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      一個(gè)人類snx家族新基因snx21的制作方法

      文檔序號(hào):3548690閱讀:343來源:國知局
      專利名稱:一個(gè)人類snx家族新基因snx21的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及人類基因,具體是Sorting Nexin(SNX)家族的人類新基因SNX21的cDNA全長克隆及它在人體心臟胚胎發(fā)育過程中和成年時(shí)期的詳細(xì)表達(dá)。
      包含PX同源域的基因在人類中目前發(fā)現(xiàn)了超過50個(gè),其中SNX家族的成員已達(dá)29個(gè),根據(jù)PX域在蛋白質(zhì)中的位置不同,可以將所有成員分成幾個(gè)類群,目前的研究主要集中在第一與第二類群。過去的研究證明,SNX家族的主要功能是蛋白質(zhì)的分選,而目前這些被分選的蛋白質(zhì)又主要是一些受體蛋白。SNX1在表皮生長因子受體和凝血酶(thrombin)因子的受體的分選中具有重要作用,而SNX2,4,6則分別被發(fā)現(xiàn)與酪氨酸激酶受體、凝血酶受體、血小板起源的生長因子以及胰島素的受體在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸有關(guān),而另一個(gè)基因SNX9則被發(fā)現(xiàn)參與了一個(gè)大復(fù)合物的構(gòu)成,該復(fù)合物與AP-2這個(gè)基因發(fā)揮功能有關(guān)。而SNX15的過多表達(dá)卻反而可以抑制蛋白質(zhì)從質(zhì)膜到內(nèi)涵體的正常運(yùn)輸。
      本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)人類SNX家族新基因SNX21,分析它在人體肝臟胚胎發(fā)育過程中和成年時(shí)期的表達(dá),以探索其對(duì)肝細(xì)胞病變和腫瘤形成的關(guān)系,進(jìn)而研制開發(fā)肝臟疾病的基因治療藥物。
      在最新的研究中,我們分別鑒定了在人類前列腺中特異性表達(dá)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程中特異性表達(dá)的G蛋白耦聯(lián)的受體(Liu et al.,2000)。為了研究G蛋白耦聯(lián)受體的降解和跨膜運(yùn)輸機(jī)制,我們用PX同源框的保守序列搜索NCBI數(shù)據(jù)庫,得到一個(gè)新EST-AL521242。進(jìn)一步的搜索找到了一些與EST-AL521242的3’端同源度為100%的EST。其中最長的一個(gè)EST-AL521241不屬于任何已知基因,含有一個(gè)與EST-AL521242相同的250bp的片斷。為了確定這兩個(gè)EST是否屬于同一個(gè)新基因,利用從胚胎肝臟中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及分別位于AL521242和AL521241上一對(duì)引物(F1,R1,見后表)進(jìn)行PCR。在96℃-1min,1個(gè)循環(huán);58℃-1min,72℃-1min,30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)條件下得到了一個(gè)420bp的產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果顯示這一產(chǎn)物包括了這兩個(gè)EST 250bp的重疊序列,所以可以確定這兩個(gè)EST屬于同一個(gè)基因。5’-和3’-端的RACE分別得到了一個(gè)590bp和834bp的片斷。RACE得到的片斷和計(jì)算機(jī)檢索的結(jié)果拼接得到了新基因的1814bp的全長cDNA。這一序列已被提交到Genebank(Accession No.AF523834).新基因被命名為sorting nexin 21,并得到HUGO命名委員會(huì)的確認(rèn)。
      SNX21位于20q 12-13.1區(qū),整個(gè)基因長度大約為8kb,有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。SNX21的cDNA全長為1814bp,包括一段96bp的5’端未翻譯區(qū)域和一段621bp的3’端未翻譯區(qū)域。開放閱讀框?yàn)?092bp,編碼的蛋白質(zhì)為364個(gè)氨基酸,分子量約為40.3kDa。該蛋白質(zhì)包括一個(gè)109個(gè)氨基酸的PX同源框和一個(gè)33個(gè)氨基酸的不完整tetratricopeptide repeat(TPR)區(qū)域。SNX21是一個(gè)親水性蛋白。親水性分析顯示其PX同源框的N-部分基本上全部由親水區(qū)構(gòu)成,該同源框的C-端則是一個(gè)超螺旋結(jié)構(gòu)域。
      SNX1就包含一個(gè)位于N-部分的PX同源框和位于C-端3個(gè)超螺旋結(jié)構(gòu)。據(jù)推測(cè),這兩個(gè)區(qū)域的作用與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位及SNX家族成員之間的相互作用有關(guān)。其它一些SNX家族成員也含有超螺旋結(jié)構(gòu)域,如SNX2和SNX4,及其它各種功能域,如SNX13/RGS-PX1中的RGS同源框,SNX9中的SH3同源框。
      SNX21的PX同源框與保守的PX同源框區(qū)域的同源度為40%(見圖1)。在已被研究過的SNX家族成員中,它與SNX15的結(jié)構(gòu)較為相似。后者也有位于N-端的PX同源框和位于C-端的超螺旋結(jié)構(gòu)域。除了PX同源框,SNX21和SNX15都有位于C-端的TPR同源框(Barr et al.,2000)。TPR同源框存在于大量蛋白質(zhì)中,其功能很可能與蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān)。據(jù)推測(cè),TPR蛋白質(zhì)傾向于與WD-40蛋白或含有TPR同源框的蛋白質(zhì)相互作用,形成多蛋白復(fù)合物。
      SNX21的表達(dá)分析顯示其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在成年人的肝臟,胰臟和骨骼肌中有高水平的表達(dá)(見圖2)。而在胚胎時(shí)期,SNX21僅僅在肝臟中有高水平的特異性表達(dá)(見圖3)。該基因在成年人肝臟組織中表達(dá)水平的雖然下降,但表達(dá)的絕對(duì)量仍然不少,顯示了SNX21在肝臟發(fā)育和再生過程中潛在的重要作用。
      本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.提供了一個(gè)人類新基因SNX21基因的全長cDNA序列,并描述了其編碼的蛋白產(chǎn)物與重要結(jié)構(gòu)域的同源性,證明了該基因是SNX家族的成員之一。
      2.該基因編碼的蛋白產(chǎn)物為親水性蛋白,并且在人類成體組織大量限制在肝臟表達(dá),有可能成為肝臟疾病治療的基因工程產(chǎn)物。
      3.該基因在胚胎發(fā)育期可檢測(cè)到強(qiáng)表達(dá)水平,說明該基因作為轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)育早期起著很重要的作用,可能參與胚胎肝臟的形成。
      本發(fā)明通過以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述,但并不限制本發(fā)明的范圍。


      圖1.SNX21的氨基酸與PX同源域、幾個(gè)模式動(dòng)物的同源基因比較。
      圖中黑色陰影表示氨基酸同源部分。圖中的序列號(hào)為該同源蛋白在GeneBank內(nèi)的Accession號(hào)碼。PX(SNX21,人),NP_608709(果蠅),NP_082116(小鼠),和NM_037438(SNX15,人)圖2.SNX21在成人組織的Northern雜交圖中1胰腺2腎3骨骼肌4肝5肺6胎盤7腦8心臟圖3.SNX21在人類胚胎組織的Northern雜交
      3A-12周胚胎,3B-17周胚胎,3C-18周胚胎,3D-20周胚胎,3E-23周胚胎,3F-25周胚胎圖中1脾2胃3骨骼肌4腎5小腦6大腦7舌8肺9心臟10腎上腺11小腸12肝
      具體實(shí)施例方式一個(gè)人類SNX家族新基因SNX21的克隆、測(cè)序及其表達(dá)。
      1SNX21全長cDNA的克隆和測(cè)序以檢索獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)RACE引物、其它引物及反應(yīng)條件(見下表)Primer Sequence ProgramsCyclesF1 5’-CGCCGTTACTCGGACTTT 96℃-1min 1R1 5’-AGGGCCTTCTCACAGCAT 58℃-1min;72℃-Lnin30GSP 5’-GACTGCCCCACTGCCCA50℃-30min;94℃-2min 1F2 5’-GACGACGAGGACGAGGACGAC94℃-1min 1R2 5’-GCTCTGAGCTCTCC 56℃-1min;72℃-1min30F3 5’-TCGGGGATGGGACGTCA94℃-1min 1R3 5’-GGAAACTGCTCGGCCTCTG 58℃-1min;72℃-1min30F4 5’-CGCCCCTGAATGCACCGT 94℃-1min 1R4 5’-CCTTAAATCTAGGCAAGGGTTCGTC60℃-1min;72-2min 30F1,R1用于檢測(cè)EST AL521242和AL521241是否屬于同一基因。
      GSP用于肝mRNA的反轉(zhuǎn)錄F2,R2,F(xiàn)3,R3用于反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多重PCR擴(kuò)增。
      F4,R4用于SNX21的開放閱讀框的擴(kuò)增。
      本實(shí)驗(yàn)中取肝臟組織mRNA 5ug為模板。具體操作按該公司(takara)protocol進(jìn)行。
      將RACE產(chǎn)物克隆入T載體并測(cè)序獲得SNX21的5`端和3`端序列,將RACE得到的片斷和計(jì)算機(jī)檢索的結(jié)果拼接得到了新基因的全長cDNA。2Northern雜交(1).組織總RNA的提取(按王雁云,羅開梅等,一種快速的總RNA提取方法,生命科學(xué)研究,5(1)88-90(2001)進(jìn)行)。(2).總RNA的電泳及轉(zhuǎn)膜,均按《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》介紹的方法進(jìn)行(盧圣棟主編,第二版)。(3).Northem雜交將從CLONTECH公司買的成人組織mRNA膜和轉(zhuǎn)有20ug人體胚胎多種組織以及總胚胎組織的總RNA的尼龍膜,放入培養(yǎng)皿中,加入經(jīng)變性的68℃預(yù)熱的快速雜交液(Clontech公司)10ml,68℃預(yù)雜交30分鐘,加入經(jīng)變性處理的同位素標(biāo)記的SNX21的cDNA片段,68℃雜交過夜。用2XSSC,0.05%SDS,65℃洗兩次,15分鐘/次;0.1XSSC,0.1%SDS,65℃洗兩次,15分鐘/次。(4).-80℃曝光幾天,洗X光片。(5).用0.1×SSC和0.5%SDS在95℃洗10分鐘膜用β-actin cDNA重新標(biāo)記,做Northem雜交進(jìn)行陽性對(duì)照。
      SNX21的cDNA核苷酸序列和編碼氨基酸序列g(shù)aacccggcc gacctccatg ggctgcgggg ggctgcaccc ggacccctgg ggcgcggcgc 60gcccctgaat gcaccgtggg acgcaggagg gtgcc95atg gcc tcc cgg ctc ctg cac cgg ctg cgg cac gcc ttg gcc ggc 140Met Ala Ser Arg Leu Leu His Arg Leu Arg His Ala Leu Ala Gly1 5 10 15gac ggc ccc ggg gag gcg gcg gcc agt cca gag gcc gag cag ttt 185Asp Gly Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ser Pro Glu Ala Glu Gln Phe20 25 30ccg gag agc tca gag ctg gag gac gac gac gcc gag ggc ctg tcc 230Pro Glu Ser Ser Glu Leu Glu Asp Asp Asp Ala Glu Gly Leu Ser35 40 45tcc cga ctc agc ggc acc ctc agc ttc acc agc gcc gag gac gac 275Ser Arg Leu Ser Gly Thr Leu Ser Phe Thr Ser Ala Glu Asp Asp50 55 60gag gac gac gag gac gag gac gac gag gag gct ggc cct gac cag 320Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Ala Gly Pro Asp Gln65 70 75ctg ccc ctc ggg gat ggg acg tca gga gaa gac gca gaa cgg agc 365Leu Pro Leu Gly Asp Gly Thr Ser Gly Glu Asp Ala Glu Arg Ser80 85 90ccc cca cct gat ggg cag tgg ggc agt cag ctc ctg gcg cgg cag 410Pro Pro Pro 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      1.一個(gè)人類SNX家族新基因SNX21,其特征在于該基因的全長cDNA核苷酸序列和編碼氨基酸序列如下gaacccggcc gacctccatg ggctgcgggg ggctgcaccc ggacccctgg ggcgcggcgc 60gcccctgaat gcaccgtggg acgcaggagg gtgcc95atg gcc tcc cgg ctc ctg cac cgg ctg cgg cac gcc ttg gcc ggc 140Met Ala Ser Arg Leu Leu His Arg Leu Arg His Ala Leu Ala Gly1 5 10 15gac ggc ccc ggg gag gcg gcg gcc agt cca gag gcc gag cag ttt 185Asp Gly Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ser Pro Glu Ala Glu Gln Phe20 25 30ccg gag agc tca gag ctg gag gac gac gac gcc gag ggc ctg tcc 230Pro Glu Ser Ser Glu Leu Glu Asp Asp Asp Ala Glu Gly Leu Ser35 40 45tcc cga ctc agc ggc acc ctc agc ttc acc agc gcc gag gac gac 275Ser Arg Leu Ser Gly Thr Leu Ser Phe Thr Ser Ala Glu Asp Asp50 55 60gag gac gac gag gac gag gac gac gag gag gct ggc cct gac cag 320Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Ala Gly Pro Asp Gln65 70 75ctg ccc ctc ggg gat ggg acg tca gga gaa gac gca gaa cgg agc 365Leu Pro Leu Gly Asp Gly Thr Ser Gly Glu Asp Ala Glu Arg Ser80 85 90ccc cca cct gat ggg cag tgg ggc agt cag ctc ctg gcg cgg cag 410Pro Pro Pro Asp Gly Gln Trp Gly Ser Gln Leu Leu Ala Arg Gln95 100 105ctg cag gat ttc tgg aag aag tcc cgg aac acc ttg gca ccc cag 455Leu Gln Asp Phe Trp Lys Lys Ser Arg Asn Thr Leu Ala Pro Gln110 115 120cgg ctg ctc ttc gaa gtg acc agc gct aac gtt gtc aag gac ccg 500Arg Leu Leu Phe Glu Val Thr Ser Ala Asn Val Val Lys Asp Pro125 130 135ccc tcc aag tac gtg ctc tac acc ctc gcc gtg atc ggc cca gga 545Pro Ser Lys Tyr Val Leu Tyr Thr Leu Ala Val Ile Gly Pro Gly140 145 150ccg cca gat tgc cag cca gcc cag atc tct cgc cgt tac tcg gac 590Pro Pro Asp Cys Gln Pro Ala Gln Ile Ser Arg Arg Tyr Ser Asp155 160 165ttt gag cgg ctg cac cga aac ctg cag cgg caa ttc cgg ggc cca 635Phe Glu Arg Leu His Arg Asn Leu Gln Arg Gln Phe Arg Gly Pro170 175 180atg gct gcc atc tcc ttc ccc cgt aag cgg ctg cgc cgg aat ttt 680Met Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg Lys Arg Leu Arg Arg Asn Phe185 190 195act gca gag acc att gcc cgc cgt agc cgg gcc ttt gag cag ttt 725Thr Ala Glu Thr Ile Ala Arg Arg Ser Arg Ala Phe Glu Gln Phe200 205 210ttg ggt cac ctg cag gca gtg cct gag ctg cgc cat gcc ccg gac 770Leu Gly His Leu Gln Ala Val Pro Glu Leu Arg His Ala Pro Asp215 220 225ctg cag gac ttc ttc gtg ctg ccg gag ctg cgg cgg gca cag agc 815Leu Gln Asp Phe Phe Val Leu Pro Glu Leu Arg Arg Ala Gln Ser230 235 240ctc acc tgt act ggc ctc tat cgt gag gct ctg gca ctc tgg gcc 860Leu Thr Cys Thr Gly Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Ala Leu Trp Ala245 250 255aat gcc tgg cag ctg caa gcc cag ctg ggc acc ccc tct ggc cca 905Asn Ala Trp Gln Leu Gln Ala Gln Leu Gly Thr Pro Ser Gly Pro260 265 270gac cgc ccc ctg ctg acc ctg gct ggg ctg gcc gtg tgc cac cag 950Asp Arg Pro Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ala Val Cys His Gln275 280 285gag ctg gaa gac cct gga gag gcc cgg gca tgc tgt gag aag gcc 995Glu Leu Glu Asp Pro Gly Glu Ala Arg Ala Cys Cys Glu Lys Ala290 295 300ctg cag ctg ctt ggg gac aag agc ctc cac cct ttg ctg gca ccc 1040Leu Gln Leu Leu Gly Asp Lys Ser Leu His Pro Leu Leu Ala Pro305 310 315ttt ctg gag gcc cat gtc cgg ctc tcc tgg cgc ctg ggc ctg gac 1085Phe Leu Glu Ala His Val Arg Leu Ser Trp Arg Leu Gly Leu Asp320 325 330aaa cgt caa tca gag gct cgg ctc caa gcc ctg cag gag gca ggc 1130Lys Arg Gln Ser Glu Ala Arg Leu Gln Ala Leu Gln Glu Ala Gly335 340 345ctt acc ccc aca cca ccc ccc agt ctc aaa gaa ttg ctc atc aag 1175Leu Thr Pro Thr Pro Pro Pro Ser Leu Lys Glu Leu Leu Ile Lys350 355 360gag gtg ctg gac taa cccttgccta 1200Glu Val Leu Asp Endgatttaaggc cactgtgagg agaggggttg ccccagaagg caggggaagg acctgatgag 1270aacagaatag ctgggaggct gcagagggtg ctgggagccc ctagaagttc caaaagagaa 1330tgtgaagcag atcaaggaaa cttctgttga gctaggctca gggtgagctt tggctggggt 1390tgcccttgtg tagtacaggg aagtctgaca cagcctctcc agcctataaa cagccggggg 1450gctgtggcac aggttggggc aatgttccct tgttggtggg cccccaagct ggcaaggcct 1510cttggctgaa ggccagggac tctgcccctg gagtcctgga gttaagggat gaaggcaagg 1570ctgcaggtct ggcccagggg aattaaaagc cagccactcc cagtggtatc agtctctcta 1630gttggatgtg agggccaaaa cgggactgta actcctgtct caggaatggg gatagatggg 1690aggttcttga agccccaggc gaagctggta cctctgctac agcttgctct ctggacctgg 1750cttcactcga tcacccctcc tggcacagtc acagctagac tccatcctac ccacagccct 1810gtagatcctg taga 181全文摘要
      一個(gè)人類SNX家族新基因SNX21,涉及一種人類基因。它的cDNA全長1814bp,位于染色體20q12-13.1區(qū),整個(gè)基因長度大約8Kb,編碼蛋白質(zhì)為364個(gè)氨基酸,分子量約為40.3KDa,SNX21在成人和胚胎時(shí)期的肝臟中有高水平的表達(dá),可能參與胚胎肝臟的形成,并有望成為肝臟疾病治療的基因藥物。
      文檔編號(hào)C07K14/435GK1425677SQ02139750
      公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2002年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
      發(fā)明者吳秀山, 朱傳炳, 曾偉奇, 李永青, 王躍群, 袁婺洲, 劉明耀 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)
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