn)混亂，就會影響細胞的正常生理進程，例如內涵體負責的信號分子受體轉運障礙會導致細胞增殖，分化失控等。Sorting Nexins(SNXs)是對內涵體進行精細調控的蛋白家族,這個家族發(fā)現(xiàn)的比較晚，在人(Homo sapiens)中共有33個成員，都具有PX結構域(phox-homology domain)作為這一家族的特征結構域。
目前對于SNX家族的研究仍有待改進。

發(fā)明內容
本發(fā)明g在至少解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多肽具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列。發(fā)明人經過分析，該多肽在SNX家族進化樹上與SNX10最為接近，二者PX結構域的相似性為78%，為此將該多肽在本文中命名為SNX11。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中表達SNXll后發(fā)現(xiàn)它不產生和SNX10相似的成泡現(xiàn)象。而當發(fā)明人將SNX10和SNXll共轉染到細胞中時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll可以顯著的抑制SNX10誘導的成泡現(xiàn)象。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll抑制了晚期內涵體的異常擴大和成熟，但對Rab7的募集不產生影響。進ー步，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過表達SNXll可以抑制VacA在細胞中的空泡化作用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在VacA處理后的細胞中，出現(xiàn)大量的擴大的晚期內涵體。當細胞轉染表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽SNXll后，雖然Rab7依然出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，但晚期內涵體的進ー步擴大則被抑制。另外，發(fā)明人建立了 SNXll基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制瘧原蟲的増殖，并有較高比率的小鼠存活，來自SNXll缺陷鼠的脾臟細胞在體外表現(xiàn)出更強的細胞增殖反應和分泌與抗瘧疾免疫力相關的白介素12(IL-12)和Y干擾素，表明瘧疾感染在SNXll缺陷鼠中可誘導更強的免疫反應。瘧原蟲感染后檢測血清特異性抗體水平顯示，SNXll小鼠產生了高水平的抗瘧疾抗體。SNXll基因表達水平分析表明，該基因在腦組織中表達豐富；在主要免疫細胞(⑶4T細胞、⑶8T細胞B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和自然殺傷細胞)中，SNXll都有表達，其中，SNXll基因在中性粒細胞中表達最高，而且在瘧原蟲感染后，該基因表達在所分析的上述主要免疫細胞中均有顯著下降。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該寡核苷酸能夠編碼前面所述的多肽。根據(jù)本發(fā)明實施例的寡核苷酸能夠編碼前面所述的多肽，由此，可以有效地實現(xiàn)體外表達本發(fā)明所分離的多肽，并且適于大規(guī)模表達分離所述的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提聞表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多妝的效率。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了ー種表達載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該表達載體包含編碼前面所述分離的多肽的核酸分子。由此，利用該表達載體，能夠有效地在體外表達體系例如重組細胞中,表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了ー種重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述重組細胞中包含前面所述多肽的核酸分子，優(yōu)選地包含如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，任選地所述細胞為動物細胞，優(yōu)選非人哺乳動物細胞，更優(yōu)選嚙齒類動物細胞，最優(yōu)選小鼠細胞。在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了前面所述的多肽、寡核苷酸、或 者表達載體在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該藥物可以用于下列至少之ー治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內涵體的異常擴大。在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述重組細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括使用前面所述的表達載體轉化宿主細胞；以及分離重組細胞，任選地所述宿主細胞為動物細胞，優(yōu)選非人哺乳動物細胞，更優(yōu)選嚙齒類動物細胞，最優(yōu)選小鼠細胞。利用該方法，能夠有效地獲得根據(jù)本發(fā)明實施例所述的重組細胞。在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了ー種藥物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該藥物包含前面所述的多肽、寡核苷酸、表達載體和重組細胞的至少ー種，該藥物用于下列至少之ー治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內涵體的異常擴大。在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了ー種動物細胞及其衍生物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該動物細胞的SNXll基因的表達量下降。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該動物細胞的基因組中，至少ー個SNXll等位基因被敲除。由此，構建了基因組中缺失了 SNXll基因的動物細胞，進ー步可以利用該細胞構建缺失SNXll的動物，例如小鼠。在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種用于SNXll基因敲除的載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該載體包含插入序列，所述插入序列不具有SNXll基因的全部活性；第一同源臂，所述第一同源臂位于所述插入序列的上游；以及第二同源臂，所述第二同源臂位于所述插入序列的下游，其中，所述第一同源臂和第二同源臂適于與基因組上SNXll基因的側翼區(qū)發(fā)生同源重組。由此，利用該載體，能夠有效地構建基因敲除細胞/動物。在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種構建SNXll基因敲除動物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括通過同源重組向胚胎干細胞基因組內導入前面所述的用于SNXll基因敲除的載體；從胚胎干細胞中繁殖雜合和/或純合的基因敲除動物，以及獲得SNXlI基因敲除動物，優(yōu)選動物為非人哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒類動物，最優(yōu)選小鼠。在本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提出了抑制SNXll基因表達的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制瘧原蟲的増殖。在本發(fā)明的第十二方面，本發(fā)明提出了ー種篩選用于抑制瘧原蟲的増殖的藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括將前面所述的重組細胞與藥物候選物接觸；檢測與所述藥物候選物接觸前后，所述重組細胞中SNXll基因的表達量，以便分別獲得第一表達量和第二表達量；以及第二表達量低于第一表達量為所述藥物候選物為用于抑制瘧原蟲増殖的藥物的指示。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，SNXll通過抑制V-ATPase，抑制晚期內涵體的成熟，其中，A顯示SNXll抑制細胞中SNXlO導致的空泡化現(xiàn)象，B顯示SNXlO在細胞中導致晚期內涵體的異常成熟，C顯示SNXll抑制SNXlO作用下晚期內涵體的成熟，D顯示SNXll與V-ATPase的VlD亞基相互作用；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，SNXll抑制VacA在細胞的空泡化作用，其 中，A顯示SNXll抑制VacA在細胞中誘導空泡，B顯示了 A的統(tǒng)計結果，C顯示SNXll抑制VacA作用下晚期內涵體的擴大；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的SNXll晶體結構，其中，(a)顯示了SNX11-142C的總體結構，(b)顯示了 SNX11-170C的總體結構；圖4顯示了 SNXll磷脂結合及表面電勢分析，其中，(a)顯示了 SNX11-142C和P40ph°x-pX結構域的磷脂酰肌醇結合口袋中關鍵氨基酸殘基的比對，(b)顯示了 SNX11-142C的B分子可能的膜結合界面的表面電勢圖；圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，SNXll中的兩個堿性ロ袋與硫酸根離子結合，其中，(a)顯示了磷脂酰肌醇結合口袋與硫酸根離子結合，(b)顯示了 SNX11-142C的A分子中第二個堿性ロ袋與硫酸根離子結合，(c)顯示了 SNX11-142C的B分子中第二個堿性ロ袋與硫酸根離子結合；圖6顯示了 SNXll膜結合模型，其中，(a)W32和F88插入到膜雙分子層中，L76遠離胞膜。(b)F88和L76插入到膜雙分子層中，W32不與膜結合；圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)感染小鼠瘧原蟲(Plasmodium berghei)后的血蟲水平變化(A)和存活率(B)；圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，來自SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)的脾臟細胞體外増殖反應水平(A)和分泌ga_a干擾素(B)及白介素12(C)的能力；圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例，瘧疾感染5周后，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)血清抗瘧原蟲特異性抗體水平；圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例，SNXll基因在不同組織器官中㈧和分離純化的免疫細胞(B)中的表達水平；以及圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例，構建SNXll基因敲除載體的流程示意圖㈧以及對利用該載體制備的基因敲除小鼠的PCR鑒定結果(B)以及該小鼠大腦中SNXll的mRNA的RT-PCR檢測結果(C)。
具體實施例方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。SNXll及其編碼基因本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的發(fā)明人分離了ー種多肽，該多肽具有如下所示的氨基酸序列MGFWCRMSENQEQEEVITVRVQDPRVQNEGSWNSYVDYKIFLHTNSKAFTAKTSCVRRRYREFVWLRKQLQRNAGLVPVPELPGKSTFFGTSDEFIEKRRQGLQHFLEKVLQSVVLLSDSQLHLFLQSQLSVPEIEACVQGRSTMTVSDAILRYAMSNCGWAQEERQSSSHLAKGDQPKSCCFLPRSGRRSSPSPPPSEEKDHLEVWAPVVDSEVPSLESPTLPPLSSPLCCDFGRPKEGTSTLQSVRRAVGGDHAVPLDPGQLETVLEK(SEQ ID NO : I)。該多肽在本文中被命名為“SNXl 1”，其編碼基因被命名為“SNXlI基因”。在本文中所使用的表達方式“SNX11”與“根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽”或者“多肽”是可以替換使用的。需要說明的是，該命名本身，并不對本發(fā)明實施例的肽本身作出任何限制。另外，本發(fā)明還提出了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該寡核苷酸能夠編碼前面所述的多肽。根據(jù)本發(fā)明實施例的寡核 2所示的核苷酸序列atgggctttt ggtgtaggat gtcggagaac caagaacagg aggaggtgat tacagtgcgtgttcaggacc cccgagtgca gaatgagggc tcctggaact cttatgtgga ttataagatattcctccata ccaacagcaa agcctttact gccaagactt cctgtgtgcg gcgccgctaccgtgagttcg tgtggctgag aaagcagcta cagagaaatg ctggtttggt gcctgttcctgaacttcctg ggaagtcaac cttcttcggc acctcagatg agttcattga gaagcgacgacaaggtctgc agcacttcct tgaaaaggtc ctgcagagtg tggttctcct gtcagacagccagttgcacc tattcctgca aagceagctc tcggtgcctg agatagaagc ctgtgtceagggccgaagta ccatgactgt gtctgatgcc attcttcgat atgctatgtc aaactgtggctgggcccagg aagagaggca gagctcttct cacctggcta aaggagacca gcctaagagttgctgctttc ttccaagatc gggtaggagg agctctccct caccgcctcc cagtgaagaaaaggaccatt tagaagtgtg ggctccagtt gttgactctg aggttccttc cttggaaagtcccactctcc cacccctctc ctcaccatta tgctgtgatt ttggaagacc caaagagggaacctccactc ttcagtctgt gaggagggct gtgggaggag atcatgctgt gcctttggaccctggtcagt tagaaacagt tttggaaaag tga(SEQ ID NO :2)。由此，可以進ー步提高表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽即SNXll的效率。如本文使用的，術語“多肽”指氨基酸的任何聚合鏈。術語“肽”和“蛋白”可與術語多肽互換使用，且同樣指氨基酸的聚合鏈。術語“多肽”是包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽類似物。多肽可以是單體或聚合的。除非另外與上下文矛盾，此處使用“多肽”意在包含多肽和其片段及變體(包括變體的片段)。術語“分離的蛋白”或“分離的多肽”是這樣的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或來源不與天然結合的組分結合，所述天然結合的組分在其天然狀態(tài)下與其伴隨；基本上不含來自相同物種的其他蛋白；由來自不同物種的細胞表達；或在自然界中不存在。因此，化學合成或在不同于其天然起源的細胞的細胞系統(tǒng)中合成的多肽將是與其天然結合的組分“分離的”。還可以通過分離，使用本領域眾所周知的蛋白純化技術，使得蛋白基本上不含天然結合的組分。發(fā)明人經過分析，該多肽在SNX家族進化樹上與SNXlO最為接近，二者PX結構域的相似性為78%，為此將該多肽在本文中命名為SNXlI。PX結構域是一種磷脂結合結構域，其主要的結合祀點是PI3P(phosphatidyIinositol-3-monophosphate)。這是一種廣泛的分布于內涵體膜上的磷脂，SNX家族通過PX結構域與磷脂的結合定位到內涵體表面，從而發(fā)揮對內涵體轉運多樣的調節(jié)。如SNXl的PX結構域以PI(3，5)P2為靶點，定位到內涵體膜上，對EGFR向晚期內涵體/溶酶體的轉運和降解起到重要的調節(jié)作用。在這個過程中，SNXl與 Hrs (Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)、EGFR (表皮生長因子受體)形成大的復合體并定位在早期內涵體上，調節(jié)了 EGFR從早期內涵體向晚期內涵體的轉運。同時SNXl與SNX2 —起調節(jié)向內涵體向TGN(反面高爾基體網(wǎng)絡結構，Trans-Golgi Network)的逆轉運(retrograde transport)。SNXI/SNX2 通過 PX 定位內涵體膜上時，它們將VPS26/29/35復合體募集到膜上，形成Retromer復合體，這個復合體將引導有關受體如M6PR向TGN方向的轉運。為了研究該分離多肽的功能，發(fā)明人首先從人類基因組中克隆出了編碼根據(jù)本發(fā) 明實施例的所分離多肽的基因，并將它構建到真核表達載體上。在哺乳動物細胞中表達SNXll后發(fā)現(xiàn)它不產生和SNXlO相似的成泡現(xiàn)象。而當發(fā)明人將SNXlO和SNXll共轉染到細胞中時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll可以顯著的抑制SNXlO誘導的成泡現(xiàn)象。為了研究SNXll顯著抑制SNXlO誘導成泡現(xiàn)象的機理，發(fā)明人進一步分析了 SNXlO在內涵體中的分布。發(fā)明人采用內涵體體特異性的Rab蛋白來標記不同的內涵體，發(fā)現(xiàn)由于SNXlO作用下的巨大空泡表面都呈現(xiàn)Rab7陽性。Rab7主要定位于晚期內涵體和溶酶體，Rab7陽性意味著SNXlO誘導了晚期內涵體的異常擴大和成熟。隨后，發(fā)明人分析了根據(jù)本發(fā)明實施例的SNXll作用下內涵體的變化。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll與SNXlO定位在相同的內涵體上，這些內涵體都呈現(xiàn)Rab陽性，但與SNXlO單獨作用下情況相比，這些內涵體的進一步擴大過程被抑制了。即SNXll抑制了晚期內涵體的異常擴大和成熟，但對Rab7的募集不產生影響。進一步，發(fā)明人對SNXll調節(jié)晚期內涵體的機制進行了研究。SNXlO對內涵體的調節(jié)是通過V-ATPase來實現(xiàn)的，SNXlO通過與VlD的相互作用來激活細胞中的V-ATPase活性，從而造成內涵體的擴大。發(fā)明人推測SNXll也可能通過V-ATPase來調節(jié)內涵體形態(tài)。進一步，發(fā)明人通過利用293T細胞的免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)SNXll也與VlD相互作用。這一結果說明，SNXll抑制了 SNX10對V-ATPase的激活作用，從而抑制了 SNX10造成的晚期內涵體的異常擴大。VacA誘導的細胞空泡化是幽門螺旋桿菌誘導的胃潰瘍發(fā)生過程中的一個重要致病因素。VacA通過激活V-ATPase導致胃表皮細胞空泡化，使得這些細胞變得脆弱，容易脫落或死亡，導致了胃表面潰瘍的發(fā)生。基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll可以抑制V-ATPase的異?；罨?，進而抑制晚期內涵體空泡的產生，那么SNXll也有可能對胃表面潰瘍過程起作用。發(fā)明人對細胞進行VacA處理，發(fā)現(xiàn)在細胞中出現(xiàn)大量的晚期內涵體空泡，而在轉染表達SNXll的細胞中，這個空泡數(shù)量顯著下降。即發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過表達SNXll可以抑制VacA在細胞中的空泡化作用。分析這個過程，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在VacA處理后的細胞中，出現(xiàn)大量的擴大的晚期內涵體。當細胞轉染表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽SNXll后，雖然Rab7依然出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，但晚期內涵體的進一步擴大則被抑制。另外，發(fā)明人首次解析成功SNXll的晶體結構(圖3)。圖3顯示了 SNXll晶體結構。如圖3所示，(a)顯示了 SNX11-142C的總體結構，(b)顯示了 SNX11-170C的總體結構，其中，品紅色的是傳統(tǒng)的PX結構域，藍紫色的是傳統(tǒng)的PX結構域C端附加的螺旋。發(fā)明人用硫酸根離子模擬PI3P的結合，發(fā)現(xiàn)SNX11-142C的磷脂酰肌醇結合口袋中的硫酸根離子與P40phox-PX結構域中PI3P 3-磷酸基團的取向是一致的(如圖4)。圖4顯示了 SNXll磷脂結合及表面電勢分析。如圖4所示，(a)顯示了 SNX11-142C和P40ph°x-PX結構域的磷脂酰肌醇結合口袋中關鍵氨基酸殘基的比對，其中，SNX11-142C的磷脂酰肌醇結合口袋用白色的表面和藍綠色的飄帶表示；SNX11-142C的磷脂酰肌醇結合口袋中結合磷脂酰肌醇氨基酸側鏈用品紅色表示，P40phox-PX結構域的磷脂酰肌醇結合口袋中結合磷脂酰肌醇氨基酸側鏈用深綠色表示；SNX11-142C的磷脂酰肌醇結合口袋中的硫酸根離子(用品紅色棍狀模型表示)與P40ph°x-PX結構域中PI3P 3-磷酸基團的取向是一致的。(b)顯示了 SNX11-142C的B分子可能的膜結合界面的表面電勢圖，紅色表示帶負電區(qū)域，藍色表示帶正電荷區(qū)域，白色表示疏水區(qū)域，兩個堿性口袋結合的硫酸根離子用棍狀模型表示，SNX11-142C的A分 子(品紅色)、SNX11-142C的B分子(藍綠色)和SNXl 1_170C(藍紫色)中主要疏水殘基(W32、L76、F88和F89，用棍狀模型表示)的結構比對。同時硫酸根離子也更多的參與與SNXll的三維構象上(如圖5)。圖5顯示了 SNXll中的兩個堿性口袋與硫酸根離子結合，其中，(a)顯示了磷脂酰肌醇結合口袋與硫酸根離子結合，參與硫酸根離子結合的殘基側鏈用棍狀模型表示，參與硫酸根離子結合的水分子用紅色的球體表示，氫鍵用虛線表示；(b)顯示了 SNX11-142C的A分子中第二個堿性口袋與硫酸根離子結合，其中，“Sulfate”指硫酸根離子；(c)顯示了 SNX11-142C的B分子中第二個堿性口袋與硫酸根離子結合。通過其晶體結構，發(fā)明人分析了 SNXll膜結合的可能形式，發(fā)現(xiàn)除了與PI3P結合外，SNXll本身也需要插入到膜雙分子層中。圖6顯示了 SNXll膜結合模型。結合圖6可知，這有兩種可能的形式(a)W32和F88插入到膜雙分子層中，L76遠離胞膜；(b)F88和L76插入到膜雙分子層中，W32不與膜結合，其中，PI3P用球狀模型表示，磷脂酰肌醇結合口袋之外的參與膜結合的殘基側鏈用黃色的棍狀模型表示。通過這些結構的解析，有助于針對其功能尋找藥物靶點，并設計可能與之特異性作用的藥物，應用到胃潰瘍的治療中。為進一步研究本發(fā)明所分離多肽SNXll的功能，發(fā)明人建立了 SNXll基因敲除小鼠，并對敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染瘧原蟲的情況進行了比較，進而對SNXll基因對抗感染免疫血功能進行了分析研究，結果見圖7。圖7顯示了 SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)感染小鼠瘧原蟲(Plasmodium berghei)后的血蟲水平變化㈧和存活率⑶。結果顯示，與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制瘧原蟲的增殖，并有較高比率的小鼠存活(如圖7)。進一步免疫學分析顯示，來自SNXll缺陷鼠的脾臟細胞在體外表現(xiàn)出更強的細胞增殖反應和分泌與抗瘧疾免疫力相關的白介素12(IL-12)和Y干擾素(如圖8)，表明瘧疾感染在SNXll缺陷鼠可誘導更強的免疫反應。瘧原蟲感染后檢測血清特異性抗體水平顯示，SNXll小鼠產生了高水平的抗瘧疾抗體(如圖9)。SNXll基因表達水平分析表明，該基因在腦組織中表達豐富；在主要免疫細胞中SNXlI都有表達，其中，在SNXlI基因在中性粒細胞中表達最高，而且在瘧原蟲感染后，該基因表達在所分析的多種細胞(CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和自然殺傷細胞)中均有顯著下降(如圖10)。具體地，圖8顯示了來自SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)的脾臟細胞體外增殖反應水平(A)和分泌ga_a干擾素(B)及白介素12(C)的能力；圖9顯示了瘧疾感染5周后，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)血清抗瘧原蟲特異性抗體水平；圖10顯示了 SNXll基因在小鼠不同組織器官中㈧和分離純化的免疫細胞⑶中的表達水平，其中，在A中H，心臟；Li，肝臟；K，腎臟；Lo，肺臟；S，脾臟；Sto，胃組織；Thy，胸腺；B，腦組織；Int，腸組織；M，肌肉組織。在B中⑶4，⑶4T細胞KD8，⑶8T細胞；B，B細胞；DC，樹突狀細胞；Mac，巨噬細胞；Neut，中性粒細胞；NK，自然殺傷細胞。表達載體本發(fā)明還提出了一種能夠有效地表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽SNXll的表達載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該表達載體中包含核酸分子，該核酸分子能夠編碼分尚的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該核酸分子具有如SEQ ID NO :2所示的核酸序列。由此，利用該表 達載體，能夠有效地在體外表達體系例如重組細胞中，表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽，即SNXlI。術語“載體”意指能夠運輸它已與之連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質?！?，它指另外的DNA區(qū)段可以連接到其內的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA區(qū)段可以連接到病毒基因組內。某些載體能夠在它們已引入其內的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞內后可以整合到宿主細胞基因組內，且因此連同宿主基因組一起進行復制。此外，某些載體能夠指導它們與之可操作地連接的基因表達。此種載體在本文中被稱為“重組表達載體”(或簡單地，“表達載體”)。一般而言，在重組DNA技術中使用的表達載體通常為質粒的形式。在本說明書中，“質粒”和“載體”可以互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明預期包括此種其他形式的表達載體，例如提供等價功能的病毒載體(例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。載體的RNA形式(其包括RNA病毒載體)也可在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)用途。在本發(fā)明中所使用的術語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經過修飾的或者未經修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構建重組細胞的表達載體，優(yōu)選所述核酸為DNA，因為DNA相對于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例的表達載體還可以進一步包含其他的元件，從而為表達載體賦予額外的有益效果。本領域技術人員可以根據(jù)需要，選擇這些元件在表達載體上與編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的相對位置。即可以設置在編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的上游，也可以設置在編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的下游，只要這些元件能夠發(fā)揮其相應的功能即可。在本發(fā)明中所使用的術語“5’側”可以與“上游”互換使用，“3’側”可以與“下游”互換使用。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，表達載體可以進一步包含啟動子序列，所述啟動子序列與所述編碼目的基因(SNXll)的核酸分子可操作地相連。在本發(fā)明中所使用的術語“啟動子”指的是這樣一種核酸序列，其能夠指導與其可操縱地連接的核酸分子的轉錄。在本發(fā)明中所使用的術語“可操縱地”指的是核酸表達控制序列例如啟動子、信號序列、增強子等與目標核酸序列之間的功能連接，其中當合適的分子例如轉錄活化分子與表達控制序列結合時，表達控制序列影響著對應于目標核酸序列的核酸的轉錄和/或翻譯。由此，可以直接通過表達載體在動物細胞中引入特定的啟動子，并且該啟動子可以用于啟動編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的轉錄和表達，由此，可以提高所獲得的重組細胞中編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的表達效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實例，所述啟動子為CAG啟動子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當采用該啟動子時，可以有效地在動物細胞中表達突變型生長激素受體基因。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，表達載體可以進一步包括編碼報告蛋白的序列。在本發(fā)明中所使用的術語“報告蛋白”是指這樣的一種蛋白質，其在表達后，能夠產生可以直接或者間接檢測的信號，進而能夠反映表達載體所攜帶的外源 核酸序列是否已經在細胞中被成功表達。根據(jù)本發(fā)明的實施例，報告蛋白的種類并不受特別限制，只要其具有可檢測的活性即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，報告蛋白可以是一種能夠產生光學信號的蛋白質例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白例如綠色熒光蛋白等?；蛘邎蟾娴鞍卓梢允且环N能夠與底物相互作用以產生可檢測信號的酶，例如IacZ基因編碼的β -半乳糖苷酶。β -半乳糖苷酶能催化一系列底物轉化成極易檢測的不同顏色的產物。但是IacZ在細胞內本底表達較高，并且檢測需要破碎細胞壁，從而限制了其應用。因而，根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，報告蛋白可以為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種。由此，可以根據(jù)常規(guī)的方法，對所述報告蛋白進行監(jiān)測。例如可以采用比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對報告蛋白進行檢測。這其中，優(yōu)選發(fā)光蛋白，因為發(fā)光蛋白能夠發(fā)出特定波長的光，因而能夠容易對發(fā)光蛋白進行檢測，并且容易對其進行定量檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，報告蛋白為綠色熒光蛋白。由此，可以便捷地通過熒光顯微鏡，就能夠確定表達載體所攜帶的外源核酸序列是否已經在細胞中被成功表達。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，表達載體可以進一步包括篩選標記基因。在本發(fā)明中所使用的術語“篩選標記基因”指的是這樣的一種基因，其編碼的產物能夠賦予連同載體接受該基因的細胞一種特殊的性質，該特殊的性質使得接受該基因的細胞與未接受該基因的細胞很容易被區(qū)分開。由此，便于篩選接受表達載體的動物細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，篩選標記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些示例，所述篩選標記基因為藥物抗性基因。由此，容易地通過接受外源表達載體的重組細胞的抗藥性來進行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加抗生素，則相應連同載體接受并表達抗生素抗性基因的細胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述篩選標記基因為新霉素抗性基因。由此，能夠進一步提高篩選接受外源表達載體的重組細胞的效率。上面對根據(jù)本發(fā)明實施例的表達載體進行了描述。當然，本領域技術人員能夠理解的，表達載體還可以包含其他常規(guī)的元件以促進表達載體被轉入宿主細胞中并且整合到宿主細胞的基因組上，正常發(fā)揮功能，例如復制起點、多克隆位點等。在此對這些元件不再贅述。重組細胞及其制備方法在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種重組細胞，該重組細胞能夠表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽SNX11。根據(jù)本發(fā)明的實施例，重組細胞中可以包含編碼SEQ ID Ν01所示氨基酸序列的核酸分子，以便能夠使得該重組細胞表達具有SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多肽。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該重組細胞中可以包含的編碼核酸分子的序列為SEQ ID Ν0:2。由此，可以進一步提高重組細胞表達SNXll多肽的效率。在重組細胞中，編碼外源多肽(在本發(fā)明中為具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的SNX11)的分離核酸可以整合在重組細胞的基因組中，也可以游離在重組細胞的基因組之外，只要能夠有效表達外源多肽(在本發(fā)明中為具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的SNXlI)即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選編碼外源多肽(在本發(fā)明中為具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的SNX11)的分離核酸整合在重組細胞的基因組中，由此，可以進一步提高表達外源多肽(在本發(fā)明中為具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的SNXl I)的效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明還提出了制備上述重組細胞(在本文中，也可以稱為“轉基因細胞”)的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括可以以下步驟使用前面所述表達載體轉化宿主細胞；以及分離重組細胞。利用該方法，能夠有效地制備前面所述的重組細胞。在本文中，所使用的術語“轉化”指外源核酸(即DNA分子)通過其進入宿主細胞的任何方法。轉化可以使用本領域眾所周知的各種方法在天然或人工條件下發(fā)生。轉化可以依賴于用于將外來核酸序列插入原核或真核宿主細胞內的任何已知方法。該方法基于待轉化的宿主細胞進行選擇，且可以包括但不限于，吸收質粒穿過細胞膜、病毒感染、電穿孔、脂質轉染、和粒子轟擊。此種“轉化的”細胞包括其中插入的DNA能夠作為自主復制質?；蜃鳛樗拗魅旧w部分復制的穩(wěn)定轉化的細胞。它們還包括瞬時表達插入的DNA或RNA 有限時間段的細胞。本文使用的術語“宿主細胞”的類型并不受特別限制。在一個實施方案中，宿主細胞包括選自任何生物界的原核和真核細胞。在另一個實施方案中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物和動物細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞包括但不限于原核物種，例如大腸桿菌(Escherichia coli);哺乳動物細胞系，例如CHO、HEK 293、COS、NSO、SP2和PER. C6 ；昆蟲細胞系Sf9和真菌細胞物種，例如釀酒酵母?？梢詫藴始夹g用于重組DNA、寡核苷酸合成、以及組織培養(yǎng)和轉化(例如，電穿孔、脂質轉染)。需要說明的是，在本文中所使用的術語“轉化”與“轉染”是可以互換使用的，均是指將外源核酸序列引入宿主細胞中的操作。在分離重組細胞后，可以通過PCR方法驗證重組細胞中是否含有目的核酸序列。當然也可以通過分析目的核酸序列表達蛋白的酶活性來驗證。但從效率角度來考慮，優(yōu)選通過PCR方法驗證，因而，根據(jù)本發(fā)明的實施例，還可以進一步包括通過PCR方法驗證重組細胞中含有所述目的核酸序列的步驟。基因敲除在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了用于從非人動物細胞中敲除SNXll基因的手段。首先，提供了一種可以用于從非人動物細胞中敲除SNXll基因的載體(在本發(fā)明中，該載體也被稱為“敲除載體”)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該敲除載體包含與染色體上SNXl I外顯子側翼的上游和下游序列同源的基因組DNA序列。選擇此同源序列的長度為允許與SNXll等位基因定向同源重組的長度。該同源序列的長度可為2.5kb直至300kb。優(yōu)選地，此同源序列的長度是3kb至6kb。優(yōu)選地，該同源序列包含SNXll啟動子的至少一部分。如圖11所示，發(fā)明人按照以下步驟構建用于SNXll基因敲除的載體并將其轉入小鼠胚胎干細胞首先，為了研究SNXll的體內作用，發(fā)明人利用Neo-PGK基因框取代了 exon 4和5的靶載體構建SNXll基因敲除載體(圖11A)。然后，將上述構建好的線性SNXll基因敲除載體轉入129/6S胚胎干細胞中，并篩選獲得298個胚胎干細胞克隆。獲得的四個陽性克隆中的其中之一被注入C57BL/6J囊胚以繁殖嵌合體小鼠。接著，將其與C57BL/6J小鼠雜交，以獲得混合遺傳背景的雜合子小鼠。然后，將這些雜合子小鼠自交獲得SNXll敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)。然后，通過PCR鑒定這些雜合子小鼠的后代的基因型，其中PCR是利用I個野生型等位基因上共有的反義引物(P3)和2個分別位于目標等位基因(P2)和野生型等位基因(Pl)上的正義引物進行的。其中，PCR檢測結果如圖IlB所示。對小鼠大腦中SNXll的mRNA進行RT-PCR分析證實，SNXll缺陷小鼠完全缺乏SNXll的mRNA(見圖11C)。其中，上述基因敲除小鼠由上海南方模式生物研究中心制備。上述引物P1、P2、P3的序列如下所示Pl :5，-GTTCCCGACAGAAGATTTACAAG-3’ (SEQ ID NO 3)；P2 :5，-CGGAGATGAGGAAGAGGAGAACA-3，(SEQ ID NO 4)；P3 :5，-GCTGCCTATCAAGCCACTAGG-3’ (SEQ ID NO :5)。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該敲除載體可以額外地包含報道基因。所述報道基因位于同源的SNXll側翼序列之間。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選地，在向基因組內整合后，所述報道基因表達受到SNXll啟動子及任選地受到其它SNXll調節(jié)元件的控制。報道基因可選自LacZ或其衍生物、堿性磷酸酶、熒光蛋白質、螢光素酶或可在多種組織或細胞中特異性檢測和定量的其它酶或蛋白質。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選地，該報道基因是LacZ。在一個優(yōu)選的實施方案中，在SNXlI基因組序列內插入此報道基因，從而保留了 SNXlI基因的內源起始密碼子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，還可以進一步包含選擇標記基因，以便便于篩選。選擇標記基因可以是正選擇標記。正選擇標記可選自新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、殺稻瘟素S抗性基因、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因或zeomycin抗性基因?？梢栽谡x擇標記外側加入重組酶識別位點，此識別位點允許在選擇了成功同源重組事件后切除正選擇標記基因。因此，可以避免正選擇標記表達對報道基因表達的任何影響。此重組酶識別位點可選自包含針對flp重組酶的frt位點和針對ere重組酶的IoxP位點(包括突變的IoxP位點)。優(yōu)選地，正選擇標記是新霉素抗性基因。選擇標記基因還可以是負選擇標記。負選擇標記可選自但不限于白喉毒素基因和HSV-胸苷激酶基因。優(yōu)選地，負選擇標記是白喉毒素基因。優(yōu)選地，該敲除載體同時包含正選擇標記和負選擇標記。更優(yōu)選地，該敲除載體包含新霉素抗性基因和白喉毒素基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，敲除載體是整合在質粒中(如圖11A)。本發(fā)明還提供了產生非人的基因敲除動物的方法，該動物SNXll基因的一個或兩個等位基因發(fā)生突變和/或截短以致于表達較低活性或無活性的SNXll蛋白質，優(yōu)選地，非人的基因敲除動物中SNXll基因的Exon 4和5被neo替換，見圖11A。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該產生非人的基因敲除動物的方法包括(a)通過同源重組向胚胎干細胞基因組內導入如上所述的敲除載體，(b)從所述的胚胎干細胞中繁殖雜合和/或純合的基因敲除動物，以及(c)產生非人的基因敲除動物，該動物SNXll基因的一個或兩個等位基因被突變和/或截短以致于表達較低活性或無活性的SNXll蛋白質。在一個優(yōu)選的實施方案中，在該產生非人的基因敲除動物的方法的步驟(C)中可產生非人的基因敲除動物，該方法還進一步包括將所產生的基因敲除動物進一步與可識別正選擇標記基因外側的識別位點的重組酶轉基因動物雜交繁殖。如通過Joyner，A. L. (Gene Targeting. 1999,第二版,The PracticalApproach Series,Oxford UniversityPress, New York)和 Hogan, B.等(Manipulating the mouse embryo. 1994,第二版，ColdSpring HarborPress, Cold Spring Harbor,通過參照將其并入本文)所提供的方法,本領域可常規(guī)地得到包含定向突變的基因敲除動物。例如，可通過如下步驟產生上述方法中的雜合和/或純合的基因敲除動物對攜帶如上所述的靶向SNXll等位基因的胚胎干(ES)細胞克隆進行選擇、驗證重組胚胎干細胞克隆中的定向突變、向野生型動物的胚泡中注入已驗證的重組胚胎干細胞、將這些已注射的胚泡轉移至假孕代孕母體中、將來自胚泡的嵌合體培育為野生型動物、檢驗來自這些繁殖體的后代中定向突變的存在、繁殖雜合動物以任選地產生純合基因敲除動物。本領域所用且還可在本發(fā)明方法中利用的胚胎干細胞包括例如源自小鼠品系如C57BL/6、BALB/c、DBA/2、CBA/和SV129的胚胎干細胞。優(yōu)選地，使用源自C57BL/6小鼠的胚胎干細胞(Seong, E 等(2004) TrendsGenet. 20, 59-62 ；ffolfer, D. P.等，TrendsNeurosci. 25 (2002) :336_340，通過參照將其并入本文)。
本發(fā)明還提供了通過以上所述的任一方法所產生的非人的基因敲除動物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提供了非人的基因敲除動物，該動物SNXll基因的一個或兩個等位基因被突變和/或截短以致于表達較低活性或無活性的SNXll蛋白質。優(yōu)選地，可以用報道基因替代非人的基因敲除動物SNXll基因的一個或兩個等位基因。優(yōu)選地，該報道基因是 LacZ0在一個優(yōu)選的實施例中，提供了非人的基因敲除動物，該動物SNXll基因的一個或兩個等位基因包含IacZ等位基因。非人的基因敲除動物可以是本領域內所知的任意可用于本發(fā)明方法的動物。優(yōu)選地，本發(fā)明動物是哺乳動物，更為優(yōu)選地本發(fā)明基因敲除動物是嚙齒動物。最優(yōu)選的非人的基因敲除動物為小鼠。甚至更優(yōu)選地，非人的基因敲除動物是C57BL/6的同類系突變小鼠品系。本發(fā)明還涉及如本發(fā)明所提供的非人的基因敲除動物的后代(也可稱為后裔)，其通過與相同或另一基因型的動物繁殖得到。還可以通過與相同遺傳背景的動物繁殖得到后代?；蚯贸齽游锟捎糜谥苽湓毎囵B(yǎng)物以及用于制備源自這些動物的原代細胞制品的次代細胞系。此外，基因敲除動物可用于制備組織外植體或器官外植體及其培養(yǎng)物。此外，基因敲除動物還可用于制備組織提取物或細胞提取物，如膜制品或突觸小體制
品O本發(fā)明還提供了如本發(fā)明所提供的非人的基因敲除動物或其后代的原代細胞培養(yǎng)物及次代細胞系。此外，本發(fā)明提供了如本發(fā)明所提供的非人的基因敲除動物或其后代的組織外植體或器官外植體和其培養(yǎng)物，以及組織提取物或細胞提取物。組織提取物或細胞提取物是例如膜制品或突觸小體制品?？墒褂美鐝脑搫游锏奈膊炕罱M織檢查中分離的DNA，通過包括基因組DNA印跡和PCR分析的多種方法檢測遺傳性構建體整合入基因組。對本領域技術人員顯而易見的是，存在可用于檢測報道基因表達的多種分析性方法，其包括RNA水平的方法，如通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)或RNA印跡、原位(insitu)雜交對mRNA定量，以及蛋白質水平的方法，包括組織化學、免疫印跡分析和體外(invitro)結合研究。還可以通過本領域技術人員常用的ELISA技術確定靶基因表達水平的量可使用多種標準測定法完成定量性測量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保護作用、RNA印跡分析和RNA點印跡分析的雜交方法測量轉錄水平。通過ELISA、蛋白質印跡分析以及通過比較免疫組織化學或組織化學染色的組織切片分析蛋白質水平。還可用免疫組織化學染色、酶組織化學染色及免疫電子顯微鏡法評估存在或不存在SNXll蛋白質。還可以使用組織切片的免疫組織化學IacZ染色或組織化學IacZ染色，或者用組織勻漿物或組織提取物所開展的定量性酶IacZ測定法，利用在SNXll非人的基因敲除動物中的NLSlacZ報道分子定量SNXll表達。由此，本發(fā)明的又一方面提出了一種動物細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該動物細胞的SNXll基因的表達量下降。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在該動物細胞的基因組中，SNXll被敲除。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該動物為小鼠。發(fā)明人在建立SNXll基因敲除小鼠之后，并對敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染瘧原蟲的情況進行了比較，進而對SNXll基因對抗感染免疫血功能進行了分析研究。結果顯 示，與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制瘧原蟲的增殖，并有較高比率的小鼠存活(如圖7)。進一步免疫學分析顯示，來自SNXll缺陷鼠的脾臟細胞在體外表現(xiàn)出更強的細胞增殖反應和分泌與抗瘧疾免疫力相關的白介素12IL-12)和Y干擾素(如圖8)，表明瘧疾感染在SNXll缺陷鼠可誘導更強的免疫反應。瘧原蟲感染后檢測血清特異性抗體水平顯示，SNXll小鼠產生了高水平的抗瘧疾抗體(如圖9)。SNXll基因表達水平分析表明，該基因在腦組織中表達豐富；在主要免疫細胞中SNXll都有表達，其中，在SNXll基因在中性粒細胞中表達最高，而且在瘧原蟲感染后，該基因表達在所分析的多種細胞(CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和自然殺傷細胞)中均有顯著下降(如圖10)。具體地圖7顯示了 SNXl I敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)感染小鼠瘧原蟲(Plasmodium berghei)后的血蟲水平變化(A)和存活率(B)，其中，如圖所示，WT表示野生型小鼠，KO表示基因敲除小鼠，圖7A的縱軸為紅細胞中寄生蟲血癥的比例，圖7B的縱軸為小鼠的存活比例，兩圖的橫軸均為感染后的天數(shù)；圖8顯示了來自SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)的脾臟細胞體外增殖反應水平(A)和分泌ga_a干擾素(B)及白介素12(C)的能力，其中，如圖所示，WT表示未感染的野生型小鼠，KO表示未感染的基因敲除小鼠，WT Pb-inf表示感染后的野生型小鼠，KO Pb-inf表示感染后的基因敲除小鼠，圖8A顯示了未感染(WT/K0)，感染后(WT Pb-inf,KO Pb-inf)小鼠的脾臟細胞樣品在對照(Medium)及瘧原蟲抗原(Pb-Ag)再刺激后的體外增殖反應水平，其中CPM(count per minute)是用3H_Thymidine標記細胞增殖時液閃的讀數(shù)，圖SB和圖SC分別顯示了前述相同樣品中的ga_a-干擾素及白介素12的水平；圖9顯示了瘧疾感染5周后，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)血清抗瘧原蟲特異性抗體水平，其中從左至右的三個圖分別顯示了感染后，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)的血清中總的瘧原蟲特異抗體(Ig)及其亞型(IgGl和IgG2a)的水平；圖10顯示了 SNXll基因在小鼠不同組織器官中㈧和分離純化的免疫細胞(B)中的表達水平，其中，如圖IOA所示，橫軸中H，心臟；Li，肝臟；K,腎臟；Lo，肺臟；S，脾臟；Sto,胃組織；Thy，胸腺；B，腦組織；Int，腸組織；M，肌肉組織；T，睪丸。如圖IOB所示，橫軸中:CD4，CD4陽性細胞;CD8，CD8陽性細胞;B，B細胞;DC，樹突狀細胞；Mac,巨噬細胞；Neut,中性粒細胞；NK，自然殺傷細胞。應用如前所述發(fā)明人經過分析，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新型多肽在SNX家族進化樹上與SNXlO最為接近，二者PX結構域的相似性為78%。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中表達SNXll后發(fā)現(xiàn)它不產生和SNXlO相似的成泡現(xiàn)象。而當發(fā)明人將SNXlO和SNXll共轉染到細胞中時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll可以顯著的抑制SNXlO誘導的成泡現(xiàn)象。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll抑制了晚期內涵體的異常擴大和成熟，但對Rab7的募集不產生影響。進一步，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與SNXlO相反，SNXll結合V-ATPase，抑制了 SNXlO對它的激活，從而抑制了 SNXlO造成的晚期內涵體的異常擴大。并且通過表達SNXll可以抑制VacA在細胞中的空泡化作用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在VacA處理后的細胞中，出現(xiàn)大量的擴大的晚期內涵 體。當細胞轉染表達根據(jù)本發(fā)明實施例的多肽SNXll后，雖然Rab7依然出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，但晚期內涵體的進一步擴大則被抑制。因而，本發(fā)明的SNXll及其編碼基因、表達載體以及表達該基因的重組細胞，可以用于治療胃潰瘍、降低抑制V-ATPase或抑制SNXlO造成的晚期內涵體的異常擴大。由此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提出了 SNXll及其編碼基因、表達載體以及表達該基因的重組細胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于下列至少之一治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內涵體的異常擴大。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的SNXll蛋白和藥學可接受的載體的藥物組合物。包含本發(fā)明的SNXll蛋白的藥物組合物用于在下述方面使用，但不限于下述方面，病癥診斷、檢測或監(jiān)控，病癥或其一種或多種癥狀的預防、治療、管理或改善和/或研究。在具體實施例中，還可以包含其他已知已經在該病癥例如胃潰瘍的預防、治療、管理或改善中有用，或已在其中使用或目前正在其中使用的藥物。依照這些實施方案，組合物可以進一步包含藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明的SNXll蛋白可以摻入適合于給受試者施用的藥物組合物內。一般地，藥物組合物包含本發(fā)明的SNXll蛋白和藥學可接受的載體。如本文使用的，“藥學可接受的載體”包括生理學相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。藥學可接受的載體的例子包括下述一種或多種水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其組合。在許多情況下，將優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化鈉。藥學可接受的載體可以進一步包含少量輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液，所述輔助物質增強結合蛋白的保存期限或效力。各種遞送系統(tǒng)是已知的，且可以用于施用本發(fā)明的SNXll蛋白或本發(fā)明的SNXll與其他藥物的組合，用于預防、管理、治療或改善病癥或其一種或多種癥狀，例如治療胃潰瘍。例如，被囊化在脂質體中、微粒、微膠囊、能夠表達SNXll的表達載體和重組細胞、受體介導的胞吞(參見，例如，Wu和ffu, J. Biol. Chem. 262 =4429-4432 (1987))、作為逆轉錄病毒或其他載體部分的核酸構建等等。施用本發(fā)明的預防或治療劑的方法包括但不限于，腸胃夕卜施用(例如，皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下)，硬膜外施用，瘤內施用和粘膜施用(例如，鼻內和經口途徑)。在具體實施方案中,本發(fā)明的藥物通過肌內、靜脈內、瘤內、經口、鼻內、肺、或皮下施用。預防或治療劑可以通過任何方便的途徑施用，例如通過輸注或單次快速靜脈注射，通過經由上皮或粘膜皮膚襯里(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，且可以連同其他生物學活性劑一起施用。施用可以是全身或局部的。在具體實施方案中，可能需要使本發(fā)明的預防或治療劑局部施用在需要治療的區(qū)域；這可以通過例如但不限于局部輸注、注射、或通過植入物來完成，所述植入物為多孔或無孔材料，包括I吳和基質，例如娃橡I父I吳、聚合物、纖維基質(例如，Tissuel )、或I父原基質。另外，發(fā)明人建立了 SNXll基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制瘧原蟲的增殖，并有較高比率的小鼠存活，來自SNXll缺陷鼠的脾臟細胞在體外表現(xiàn)出更強的細胞增殖反應和分泌與抗瘧疾免疫力相關的白介素12 (IL-12)和Y干擾素，表明瘧疾感染在SNXll缺陷鼠可誘導更強的免疫反應。瘧原蟲感染后檢測血清特異性抗體水平顯示，SNXll小鼠產生了高水平的抗瘧疾抗體。SNXll基因表達水平分析表明，該基因在腦組織中表達豐富；在主要免疫細胞中SNXll都有表達，其中，在SNXll基因在中性粒細胞中表達最高，而且在瘧原蟲感染后，該基因表達在所分析的多種細胞(CD4T細胞、 CD8T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和自然殺傷細胞)中均有顯著下降。由此，發(fā)明人提出了一種抑制哺乳動物中瘧原蟲增殖的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括降低所述哺乳動物中SNXll基因的表達。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以通過將哺乳動物細胞中的SNXll基因進行沉默，例如敲除，通過使用SNXll活性抑制劑、SNXll表達抑制劑諸如RNAi技術，抑制哺乳動物中瘧原蟲增殖。由此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提出了抑制SNXll基因表達的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制瘧原蟲的增殖。關于藥物的賦形劑等方面的描述，前面針對胃潰瘍所描述的內容，同樣適用，不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種篩選可以用于抑制瘧原蟲增殖的藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括將前面所述的表達SNXll的重組細胞與藥物候選物接觸，并檢測與所述藥物候選物接觸前后，所述表達SNXlI的重組細胞中SNXll基因的表達量，以便分別獲得第一表達量和第二表達量；以及第二表達量低于第一表達量為所述藥物候選物為用于抑制瘧原蟲增殖的藥物的指示。與藥物候選物接觸后，SNXll基因的表達量比接觸前有所降低，可以確定該藥物候選物可以作為抑制SNXll基因表達的試劑，進而，可以用于抑制瘧原蟲的增殖。因而利用該方法，能夠有效地篩選抑制瘧原蟲的增殖的藥物。下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所采用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關產品進行，所采用的試劑和產品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。實施例I :SNX11基因的擴增提取HEK293T細胞RNA，反轉錄成cDNA。根據(jù)Genbank發(fā)表的人SNXll序列(NCBIgene ID :29916)，設計引物，在293T cDNA中擴增出SNXll基因片段，連入PCR3. l-GFP-flag載體。用于擴增的引物hSNXlIU ATGGGCTTTTGGTGTAGGATGTCGG(SEQ ID NO :6)hSNXlIL CTTTTCCAAAACTGTTTCTAACTGACCAGGG(SEQ ID NO :7)將PCR產物連入PCR3. I載體的EcoRV位點，用載體上游引物T7 (TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO :8))和 SNXll 下游引物hSNXllL鑒定基因插入方向，并測序鑒定序列。最終構建完成PCR3. 1-hSNXl l-GFP-flag真核表達載體，用于在哺乳動物細胞中表達SNX11。
實施例2 =SNXll晶體的解析蛋白表達和純化發(fā)明人構建了 2個SNXll片段，用于SNXll的結構研究。其中一個是具有殘基7-142的SNX11-142C，另一個是具有殘基7-170的SNX11-170C。這兩個cDNA片段被插入pET21a中，并通過測序驗證。蛋白在生長于LB培養(yǎng)基上的Rosetta2(DE3)細胞中表達。其中，當0D_的值為O. 6-0. 8時，于16°C下，將細胞用O. 3毫米的IPTG誘導22小時后，細胞中SNX11-142C表達;當OD600的值為O. 6-0. 8時，于25°C下，將細胞用O. 3毫米的IPTG誘導14小時后，細胞中SNX11-170C表達。通過離心、洗滌收集細菌，并于4°C下將其重懸于裂解液(20mM Tris-HCl，pH 8. 0,300mM NaCl，7mM β-巰基乙醇)中。然后，通過3次超聲將細胞進行裂解。最后，利用標準規(guī)程的Ni2+親和柱(GE醫(yī)療)純化SNX11-142C。而將洗脫的蛋白進一步純化是通過凝膠過濾進行的，其中，凝膠過濾使用經過包含20mM MES, pH 6.5,IOOmM NaCl and 5mM DTT 的緩沖液平衡的 Superdex 75 柱(GE 醫(yī)療)。SNX11-170C 的純化方法與SNX11-142C —樣，只是在經過Ni2+親和層析柱純化后，會產生還原甲基化37。結晶、數(shù)據(jù)收集和結構確定在293K 溫度下，通過 Sitting-drop Vapor Diffraction 方法，利用來自 HamptonResearch 的 Sparse Matrix Crystallization Kit 對 SNX11-142C(濃度為 6. 5mg/ml)和甲基化的SNXl 1-170C(濃度為5. 5mg/ml)進行結晶。SNX11-142C晶體從0. 2M硫酸銨，0. IMpH 6. 5的二甲砷酸鈉三水和30%聚乙二醇8000中長出。甲基化的SNX11-170C晶體在含有0. IM pH7. 5的羥乙基和20%聚乙二醇8000的情況下出現(xiàn)。在數(shù)據(jù)收集之前，利用添加有30% PEG400作為冷凍保護劑的母液，將晶體進行低溫冷卻。衍射數(shù)據(jù)是在上海同步輻射裝置(the Shanghai Synchrotron Radiation Facility)的 17U 光束線下，于 100K 溫度下，波長為0.9792 A時測定的。SNX11-142C晶體屬于在不對稱單位中具有兩個分子的空間群P2lt)甲基化的SNX11-170C晶體屬于每一個不對稱單位包含一個分子的空間群Ρ〗,*。利用程序Mosflm38處理數(shù)據(jù)集。通過以Grdl9p(PDB code 10CS)作為搜索模型的分子替換解析SNX11-142C的結構。利用DM39對初始階段的數(shù)據(jù)進行優(yōu)化。利用ARP/wARP40完成建模。甲基化SNX11-170C的晶體結構是利用SNX11-142C模型的分子替換進行解析的。利用Buccaneer41進行模型建立。使用Refmac42對以上兩種晶體的結構進行細化。盡管對SNX11-170C進行了甲基化處理，但其賴氨酸殘基顯示，與那些未甲基化的SNX11-142C相t匕，兩者沒有顯著差異。實施例3 =SNXll與SNX10功能的研究一、SNXll抑制晚期內涵體(late endosome, LE)的成熟
發(fā)明人首先在細胞中轉染構建的SNXll真核表達載體。發(fā)現(xiàn)在Hela細胞中過表達SNXll并不能引起與SNXlO相似的細胞空泡化現(xiàn)象。相反，當將SNXll與SNXlO載體同時轉染進Hela細胞時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXlO引起的空泡被顯著抑制(圖1，A)。通過用Rabs標記不同的內涵體形式，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在表達SNXlO的細胞中，空泡表面都被Rab7所標記。這說明SNXlO的作用是促進晚期內涵體的擴大化(圖1，B)。而在同時表達SNXlO，SNXlI的細胞中，SNX10, SNXll共定位在同一類內涵體結構上。這類內涵體表面同時有Rab5(早期內涵體標記)和Rab7。這一結果說明盡管Rab7在這些內涵體上的募集并沒有被阻止，SNXlO誘導下晚期內涵體的進一步擴大被抑制了(圖l，c)。(在上述實驗中，發(fā)明人用lipofectamin2000將SNX10，SNXll表達載體轉染入Hela細胞。轉染后24小時用相差顯微鏡照相分析空泡化情況或將細胞固定進行免疫熒光操作，然后用激光共聚焦顯微鏡分析其內涵體結構和定位。)發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)SNXlO對內涵體的調節(jié)通過V-ATPase來完成。發(fā)明人進一步分析了 SNXll調節(jié)內涵體的分子機制。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，SNXll與V-ATPase的一個亞基VlD與相互作用(圖1，D)。這說明SNXll也可能通過對V-ATPase活性的調節(jié)來完成其對內涵體形 態(tài)的調節(jié)。(在本實驗中，發(fā)明人將flag-tagged的SNXll或GFP載體和HA-tagged的VlD載體用PEI共轉染入293T細胞，轉染48小時后裂解細胞做免疫共沉淀，用表面偶聯(lián)flag抗體的樹脂沉淀SNXll或GFP,然后用western blot檢驗VlD蛋白水平。)二、SNXll抑制VacA引起細胞空泡化VacA是幽門螺旋桿菌分泌的空泡毒素，它進入胃表皮細胞后可以引起劇烈的空泡化現(xiàn)象。在機制研究中，經常用Hela來完成這一過程。發(fā)明人在Hela細胞中轉染SNX11GFP或GFP對照，然后對這些細胞用VacA進行處理。結果發(fā)現(xiàn)在表達SNXlIGFP的細胞中，VacA誘導空泡的能力顯著降低(圖2A，B)。進一步分析這些細胞中的內涵體變化。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在表達GFP的細胞中，VacA誘導出大量晚期內涵體空泡(Rab7標記)。而在表達SNXll的細胞中，只有很少Rab7標記的膜泡被擴大(圖2，C)。SNXll與Rab7有明顯的共定位。這些結果說明SNXll可以抑制VacA引起的晚期內涵體擴大，在一定程度上減弱VacA對細胞的毒性。實施例4、SNX11敲除小鼠的構建發(fā)明人按照以下步驟構建用于SNXll基因敲除的載體并將其轉入小鼠胚胎干細胞首先，為了研究SNXl I在體內的作用，發(fā)明人通過一個利用Ne0-PGK基因盒取代了exon4和5的靶載體構建SNXll基因敲除載體(圖11A)。然后，將上述構建好的線性SNXll基因敲除載體轉入129/6S胚胎干細胞中，并篩選獲得298個胚胎干細胞克隆。獲得的四個陽性克隆中的其中之一被注入C57BL/6J囊胚，以繁殖嵌合體小鼠。其由C57BL/6J育成，以期獲得混合遺傳背景的雜合子小鼠。將這些雜合子小鼠進行交配，以繁殖獲得SNXll敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)。然后，通過PCR鑒定這些雜合子小鼠的后代的基因型，其中PCR是利用I個野生型等位基因上共有的反義引物(P3)和2個分別位于目標等位基因(P2)和野生型等位基因(Pl)上的正義引物進行的。其中，PCR檢測結果如圖IlB所示。對小鼠大腦中SNXll的mRNA進行RT-PCR分析證實，SNXll缺陷小鼠完全缺乏SNXll的mRNA(見圖 11C)。
實施例5、SNXll敲除小鼠活性觀察按照以下步驟檢測比較SNXll敲除小鼠及對照的活性將在液氮中保存的小鼠紅細胞期痕原蟲Plasmodium berghei蟲種經腹腔注射到普通BALB/c小鼠；感染后6-9天檢測血液中瘧原蟲水平(方法見后述)，待血蟲水平達到15%左右時，從小鼠采血，用PBS稀釋到每毫升含IO6瘧原蟲感染的紅細胞。然后，對實驗動物即SNXll敲除小鼠及其對照，經腹腔注射上述獲得的瘧原蟲感染的紅細胞( ο6/只)。自感染后3天開始，從小鼠尾尖采血，制備血抹片，空氣中晾干后，用吉姆薩染液染色。并在晾干后于顯微鏡下計數(shù)被瘧原蟲感染的紅細胞的百分比，即血蟲水平(=每一百個紅細胞中感染了瘧原蟲的紅細胞數(shù)量)。對敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染瘧原蟲的情況的比較結果見圖7。圖7顯示了SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)感染小鼠瘧原蟲(Plasmodium berghei)后的血蟲水平變化(A)和死亡率(B)。結果顯示，與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制 瘧原蟲的增殖，并有較高比率的小鼠存活。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。盡管已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。
權利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.一種分離的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸編碼權利要求I所述的多肽，優(yōu)選地所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
3.—種表達載體，其特征在于，包含編碼權利要求I所述的分離的多肽的核酸分子，優(yōu)選地包含如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
4.ー種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞中包含編碼權利要求I所述多肽的核酸分子，優(yōu)選地包含如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列,任選地所述細胞為動物細胞,優(yōu)選非人哺乳動物細胞，更優(yōu)選嚙齒類動物細胞，最優(yōu)選小鼠細胞。
5.ー種制備權利要求4所述重組細胞的方法，其特征在于，包括使用權利要求3所述的表達載體轉化宿主細胞；以及分離重組細胞，任選地所述宿主細胞為動物細胞，優(yōu)選非人哺乳動物細胞，更優(yōu)選嚙齒類動物細胞，最優(yōu)選小鼠細胞。
6.權利要求I所述的多肽、權利要求2所述的寡核苷酸、權利要求3所述的表達載體或權利要求4所述的重組細胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于下列至少之ー治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內涵體的異常擴大。
7.—種藥物，其特征在于，包含選自權利要求I所述的多肽、權利要求2所述的寡核苷酸、權利要求3所述的表達載體或權利要求4所述的重組細胞的至少ー種，所述藥物用于下列至少之ー治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內涵體的異常擴大。
8.ー種動物細胞及其衍生物，其特征在于，所述動物細胞的SNXll基因的表達量下降，任選地，所述動物細胞的基因組中，至少ー個SNXll等位基因被敲除，優(yōu)選所述動物細胞為非人哺乳動物細胞，更優(yōu)選嚙齒類動物細胞，最優(yōu)選小鼠細胞。
9.一種用于SNXll基因敲除的載體，其特征在于包含摘入序列，所述摘入序列不具有SNXll基因的全部活性；第一同源臂，所述第一同源臂位于所述插入序列的上游；以及第二同源臂，所述第二同源臂位于所述插入序列的下游，其中，所述第一同源臂和第二同源臂適于與基因組上SNXll基因的側翼區(qū)發(fā)生同源重組。
10.一種構建SNXll基因敲除動物的方法，其特征在于，包括通過同源重組向胚胎干細胞基因組內導入如上權利要求9所述的載體；從所述胚胎干細胞中繁殖雜合和/或純合的基因敲除動物，以及獲得所述SNXll基因敲除動物，優(yōu)選所述動物為非人哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒類動物，最優(yōu)選小鼠。
11.抑制SNXll基因表達的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制瘧原蟲的增殖。
12.—種篩選用于抑制瘧原蟲的増殖的藥物的方法，其特征在于，包括將權利要求4所述的重組細胞與藥物候選物接觸；檢測與所述藥物候選物接觸前后，所述重組細胞中SNXll基因的表達量，以便分別獲得第一表達量和第二表達量；以及 第二表達量低于第一表達量為所述藥物候選物為用于抑制瘧原蟲増殖的藥物的指示。
全文摘要
本發(fā)明提出了SNX家族的新基因及其用途。其中，一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。該多肽，能夠治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNX10造成的晚期內涵體的異常擴大。
文檔編號A61K38/17GK102827265SQ201210299799
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權日2012年8月21日
發(fā)明者舒曉東, 裴端卿, 劉勁松, 蘇鐘, 徐進新, 吳斌, 張雷 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院