抗豬圓環(huán)病毒和豬傳染性胸膜肺炎感染疫苗組合物及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗豬圓環(huán)病毒2型及豬傳染性胸膜肺炎感染的二聯(lián)疫苗組合物及制備方法。該二聯(lián)疫苗組合物含有豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌抗原，免疫程序簡(jiǎn)單，能同時(shí)有效的防治豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疾病和豬傳染性胸膜肺炎。與單苗相比，該二聯(lián)疫苗組合物并沒有產(chǎn)生免疫干擾現(xiàn)象，疫苗免疫效果沒有下降，而且豬胸膜肺炎放線桿菌可以增強(qiáng)豬圓環(huán)病毒2型抗原的免疫效果。該二聯(lián)疫苗組合物的制備工藝簡(jiǎn)單，免疫成本低廉，實(shí)用性強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】抗豬圓環(huán)病毒和豬傳染性胸膜肺炎感染疫苗組合物及制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于畜牧類生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的二聯(lián)疫苗組合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一種呼吸系統(tǒng)重要傳染病。本病主要引起豬的一種伴有胸膜炎的纖維素性、出血性、壞死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速死亡，發(fā)病率和死亡率均在50%以上，它可發(fā)生于任何年齡的豬只，尤其是在集約化養(yǎng)豬場(chǎng)，一旦發(fā)生會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]臨床上一般分為最急性、急性、亞急性和慢性。最急性型多發(fā)生在斷奶仔豬群中，一頭或幾頭豬突然發(fā)病，病豬體溫高達(dá)41.5°C，精神沉郁，食欲不振，有短暫的腹瀉或嘔吐，剖檢后病理變化主要存在于呼吸系統(tǒng)，最急性或急性迅速死亡的豬只氣管和支氣管內(nèi)充滿泡沫狀血樣粘性滲出物、肺充血、水腫，肺炎病灶變暗，變硬，質(zhì)地脆弱，纖維素性胸膜炎區(qū)呈現(xiàn)暗紅色或發(fā)黑。
[0004]豬胸膜肺炎放線桿菌最早被稱為副溶血嗜血桿菌(H.parahaemoIyties),該病原菌生長(zhǎng)要求嚴(yán)格，為革蘭氏陰性球桿菌，有莢膜。該病原菌血清型眾多，根據(jù)輔酶I(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD)依賴性，可以分為生物I型和生物II型,其中依賴NAD的豬胸膜肺炎放線桿菌劃為生物I型(Biovar I),不依賴NAD的豬胸膜肺炎放線桿菌劃為生物II型(Biovar II)，采用傳統(tǒng)血清型方法，又可細(xì)分為15個(gè)血清型。其中生物I型包括血清廣12型和15型，生物II型包括血清13型和14型。
[0005]目前該病的預(yù)防主要是對(duì)流行區(qū)域進(jìn)行病原菌的分離鑒定，確定流行的優(yōu)勢(shì)血清型，研制具有特異性保護(hù)作用的滅活疫苗，并制訂相應(yīng)的防治對(duì)策，是許多國(guó)家所采用的方法。但是該病原血清型眾多，給該病的`預(yù)防與控制帶來(lái)了困難，因此，血清型的劃分及其所采用的方法顯得非常重要。
[0006]豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)不僅可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS),而且還與豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, FONS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease syndrome, PRDC)、豬先天性振顫、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎等疾病密切相關(guān)。自從20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)可致病豬以來(lái)，PCV2病毒在世界各國(guó)迅速蔓延。目前PCV2在豬群中感染率非常高，造成豬的生長(zhǎng)緩慢，飼料報(bào)酬下降，同時(shí)侵害豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致豬的免疫機(jī)能下降，造成其它疾病的大爆發(fā)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)在2000年檢測(cè)到了該病毒的存在，該病毒在我國(guó)豬群的感染率近乎50%，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)也造成了嚴(yán)重的打擊。
[0007]PCV2為單股環(huán)狀的DNA病毒，無(wú)囊膜，20面體對(duì)稱，基因組全長(zhǎng)1767bp或1768bp，整個(gè)基因組包括11個(gè)開放閱讀框(Open reading frame, 0RF)，其中ORFl和0RF2為兩個(gè)主要閱讀框。ORFl與同屬的豬圓環(huán)病毒I型(PCVl)高度同源，編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的酶類。而0RF2在PCVl和PCV2之間差異相對(duì)較大，編碼分子量約為30kDa的主要結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白)(Capsid protein，CP)能夠與PCV2感染的豬血清特異性結(jié)合，并且具有中和活性。
[0008]目前對(duì)于該病毒的防制主要是依靠疫苗，國(guó)外只有梅里亞動(dòng)物保健公司(Merial)生產(chǎn)全病毒滅活苗，但只適用于母豬免疫；國(guó)內(nèi)均為全病毒滅活苗，且應(yīng)用的佐劑均含有一定量的礦物油；PCV2亞單位疫苗目前有兩家公司生產(chǎn)，勃林格殷格翰動(dòng)物保健有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.，美國(guó))的 FLEX 系列茵格發(fā)(Ingelvac)豬圓環(huán)病毒疫苗和英特威/先靈德雅動(dòng)物保健公司(intervet/schering-plough)的PCV2疫苗；富道動(dòng)物保健公司(Fort Dodge)研制的PCV2疫苗屬于嵌合病毒滅活苗。
[0009]專利CN 102058880A披露了一種豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。該方法以胸膜肺炎放線桿菌I型HT株菌、5型SZ株菌和7型DY株菌為疫苗制備菌株，經(jīng)培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)物，再經(jīng)滅活，加入礦物油佐劑混合乳化制成豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗。該方法所采用的APP1、5、7型抗原毒力較弱，免疫原性不夠強(qiáng)，并且，制備的疫苗為油佐劑疫苗，會(huì)對(duì)免疫豬只造成一定程度的應(yīng)激，采用該方法制得的疫苗免疫成本較高。
[0010]專利CN 101549155A公開了一種豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)滅活疫苗及其制備方法。該疫苗是以豬圓環(huán)病毒II型DBN-SX07株為毒種，經(jīng)烷化劑滅活后作為抗原，再加入油佐劑乳化配制而成。該方法采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)種毒，使抗原效價(jià)很難突破IO5 5TCID5tl/ml，使生產(chǎn)成本提升。其所制備的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗使用油佐劑，會(huì)對(duì)免疫豬只造成一定程度的應(yīng)激。所制得的疫苗用于商品豬需要免疫2次，影響免疫效果及相關(guān)免疫成本。
[0011]專利CN 102174086A公開了一種豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白和亞單位疫苗。該重組豬圓環(huán)病毒Cap蛋白為大腸桿菌表達(dá)，該蛋白系截除N端富含精氨酸的核定位信號(hào)區(qū)域，該蛋白克隆入原核表達(dá)載體得到重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)獲得。該疫苗利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，所得到的蛋白多為包涵體形式存在，不具備天然蛋白的活性，其免疫原性也會(huì)大打折扣。該疫苗的抗原蛋白純化是減少疫苗副反應(yīng)的重要一環(huán)，同時(shí)也是提高疫苗成本的因素，此方式難以大規(guī)模推廣和應(yīng)用。該疫苗配制采用弗氏完全佐劑或不完全佐劑，會(huì)影響疫苗吸收，對(duì)疫苗效果產(chǎn)生副反應(yīng)。
[0012]上述疫苗均為只能防治一種疾病的疫苗，聯(lián)苗是未來(lái)疫苗發(fā)展和應(yīng)用的趨勢(shì)，應(yīng)用新技術(shù)、新材料研制出可與其它疫苗聯(lián)合應(yīng)用的豬圓環(huán)病毒疫苗，同時(shí)預(yù)防兩種或多種疾病，這樣既能降低動(dòng)物應(yīng)激，提高動(dòng)物福利，又能減少員工免疫的工作量，降低免疫相關(guān)成本。
[0013]因此，目前存在的問題是需要研究開發(fā)一種免疫成本低廉，采用畜類易于接受的佐劑，可以同時(shí)預(yù)防豬傳染性胸膜肺炎、豬圓環(huán)病毒2型兩種傳染病，并能避免多次接種造成免疫應(yīng)激反應(yīng)及免疫效果降低的疫苗及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)及豬傳染性胸膜肺炎感染的二聯(lián)疫苗組合物及制備方法。該二聯(lián)疫苗組合物含有豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌抗原，免疫程序簡(jiǎn)單，能同時(shí)有效的防治豬圓環(huán)病毒2型病和豬傳染性胸膜肺炎。與單苗相比，該二聯(lián)疫苗組合物并沒有產(chǎn)生免疫干擾現(xiàn)象，疫苗免疫效果沒有下降，而且豬胸膜肺炎放線桿菌可以增強(qiáng)豬圓環(huán)病毒2型抗原的免疫效果。該二聯(lián)疫苗組合物的制備工藝簡(jiǎn)單，免疫成本低廉，實(shí)用性強(qiáng)。
[0015]為此，本發(fā)明提供了一種抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的二聯(lián)疫苗組合物，其包含至少一種豬圓環(huán)病毒2型抗原和至少一種豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
[0016]根據(jù)本發(fā)明，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬圓環(huán)病毒2型抗原中的一種或幾種，并且，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原選自豬圓環(huán)病毒2型全病毒抗原，含有豬圓環(huán)病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它至少含有豬圓環(huán)病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成分中一種或幾種。優(yōu)選所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成分。
[0017]本發(fā)明中所述用語(yǔ)“豬圓環(huán)病毒2型全病毒抗原”是指豬圓環(huán)病毒2型病毒在其受體細(xì)胞內(nèi)寄生并以復(fù)制方式增殖后達(dá)到所需的病毒量，該病毒經(jīng)滅活、減毒等方式處理后獲得的抗原，該抗原包含病毒本身所具備的核酸和蛋白質(zhì)，只是其存在形式會(huì)有差異。
[0018]本發(fā)明中，所述二聯(lián)疫苗組合物中每劑量或每頭份(2ml)含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含量至少為IO5 5TCID5tlt5優(yōu)選所述二聯(lián)疫苗組合物中每劑量或每頭份(2ml)含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含量為4.5 X 15 0TCID50^16-0TCID50 0進(jìn)一步優(yōu)選所述二聯(lián)疫苗組合物中每劑量或每頭份(2ml)含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含量為9X 105_°TCID5Q。
[0019]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2SH株、PCV2LG株、PCV2DBN-SX07-2的抗原或疫苗和/或PCV2亞單位抗原。優(yōu)選所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2SH株(保藏編號(hào)為CGMCC N0.23890，公開于專利文獻(xiàn)CN101240264A)和/或PCV2 0RF2蛋白。
[0020]也就是說(shuō)，由于PCV2基因組大小為1767bp或1768bp,不同毒株之間核苷酸序列同源性較高，均在90%以上，因此PCV2SH株(`GenBank登錄號(hào)為AY686763)、PCV2LG株(GenBank登錄號(hào)為HM038034)、PCV2DBN-SX07-2 (GenBank登錄號(hào)為HM641752)的抗原或疫苗均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0021]本發(fā)明中，所述豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白為序列表SEQ N0.1的DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQ N0.2的氨基酸序列的蛋白或與其同源性在75%以上的氨基酸序列的蛋白。優(yōu)選所述豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白為與序列表SEQN01.DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白同源性在80%以上的氨基酸序列的蛋白。進(jìn)一步優(yōu)選所述豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白為與序列表SEQ N01.DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白同源性在90%以上的氨基酸序列的蛋白。
[0022]本發(fā)明中，所述二聯(lián)疫苗組合物中豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的含量為0.5^20 μ g/頭份。優(yōu)選所述二聯(lián)疫苗組合物中豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的含量為5~10μ g/頭份。
[0023]本發(fā)明中，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原還包含至少一種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗。所述PCV2抗原還可以選自，例如，梅里亞公司(Merial)的Circovac-PCV2 ;輝瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn_PCV2 ;哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(LG株);福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亞單位疫苗，如勃林格殷格翰公司(Boehringer-1ngelheim)的豬圓環(huán)病毒疫苗(Ingelvac CircoFLLX[0024]同樣的，根據(jù)本發(fā)明，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為豬胸膜肺炎放線桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬胸膜肺炎放線桿菌細(xì)菌，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合細(xì)菌，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成分中一種或幾種。優(yōu)選所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為滅活形式的全菌體。
[0025]本發(fā)明中所述用語(yǔ)“全菌體”，是指具有完整細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核體等基本結(jié)構(gòu)的細(xì)菌完整細(xì)胞體。而全菌體抗原則是指由上述細(xì)菌完整細(xì)胞體經(jīng)滅活或減毒的處理后獲得的抗原。
[0026]本發(fā)明中所述用語(yǔ)“豬胸膜肺炎放線桿菌”，也稱為“豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌”或“胸膜肺炎放線桿菌”(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),該病原菌生長(zhǎng)要求嚴(yán)格，為革蘭氏陰性球桿菌，有莢膜。
[0027]同樣，本發(fā)明中所述用語(yǔ)“豬胸膜肺炎放線桿菌抗原”，也稱為“豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原”或“胸膜肺炎放線桿菌抗原”。
[0028]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，其選自目前已鑒定的f 15個(gè)血清型中的一種或幾種。
[0029]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原是滅活的血清型為I型、5型和7型的混合抗原。優(yōu)選所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為滅活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌體。
[0030]所述胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株(ActinobaciIIusPIeuropneumoniaeserotypeI strain LC, APP-1)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011458 ；所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株(Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype5strainYC, APP-5)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011459 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清 7 型 YS 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7strain YS, APP-7)的保藏編號(hào)為:CCTCCN0:M 2011460 ;上述菌株均保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))。保藏日期:2011年12月9曰。
[0031]正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變異，然而，當(dāng)變異不影響其蛋白質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)或者主要作用功能區(qū)時(shí)，該微生物之他種野外分離株即使基因序列無(wú)法百分之百相同，其基本的生理功能并不會(huì)有所改變。因此，目前國(guó)際上常使用16S Ribosomal RNA (16S rRNA)來(lái)進(jìn)行細(xì)菌型的分辨，因此在相似性的比較上可以用16S rRNA來(lái)進(jìn)行比對(duì)而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本發(fā)明所使用的副豬嗜血桿菌抗原并不限定于本發(fā)明所使用的野外分離株，16s rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(zhǎng)(包含約50個(gè)功能域)。
[0032]因此，本發(fā)明中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原包括分別與所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在80%以上的菌株。優(yōu)選所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原包括分別與所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在90%以上的菌株。更為優(yōu)選的，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原包括分別與所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在95%~99%以上的菌株。也就是說(shuō)，不改變豬傳染性胸膜肺炎三株菌株(LC株、YC株和YS株)16S rRNA的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)簡(jiǎn)單的篩選或誘變本發(fā)明的豬胸膜肺炎放線菌，獲得與本發(fā)明豬胸膜肺炎放線菌16S rRNA高度同源的菌株，并獲得相應(yīng)地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。
[0033]本發(fā)明中，所述二聯(lián)疫苗組合物中豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型的含量至少為1.0X IO7CFU/頭份，優(yōu)選血清I型的含量為2.0XlOlX IO7CFU/頭份，進(jìn)一步優(yōu)選的是血清I型的含量為3.0X 1(T5X IO7CFU/頭份，更為優(yōu)選的是血清I型的含量為
4.0 X 107^5X107CFU/頭份，最為優(yōu)選的是血清I型的含量為5.0X IO7CFU/頭份。
[0034]所述二聯(lián)疫苗組合物中豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型的含量至少為1.0X IO7CFU/頭份，優(yōu)選血清5型的含量為2.0X 1(T5X IO7CFU/頭份，進(jìn)一步優(yōu)選的是血清5型的含量為3.0X IO7~5 X IO7CFU/頭份，更為優(yōu)選的是血清5型的含量為4.0 X IO7~5 X IO7CFU/頭份，最為優(yōu)選的是血清5型的含量為5.0X IO7CFU/頭份。
[0035]所述二聯(lián)疫苗組合物中豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型的含量至少為1.0X IO7CFU/頭份，優(yōu)選血清7型的含量為2.0X 1(T5X IO7CFU/頭份，進(jìn)一步優(yōu)選的是血清7型的含量為3.0 X 107~5 X IO7CFU/頭份，更為優(yōu)選的是血清7型的含量為4.0 X IO7~5 X IO7CFU/頭份，最為優(yōu)選的是血清7型的含量為5.0X IO7CFU/頭份。
[0036]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述二聯(lián)疫苗組合物還包含疫苗佐劑，所述佐劑為進(jìn)口的新型水佐劑Montanide GEL PR聚合物(包括同系列佐劑)佐劑，并且，在所述疫苗組合物中，所述疫苗佐劑含量為10Wt9T25wt%。
[0037]新型水佐劑為畜類易于接受的佐劑，采用該佐劑配制疫苗，可以提高疫苗的可吸收性，同時(shí)可以避免油佐劑所具有的應(yīng)激等副作用。
[0038]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述二聯(lián)疫苗組合物還含有疫苗總量0.01wt%的硫柳萊。
[0039]本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述二聯(lián)疫苗組合物的制備方法，包括配苗步驟:將兩種以上的抗原混合后制得抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的二聯(lián)疫苗組合物，其中，所述抗原包括豬圓環(huán)病毒2型抗原與豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
[0040]根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體的附加抗原。例如，所述其它豬的病原體的附加抗原可以選自豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、豬肺炎支原體抗原、豬鏈球菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬流行性感冒抗原、副豬嗜血桿菌抗原中的一種或幾種。
[0041]可任意選擇的，在制備根據(jù)本發(fā)明所述二聯(lián)疫苗組合物的配苗步驟中，所述抗原還包括其它豬的病原體的附加抗原。
[0042]根據(jù)本發(fā)明方法，本發(fā)明還包括在配苗步驟之前的制備豬圓環(huán)病毒2型抗原的步驟及制備豬胸膜肺炎 放線桿菌抗原的步驟。
[0043]在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述二聯(lián)疫苗組合物包含抗原和佐劑；其中抗原包含已滅活的豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬圓環(huán)病毒2型SH株抗原；所述佐劑為進(jìn)口的新型水佐劑Montanide GEL PR聚合物(包括同系列佐劑)佐劑。所述四種抗原的比例為:豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株:血清5型YC株:血清7型YS株:豬圓環(huán)病毒2型SH株=2:2:2:2 ;所述四種抗原總體積為所述疫苗總體積的75%~90%。在所述二聯(lián)疫苗組合物中，豬胸膜肺炎放線桿菌含量為滅活前豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型、血清5型、血清7型活菌數(shù)均不少于2.0X IO7CFU /頭份，豬圓環(huán)病毒2型SH株抗原含量不少于IO6 tlTCID5ci/頭份。所述二聯(lián)疫苗組合物中還含有疫苗總量0.01wt%的硫柳萊。
[0044]在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，所述抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的疫苗組合物的制備方法，包含如下步驟:
[0045](I)分別將豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬圓環(huán)病毒2型SH株菌(毒)種繁殖培養(yǎng)，得到豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液。
[0046](2)分別將步驟(1)培養(yǎng)得到的豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液中按各自總量加入0.3% (v/v)的甲醛溶液，放置37°C滅活24h，期間攪拌3飛次，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果濃縮菌液；豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液中加入0.2% (v/v)的甲醛溶液，放置37°C滅活18h，期間攪拌3飛次，根據(jù)毒力測(cè)定結(jié)果調(diào)整病毒液含量。
[0047](3)將上述已滅活、濃縮的豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液，按2:2:2:2比例混合，并加入疫苗總量0.01wt%的硫柳汞，然后和佐劑進(jìn)行乳化，佐劑含量為10Wt9T25wt% ;成品豬傳染性胸膜肺炎、豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗抗原含量為滅活前豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型、血清5型、血清7型活菌數(shù)均不少于2.0 X IO7CFU /頭份，滅活前豬圓環(huán)病毒2型SH株抗原含量不少于IO6 0TCID50/ 頭份。
[0048](4)以適量體積分裝新型豬傳染性胸膜肺炎、豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗，蓋上瓶蓋，并壓招蓋。
[0049]在上述抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的疫苗組合物的制備過(guò)程中，從步驟(1)培養(yǎng)好的豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液取樣，進(jìn)行`純粹性檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)；從步驟(2)已滅活好的豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)；對(duì)步驟(3)得到的新型豬傳染性胸膜肺炎、豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，以確保疫苗的安全性、可靠性。
[0050]本發(fā)明基于現(xiàn)有技術(shù)不足而提供一種可以同時(shí)預(yù)防由豬胸膜肺炎放線桿菌引起的豬傳染性胸膜肺炎和豬圓環(huán)病毒2型引起的豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疾病及二者的混合感染的新型豬傳染性胸膜肺炎、豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗(LC株+YC株+YS株+SH株)；臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，并可以滿足不同用戶的要求。
[0051]本發(fā)明中預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的二聯(lián)疫苗組合物中，兩種抗原成分混合后，彼此之間不僅未產(chǎn)生互相免疫干擾的現(xiàn)象，而且意外發(fā)現(xiàn)豬胸膜肺炎放線桿菌可以增強(qiáng)豬圓環(huán)病毒2型抗原的免疫效果。正如本發(fā)明實(shí)施例所證明，在豬圓環(huán)病毒2型抗原量減半的情況下仍舊可以維持豬圓環(huán)病毒2型抗原的免疫效果，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員看來(lái)是出乎意料的。
[0052]本發(fā)明還進(jìn)一步采用畜類易于接受的水佐劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的油佐劑用于配制疫苗，在避免佐劑造成的副反應(yīng)的同時(shí)，也提高了疫苗的可吸收性。[0053]本發(fā)明中抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的疫苗組合物，制備方法簡(jiǎn)單，疫苗的抗原效價(jià)高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有疫苗中的分次免疫，至少需要打2針或者3針才能防治以上2種疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經(jīng)濟(jì)可靠。通過(guò)本發(fā)明中抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的疫苗組合物與常規(guī)單苗的效力比較發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的二聯(lián)苗安全性更佳，避免了多次免疫接種出現(xiàn)的不良反應(yīng)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0054]圖1是實(shí)施例5中PCV2-0RF2目的片段大小圖；
[0055]圖1中附圖標(biāo)記的含義如下:1PCV2-0RF2目的片段；2DL2000Marker
[0056]圖2是實(shí)施例5中重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白SDS-PAGE電泳圖；
[0057]圖2中附圖標(biāo)記的含義如下:1預(yù)染低分子量蛋白質(zhì)Marker; 2pPIC9K_0RF2重組畢赤酵母24h后收獲的培養(yǎng)上清；3pPIC9K-0RF2重組畢赤酵母48h后收獲的培養(yǎng)上清；4pPIC9K-0RF2重組畢赤酵母72h后收獲的培養(yǎng)上清；5細(xì)胞陰性對(duì)照。
[0058]圖3是實(shí)施例5中重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白Western blotting (蛋白印跡)圖；
[0059]圖3中附圖標(biāo)記的含義如下:1預(yù)染低分子量蛋白質(zhì)Marker ;2pPIC9K_0RF2重組畢赤酵母24h后收獲的培養(yǎng)上清與豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清反應(yīng)結(jié)果；3pPIC9K-0RF2重組畢赤酵母48h后收獲的培養(yǎng)上清與豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清反應(yīng)結(jié)果；4pPIC9K-0RF2重組畢赤酵母72h后收獲的培養(yǎng)上清與豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清反應(yīng)結(jié)果；5細(xì)胞陰性對(duì)照與陽(yáng)性血清反應(yīng)結(jié)果。
[0060]菌種保藏
[0061]胸膜肺炎放線桿菌血清I 型 LC 株(Actinobacillus pleuropneumoniaeserotypelstrain LC, APP-1),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號(hào):CCTCC NO:M2011458。
[0062]豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype5strain YC, APP-5),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保減中心(簡(jiǎn)稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)洛咖山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號(hào):CCTCCN0:M 2011459。
[0063]豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype7strain YS, APP-7),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保減中心(簡(jiǎn)稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)洛咖山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號(hào):CCTCCN0:M 2011460。
[0064]為獲得免疫性強(qiáng)的菌種，各菌種經(jīng)敏感豬體復(fù)壯鑒定合格后凍干保存并保藏。
【具體實(shí)施方式】
[0065]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0066]實(shí)施例
[0067]實(shí)施例1:抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染疫苗組合物的制備和檢驗(yàn)
[0068]1.生產(chǎn)用菌(毒)種的制備
[0069]豬圓環(huán)病毒2型SH株的制備:將毒種用MEM培養(yǎng)基(Gibco?，Invitrogen公司)作10倍稀釋，按5%體積接種于PK15 (ATCC，保藏編號(hào)為CCL-33)細(xì)胞培養(yǎng)，37°C吸附30min，加入含4%犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，37°C培養(yǎng)4日，凍融2~3次,收獲病毒,病毒滴度為106_5TCID5(l/ml。
[0070]豬胸膜肺炎放線桿菌菌種的制備:將豬胸膜肺炎放線桿菌I型LC株、5型YC株和7型YS株劃線接種于含5% (v/v)新生牛血清的TSA/NAD平板，37°C培養(yǎng)24h，各挑選5個(gè)以上典型菌落，純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子。一級(jí)菌種挑取單個(gè)菌落，接入含5% (v/v)新生牛血清的TSB/NAD液體培養(yǎng)基中，37°C搖床180rpm振蕩培養(yǎng)16h，同時(shí)取樣革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)均勻，符合豬胸膜肺炎放線桿菌的形態(tài)特征，應(yīng)無(wú)任何雜菌生長(zhǎng)，作為二級(jí)種子。
[0071]其中:含5%(v/v)血清的TSA/NAD平板的制備方法:胰蛋白大豆瓊脂(TrypticSoyAgar, TSA, BD Difico產(chǎn)品)40克加入949ml蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，121°C高壓蒸汽滅菌15min，溫度降至60°C左右，加入50ml過(guò)濾除菌的牛血清，Iml過(guò)濾除菌的1%NAD,充分搖勻后倒平皿。
[0072]含5% (v/v)新 生牛血清的TSB/NAD液體培養(yǎng)基:胰大豆蛋白肉湯(TrypticSoyBroth, TSB, BD Difico產(chǎn)品)30克加入949ml蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，121°C高壓蒸汽滅菌15min，加入50ml過(guò)濾除菌的牛血清，Iml過(guò)濾除菌的1%NAD即成。
[0073]2.病毒液或菌液的培養(yǎng)制備
[0074]豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的制備:用轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法。將長(zhǎng)滿單層的PK15細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)，倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，將毒種液按0.1~0.2TCID50/個(gè)細(xì)胞的接種量接種于PK15細(xì)胞上，輕輕旋轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶2周，37°C吸附30min，加入細(xì)胞維持液，置37°C旋轉(zhuǎn)(10-?2轉(zhuǎn)/h)培養(yǎng)。每日觀察廣2次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，37°C培養(yǎng)4日收獲細(xì)胞和細(xì)胞液，凍融3次，置-20°C以下保存，應(yīng)不超過(guò)2個(gè)月。
[0075]豬胸膜肺炎放線桿菌(I型LC株、5型YC株和7型YS株)菌液的制備:將鑒定合格的豬胸膜肺炎放線桿菌I型LC株、5型YC株和7型YS株的二級(jí)種子菌液分別按1:1000(v/v)接種于TSB/NAD液體培養(yǎng)基，置37°C搖床180rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)至12~16h，收獲。
[0076]3.病毒液或菌液的處理
[0077]豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的處理:將病毒液用中空纖維濾柱(孔徑ΙΟμπι與0.45 μ m)過(guò)濾，除去細(xì)胞碎片。
[0078]豬胸膜肺炎放線桿菌(I型LC株、5型YC株和7型YS株)菌液的處理:將三種菌液分別以連續(xù)離心機(jī)(10000轉(zhuǎn)/min)離心后再以PBS (0.01mol/L, ρΗ7.2~7.4)復(fù)溶至原體積。
[0079]4.病毒液或菌液的滅活
[0080]豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的滅活:將檢驗(yàn)合格的步驟3處理的病毒液加入甲醛溶液滅活，使甲醛溶液的終濃度為0.2% (V/V)，隨即充分搖勻升溫，當(dāng)溫度升至37°C時(shí)開始計(jì)時(shí)，保持18h滅活完畢，加入0.2% (w/v)的焦亞硫酸鈉終止滅活，置2~8°C保存。
[0081]豬胸膜肺炎放線桿菌(I型LC株、5型YC株和7型YS株)菌液的滅活:將步驟3中三種不同血清型的菌液，按培養(yǎng)基體積比，緩慢加入終濃度為0.3% (v/v)的甲醛溶液，置37°C滅活，其間每隔4h攪拌一次，24h后取出，進(jìn)行滅活效果和純粹檢驗(yàn)。
[0082]5.含量測(cè)定
[0083](I)豬圓環(huán)病毒SH株病毒含量測(cè)定
[0084]將病毒液用MEM維持液做10倍系列稀釋，取10_5、10' 10^3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種96孔培養(yǎng)板PK15細(xì)胞單層4孔，每孔0.1ml,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，在37°C含5% CO2的溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，換含2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24h ；用冷丙酮固定細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)測(cè)定每個(gè)稀釋度含有PCV2陽(yáng)性細(xì)胞(呈綠色)的孔數(shù)，根據(jù)Karber氏法計(jì)算病毒TCID5(I。每ml病毒含量應(yīng)≥106_°TCID5(I。
[0085](2)豬胸膜肺炎放線桿菌I型LC株、5型YC株和7型YS株活菌數(shù)測(cè)定
[0086]將取樣按10倍系列稀釋至Kr5~10'接種于TSA/NAD固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h后，選擇菌落數(shù)在30和300之間的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，活菌數(shù)應(yīng)為3.0X IO9飛X 109CFU/ml。
[0087](3)抗原含量測(cè)定結(jié)果:
[0088]3批豬圓環(huán)病毒2型SH株、豬胸膜肺炎放線桿菌LC株、YC株和YS株分別培養(yǎng)三批，分別為K001，K002和K003?？乖暮恳姳?，PCV2SH病毒液含量均在106_°TCID5(l/ml以上。
[0089]表1抗原含量測(cè)定(滴度)
[0090]
【權(quán)利要求】
1.一種抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的二聯(lián)疫苗組合物，其包含至少一種豬圓環(huán)病毒2型抗原和至少一種豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聯(lián)疫苗組合物，其特征在于: 所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬圓環(huán)病毒2型抗原中的一種或幾種，并且，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原選自豬圓環(huán)病毒2型全病毒抗原,含有豬圓環(huán)病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它至少含有豬圓環(huán)病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成分中一種或幾種； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為豬胸膜肺炎放線桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬胸膜肺炎放線桿菌細(xì)菌，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合細(xì)菌，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成分中一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二聯(lián)疫苗組合物，其特征在于: 所述二聯(lián)疫苗組合物中每劑量或每頭份含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含量至少為105.5TCID50 ； 所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成分； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為滅活形式的全菌體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的二聯(lián)疫苗組合物，其特征在于: 所述二聯(lián)疫苗組合物中每劑量或每頭份含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含量為4.5 X IO5 0TCID50 ~106.ciTCID5tl ； 所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2 SH株、PCV2 LG株、PCV2 DBN-SX07-2的抗原組合物或疫苗組合物和/或PCV2亞單位抗原； 所述豬傳染性胸膜肺炎抗原為滅活的血清型為I型、5型和7型的混合抗原； 所述二聯(lián)疫苗組合物中豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型的含量至少為1.0X IO7CFU/頭份，血清5型的含量至少為1.0X IO7CFU/頭份，血清7型的含量至少為1.0X IO7CFU/頭份。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述二聯(lián)疫苗組合物中每劑量或每頭份含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含量為9 X IO50TCID50 ； 所述二聯(lián)疫苗組合物中豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型的含量為2.0 X IO7~5 X IO7CFU/頭份，血清5型的含量為2.0XlO7~5X IO7CFU/頭份，血清7型的含量為2.0XlO7~5 X IO7CFU/ 頭份； 所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2 SH株和/或PCV2 ORF2蛋白； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為滅活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌體； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株(Actinobacillus pIeuropneumoniaeserotypel strain LC)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011458 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清 5 型 YC 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5strain YC)的保藏編號(hào)為=CCTCC NO:M 2011459 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株(ActinobacillusP leuropneumoniae serotype7strain YS)的保藏編號(hào)為:CCTCCN0:M 2011460 ;上述菌株均保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述二聯(lián)疫苗組合物中豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的含量為0.5~20 μ g/頭份； 所述二聯(lián)疫苗組合物中豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型的含量為3.0 X IO7~5 X IO7CFU/頭份，血清5型的含量為3.0XlO7~5X IO7CFU/頭份，血清7型的含量為3.0XlO7~5X IO7CFU/ 頭份； 所述豬圓環(huán)病毒2型ORF2蛋白為序列表SEQ N0.1的DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQ N0.2的氨基酸序列的蛋白或與其同源性在75%以上的氨基酸序列的蛋白； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原包括分別與所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在80%以上的菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的二聯(lián)疫苗組合物，其特征在于: 所述二聯(lián)疫苗組合物中豬圓環(huán)病毒2型ORF2蛋白的含量為5~10 μ g/頭份； 所述二聯(lián)疫苗組合物中豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型的含量為5.0X IO7CFU/頭份，血清5型的含量為5.0X IO7CFU/頭份，血清7型的含量為5.0X IO7CFU/頭份； 所述豬圓環(huán)病毒2型ORF2蛋白為與序列表SEQ NOl.DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQN02.氨基酸序列的蛋白同源性在80%以上的氨基酸序列的蛋白； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原包括分別與所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在90%以上的菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的二聯(lián)疫苗組合物，其特征在于: 所述豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白為與序列表SEQ N01.DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQN02.氨基酸序列的蛋白同源性在90%以上的氨基酸序列的蛋白； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原包括分別與所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在95%~99%以上的菌株。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1~8中任意一項(xiàng)所述二聯(lián)疫苗組合物的制備方法，包括配苗步驟:將兩種以上的抗原混合后制得抗豬圓環(huán)病毒2型和豬傳染性胸膜肺炎感染的二聯(lián)疫苗組合物，其中，所述抗原包括豬圓環(huán)病毒2型抗原與豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~8中任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其特征在于:所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體的附加抗原。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK103656634SQ201210314958
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月30日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司