表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種表達嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9C。通過RT-PCR方法從嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum獲得糖苷水解酶基因CtAA9c，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達載體pPIC9K中，然后將得到的糖苷水解酶基因CtAA9c表達載體pPIC9K/CtAA9c導(dǎo)入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一種表達糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌GS-CT-9C。該工程菌表達的糖苷水解酶CtAA9C對內(nèi)切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始內(nèi)切酶N24的降解纖維素的活性提高1.4倍。在Mn2+條件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纖維素酶活性可分別提高15倍和3.5倍。CtAA9C具有良好的熱穩(wěn)定性和提高纖維素酶活力的能力，可廣泛用于纖維廢料及其它工業(yè)領(lǐng)域，具有重大經(jīng)濟價值和社會價值。
【專利說明】表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株(-)【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及生物工程，具體地說是一種表達具體地說是以嗜熱毛殼菌Chaetomiumthermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株P(guān)ichia pastorisGS-CT-9C。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]糖苷水解酶(英語:Glycoside hydrolases,又稱糖苷酶)是一種專門水解配糖鍵(glycosidic bond)，并產(chǎn)生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這類蛋白質(zhì)在人類的產(chǎn)業(yè)上也有所應(yīng)用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質(zhì)能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。
[0003]嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中50°C條件下可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶和9家族糖苷水解酶。
[0004]嗜熱毛殼菌產(chǎn)生的9家族糖苷水解酶CtAA9C具有微弱的纖維素酶活性，但對該菌株產(chǎn)生的內(nèi)切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，可使其活性提高1.4倍。在不同金屬離子如Mn2+的作用下，CtAA9C和CtAA9C+N24的活性可分別提高15倍和3.5倍。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明從嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum獲得內(nèi)切β-1, 4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全長，命名為CtAA9c，CtAA9c基因DNA全長1020bp，包括信號肽序列，起始密碼子和終止密碼子，無內(nèi)含子，編碼313個氨基酸，具有信號肽序列(l-26aaMPPSTSSLLSILLTLSSTLIH)PVFA)。將CtAA9c編碼的氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發(fā)現(xiàn)屬于糖苷水解酶第9家族。
[0006]構(gòu)建重組表達質(zhì)粒載體pPIC9K/CtAA9c，利用電轉(zhuǎn)儀進行電擊轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GSl 15，在MD和麗培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，然后進行甲醇誘導(dǎo)表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CT-9C。該工程菌株接種于含BMGY培養(yǎng)基中，在28°C 200rpm/min搖床培養(yǎng)6d后，糖苷水解酶的表達量為3.24mg/ml，分子量為65KDa，酶活力為0.0483~1111，(^449(:在651:下是穩(wěn)定的，處理601^11后仍有95%以上的酶活性；70°C處理30min后仍保持74.4%的活性；80°C處理30min后保持24.8%的活性；90°C處理30min活性幾乎完全喪失。
[0007]9家族糖苷水解酶CtAA9C對嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum內(nèi)切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力提高1.4倍。不同金屬離子對CtAA9C和CtAA9C+N24混合酶活性具有促進或抑制作用，其中在Mn2+條件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纖維素酶活性可分別提高35倍和3.5倍。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】:[0008]圖1 9家族糖苷水解酶CtAA9C的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1:低分子量蛋白標準
[0010]泳道2:純化的9家族糖苷水解酶CtAA9C
[0011]圖2 A: 9家族糖苷水解酶CtAA9C的最適溫度
[0012]B: 9家族糖苷水解酶CtAA9C的熱穩(wěn)定性測定
[0013]圖3 9家族糖苷水解酶CtAA9C對內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進作用
[0014]圖4金屬離子Mn2+對CtAA9C纖維素酶及混合酶活性的影響
(五)【具體實施方式】
[0015]實施例1:嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum的分離鑒定
[0016](I)標本采集:從堆肥中采集。
[0017](2)分離培養(yǎng):將采集標本取0.5克放置在PDA平板上50°C培養(yǎng)3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻。
[0018](3)鑒定:參考 Coo ney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻。
[0019]實施例2:糖苷水解酶基因CtAA9c的克隆
[0020](I)嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum總RNA的提取:參照Trizol試劑盒說明。
[0021](2)cDNA 第一條鏈的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0試劑盒說明書進行:取I~2 μ g總RNA，加RNase Free ddH20至9.5 μ L，將RNA樣品在75°C變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分:10mmol/L dNTP Mixture 2 μ L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24y L, Oligod (T) -Adaptor Primer I μ L, RNase Inhibiter 0.5 μ L, AMV Reverse Transcriptase IuL(Final Volume 20 μ L),將反應(yīng)液混合后，室溫下放IOmin,然后42°C溫育60min,再煮沸5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。加入180 μ L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 μ L，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備用。
[0022](3) PCR 反應(yīng)(25yL):cDNA 2 μ L, IOXBuffer 2.5 μ L, 10mmol/L dNTP2μ L, 25mmol/LMgC12 2 μ L,上、下游引物各 2 μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5yL(5U/μ L), ddH2012y L0 反應(yīng)條件為 94°C 5min 預(yù)變性；94°C 40s，54°C 40s, 72 °C lmin,共 32個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
[0023]上游引物:5’ -ATGCCTCCTTCAACGAGTTCAC-3 ’
[0024]下游引物:5’ -TTAACCCCTAAGATGATAC-3 ’
[0025](4)基因克隆:取0.5μ I PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照TAKARA公司產(chǎn)品說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci菌株，在表面涂有氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[0026](5)質(zhì)粒DNA的提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。
[0027](6)序列測定:DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行。序列引物為M13啟動子引物。嗜熱毛殼菌CtAA9c基因cDNA全長1020bp，包含起始密碼子和終止密碼子，無內(nèi)含子，編碼313個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發(fā)現(xiàn)屬于糖苷水解酶第9家族。該序列如下:[0028]⑷SEQ ID NOl 的信息
[0029](a)序列特征:*長度:1020堿基對；*類型:核酸；*鏈型:雙鏈；*拓撲結(jié)構(gòu):線性
[0030](b)分子類型:DNA
[0031](C)假設(shè):否
[0032](d)反義:否
[0033](e)最初來源:嗜熱毛殼菌 Chaetomium thermophilum
[0034](f)序列描述:
[0035]I ATGCCTCCTT CAACGAGTTC ACTTCTTTCA ATCCTGCTTA CTCTCAGCTC CACACTCATC
[0036]61 CCTGACCCGG TATTCGCCCA CTCTCATCTC TCCCACATCG TCGTCAACGG GGCTCTCTAC
[0037]121 CACGGCTATG ACCCGCGAAG CCCCGTTAAG AACCCTGATA GCAACAAAAC ATACAACAAT
[0038]181 CCCAGACCCA ACCATCCTGG TAGTGTTGCT TGGTCATATG CCGCTTTCGA CGATGGCTTC
[0039]241 GTCGCCCCAG AAAATTACTC ACATCCGGAT ATAATTTGTC ACATCGGTGC TACCAGCCCC
[0040]301 AAAGCCCATG CTCCCGTTCG CCCAGGCGAT CTAATCCACA TTCAATGGAA CGGTTGGCCT
[0041]361 GTGGGGCACG TCGGTCCTAT CCTGACATAC ATCGCTCCCT GCAAAAGCCA GTCCGGGTGT
[0042]421 GCAGGTGTGG ATAAGACGAC CCTGAGATGG ACAAAAATTG ATGAGTCTCG TCCCGTACTA
[0043]481 GAGATTCTCC CGAACAATGA GAATCGCTGG GATGTGGAAC ACGGCCGGGC TGGCATAGTA
[0044]541 GGAAAGAGGT GGGCCACAGA TGTGATGGTT GCTGCCAACA ACAGCTGGCA GGTAGAGGTG
[0045]601 CCAAGGGGTT TGGCGCGCGG GGCGTATGTG ATGAGACATG AGATTATTGC ATTGCATTTT
[0046]661 GCGGCGAAGA GGGGAGGGGC GCAAAATTAC CCTGTGTGCT TTAATCTGTG GATTGAGGGA
[0047]721 GAGAAAGAGG GGAGCGTGAC GCTAGATGGG TATGATGCTA GGGAGTTTTA TCGGGATGAT
[0048]781 CATATTGGCG TGTGGGTAAA TGTCACAGCT CCAGCGCTGG CGAGTTACAT CATTCCGGGG
[0049]841 CCAACGATAG CCAGCTGGGC TATGCCAGTC CCGTATGCGC AGCAGACCTC GATGTTACTG
[0050]901 AGATCAGAGG GAACTCCCGT TGTTGTGACG AGGAGTACAG AGACCGTACT GTGGACTGCA
[0051]961 GAGGTGACAC CTACACCTAC CGGCCAAGCT GTTCGACACA GGTATCATCT TAGGGGTTAA
[0052](B) SEQ ID N02 的信息
[0053](a)序列特征:*長度:313氨基酸；*類型:氨基酸；*鏈型:單鏈；*拓撲結(jié)構(gòu):線性
[0054](b)分子類型:蛋白質(zhì)
[0055](C)序列描述:
[0056]I HSHLSHIVVN GALYHGYDPR SPVKNPDSNK TYNNPRPNHP GSVAffSYAAF DDGFVAPENY
[0057]61 SHPDIICHIG ATSPKAHAPV RP⑶LIHIQW NGffPVGHVGP ILTYIAPCKS QSGCAGVDKT
[0058]121 TLRffTKIDES RPVLEILPNN ENRffDVEHGR AGIVGKRffAT DVMVAANNSff QVEVPRGLAR
[0059]181 GAYVMRHEII ALHFAAKRGG AQNYPVCFNL WIEGEKEGSV TLDGYDAREF YRDDHIGVffV
[0060]241 NVTAPALASY IIPGPTIASff AMPVPYAQQT SMLLRSEGTP VVVTRSTETV LffTAEVTPTP
[0061]301 TGQAVRHRYH LRG
[0062]實施方式3:表達載體的構(gòu)建
[0063](I)根據(jù)分離出的CtAA9c基因的核苷酸序列設(shè)計表達引物，在引物的5’端分別引入Ecor I和Not I酶切位點，下游引物引入6個組氨酸序列，作為純化標簽:上游引物:5’ -CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACCA CTCTCATCTC TCC-3 (Ecor I);下游引物:5’ -TTGCGGCCGCTTAACCCCTA AGAT-3’ (Not I )(組氨酸序列)[0064](2)嗜熱毛殼菌總RNA的提取:利用Trizol試劑提取。
[0065](3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈:取2yg總RNA，加入5X反應(yīng)緩沖液4 μ L，IOmMdNTP2y L，核糖核酸酶抑制劑(40 — 200u/yL)0.5yL，引物 oligodT (I μ g/μ L) I μ L，反轉(zhuǎn)錄酶(IOu/ μ L) 2 μ L，42°C反應(yīng)60min，然后85°C IOmin終止反應(yīng)，稀釋至200 μ L。
[0066](4)PCR 反應(yīng)(25μ L):cDNA2y L, 10XBuffer2.5 μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L, 25mmol/LMgCl22y L，上、下游引物各 2μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L)，ddH2012 μ L。反應(yīng)條件為 94°C 5min 預(yù)變性；94°C 40s，54°C 40s, 72°C lmin,共 32 個循環(huán)，72°C延伸 10min，4°C保存。
[0067](5)基因克隆:取2yL PCR產(chǎn)物與pMD18 — T載體進行連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18T/CtAA9c操作步驟按TAKARA公司產(chǎn)品說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在涂有AMP的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[0068](6 )質(zhì)粒DNA提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。
[0069](7)用Ecor I和Not I對重組質(zhì)粒pMD18_T/CtAA9c產(chǎn)物進行雙酶切，同時用EcorI和Not I雙酶切酵母表達質(zhì)粒pPIC9K，DNA膠回收試劑盒回收純化9a基因及載體pPIC9K片斷。然后進行體外連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K/CtAA9c，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含Amp的LB轉(zhuǎn)化平板上挑選單菌落，提取質(zhì)粒DNA，進行PCR和酶切鑒定，測序確認重組質(zhì)粒的讀碼框正確。
[0070]實施例4.表達糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌株的構(gòu)建及篩選
[0071](I)重組表達質(zhì)粒的線性化:將重組表達質(zhì)粒pPIC9K/CtAA9c用限制性內(nèi)切酶Sac I線性化。
[0072](2)轉(zhuǎn)化:電擊轉(zhuǎn)化酵母菌株P(guān)ichia pastoris GS115酵母感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化方法參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。
[0073](3)篩選:用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對應(yīng)點種在麗和MD平板上，30°C培養(yǎng)2 — 4d,挑取在MD/MM平板上均生長良好的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子分別點種于250 μ g/mL,300 μ g/mL,400 μ g/mL,500 μ g/mL,600 μ g/mLG418 的 YPD 平板上篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
[0074]實施方式5:畢赤酵母Pichia pastoris GS115的誘導(dǎo)表達和活性檢測
[0075](I)將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含25mL BMGY培養(yǎng)基中，30 °C 250rpm/min搖床培養(yǎng)24h(OD600達2 — 6)，離心收集菌體，將細胞重懸于適當(dāng)體積的BMMY培養(yǎng)基中，至0D_值為1.0，300C 250rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24h補充甲醇至終濃度為0.5%，每24h取樣，室溫10，OOOg離心5min，取上清進行SDS-PAGE分析。
[0076](2)酶活性檢測:酶活性測定采用DNS法，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為100 μ L的酶液，加入200 μ L的0.5%微晶纖維素，100 μ L的醋酸緩沖液(0.4mol/L、pH5.0)60°C反應(yīng)30min，加入400 μ L DNS試劑，煮沸l(wèi)Omin，在540nm波長下測定光吸收值。對照組用失活的酶液做對照。以失活酶液的活性定義為100%，測定糖苷水解酶CtAA9C的相對酶活性。重復(fù)三次，取平均值。蛋白含量測定采用Bradford法。
[0077](3)重組糖苷水解酶CtAA9C的最適反應(yīng)溫度、pH及熱穩(wěn)定性:誘導(dǎo)表達的重組糖苷水解酶經(jīng)過GE公司的HisTrap FF crude金屬配體親和層析柱純化帶有組氨酸標記的重組蛋白質(zhì)，獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組糖苷水解酶測定其性質(zhì)。在不同溫度和PH條件下分別測定重組糖苷水解酶的對纖維素的酶活力，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下糖苷水解酶的相對酶活性；將重組糖苷水解酶在不同的溫度下保溫30min，檢測剩余酶活力。重復(fù)三次，取平均值。
[0078]實施方式6:9家族糖苷水解酶對內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進作用及不同金屬離子對其活性的影響
[0079](I)糖苷水解酶對內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進作用
[0080]采用DNS法，分別測定CtAA9C、N24及混合酶在N24最適反應(yīng)條件下的內(nèi)切纖維素酶活性，混合酶為CtAA9C和N24等體積混合，反應(yīng)體系為:CtAA9C50 μ L，N2450 μ L，200 μ L的 0.5%CMC-Na, 100 μ L 的醋酸緩沖液(0.4mol/L、pH5.0)50°C反應(yīng) 30min，加入 400 μ L DNS試劑，煮沸l(wèi)Omin，在540nm波長下測定光吸收值。以不加糖苷水解酶CtAA9C的反應(yīng)體系中的酶活性定義為100%，分別計算糖苷水解酶CtAA9C、內(nèi)切纖維素酶N24以及混合酶的相對酶活性。重復(fù)三次，取平均值。
[0081](2)金屬離子Mn2+對糖苷水解酶CtAA9C纖維素酶活性的影響
[0082]在反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子，使其終濃度為lmmol/L，在糖苷水解酶CtAA9C最適反應(yīng)條件下測定其內(nèi)切纖維素酶活性，不加金屬離子反應(yīng)體系中的酶活性定義為100%，計算不同金屬離子條件下糖苷水解酶CtAA9C的相對酶活性。重復(fù)三次，取平均值。
[0083](3)金屬離子Mn2+對混合酶活性的影響
[0084]在反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子，使其終濃度為lmmol/L，在內(nèi)切纖維素酶N24最適反應(yīng)條件下測定混合酶的內(nèi)切纖維素酶活性，不加金屬離子反應(yīng)體系中的酶活性定義為100%，計算不同金屬離子條 件下混合酶的相對酶活性。重復(fù)三次，取平均值。
[0085]實施方式7:表達CtAA9c基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT9C的保藏
[0086]表達CtAA9c基因的畢赤酵母工程菌株GS_CT_9C的保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期:2013年7月19日；酵母工程菌株編號為=CGMCC N0.7944 ;畢赤酵母工程菌株的分類命名為:巴氏畢赤酵母Pichia pastoris。
【權(quán)利要求】
1.一種表達嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR方法從嗜熱毛殼菌Chaetomiumthermophilum獲得熱穩(wěn)定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c,將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體PPIC9K，獲得表達重組質(zhì)粒pPIC9K/CtAA9c，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，從中篩選出表達熱穩(wěn)定糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9C，該糖苷水解酶CtAA9C對內(nèi)切纖維素酶的活性具有`明顯的促進作用。
【文檔編號】C12N1/19GK103509727SQ201310423137
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】李多川, 韓超 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)